劉瑩，陳剛，丁波，劉慧香，胡文岳，高櫻，李啟艷

（1.山東省食品藥品檢驗(yàn)研究院，國家藥品監(jiān)督管理局化妝品原料質(zhì)量控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，特色植物資源化妝品濟(jì)南市工程研究中心，濟(jì)南 250101；2.煙臺(tái)市食品藥品檢驗(yàn)檢測中心，煙臺(tái) 264035）

祛斑美白類化妝品深受消費(fèi)者青睞，祛斑美白化妝品主要用于減輕皮膚表皮色素沉著，產(chǎn)品中往往含有能抑制黑色素的形成或加速其代謝等作用的功效成分如煙酰胺、熊果苷等[1?2]。煙酰胺和熊果苷是國內(nèi)外美白類化妝品常用原料。近幾年來我國審批的特殊用途美白祛斑類產(chǎn)品中，發(fā)現(xiàn)光果甘草根提取物是添加頻率最高的美白功效植物提取物[3]。光甘草定是光果甘草提取物中的主要活性成分，被譽(yù)為“美白黃金”，具有強(qiáng)抗氧化活性，作為美白劑，用于美白祛斑類化妝品中時(shí)，其質(zhì)量分?jǐn)?shù)一般為0.001%～0.1%[4]。市場上宣稱具有美白功效的產(chǎn)品質(zhì)量良莠不齊，甚至有些企業(yè)虛假宣傳誤導(dǎo)和欺騙消費(fèi)者[5?6]。2021年1月1日《化妝品監(jiān)督管理?xiàng)l例》正式實(shí)施，我國按照風(fēng)險(xiǎn)程度，將祛斑美白類化妝品列入特殊化妝品，對其實(shí)行注冊管理。2022年8月1日，中國食品藥品檢定研究所發(fā)布《祛斑類特殊化妝品技術(shù)指導(dǎo)原則(征求意見稿)》，明確企業(yè)生產(chǎn)此類產(chǎn)品的具體技術(shù)要求，應(yīng)兼顧美白劑的安全性和有效性，制定出合理的添加劑量。目前，《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》(2015 年版)已對防曬劑、染發(fā)劑、防腐劑等實(shí)行準(zhǔn)用清單管理，但對美白劑還未建立清單管理制度，化妝品行業(yè)亟待建立美白劑準(zhǔn)用清單，規(guī)范美白劑的安全使用范圍，降低美白劑的風(fēng)險(xiǎn)，因此有必要有對化妝品中美白成分的使用情況和檢測方法進(jìn)行研究。

目前，關(guān)于化妝品中美白成分的檢測方法有高效液相色譜法[7?12]、氣相色譜法[13?14]、高效液相色譜-質(zhì)譜法[15?16]等，其中，高效液相色譜法應(yīng)用最為廣泛，而且也是化妝品檢測最為常用的技術(shù)手段?！痘瘖y品安全技術(shù)規(guī)范》(2015 年版)僅規(guī)定化妝品中禁用原料氫醌、苯酚的檢測方法；國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 35954—2018《化妝品中10 種美白祛斑劑的測定高效液相色譜法》和文獻(xiàn)[4?9]雖然都建立了同時(shí)測定多種美白功效成分的液相色譜檢測方法，但是不同品牌的產(chǎn)品添加美白功效成分的含量差別較大，同時(shí)市場上使用的美白成分種類繁多，甚至有些產(chǎn)品不惜使用禁用組分如汞及其化合物、氫醌和苯酚等從而達(dá)到理想的祛斑美白效果，現(xiàn)有的檢測方法不能完全滿足監(jiān)管需求，難以保證此類產(chǎn)品的安全性與有效性。

筆者選取市售化妝品使用頻率高的美白成分以及禁用組分氫醌和苯酚為研究對象，建立了液相色譜法同時(shí)測定化妝品中光甘草定等10 種美白功效成分(包括2種禁用成分)的檢測方法，一方面了解產(chǎn)品是否如實(shí)添加了所宣稱的美白功效成分以及添加的水平情況，另一方面篩查是否有違規(guī)使用禁用原料的行為，從而為化妝品監(jiān)管部門打擊企業(yè)對于化妝品功效成分的虛假添加以及違規(guī)添加禁用原料的行為提供技術(shù)支持。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要的儀器與試劑

電子分析天平：MS105DU 型，感量為0.01 mg，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司。

高效液相色譜儀：Agilent1260 型，配二極管陣列檢測器，美國安捷倫科技有限公司。

超純水機(jī)：Milli-Q型，美國密理博公司。

離心機(jī)：Universal 320R型，德國Hettich公司；

數(shù)控超聲波清洗器：KQ-500DE型，昆山市超聲儀器有限公司。

甲醇：色譜純，德國默克公司。

磷酸：色譜純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

煙酰胺、熊果苷、氫醌、阿魏酸、苯酚：質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為99.9%、99.7%、99.8%、99.0%、100.0%，中國食品藥品檢定研究院。

3-O-乙基-L-抗壞血酸、苯乙基間苯二酚：質(zhì)量分?jǐn)?shù)均為98%，日本TCI公司。

丁基間苯二酚：質(zhì)量分?jǐn)?shù)為97%，美國Ark Pharm公司。

己基間苯二酚：質(zhì)量分?jǐn)?shù)為98%，北京J&K公司。

光甘草定：質(zhì)量分?jǐn)?shù)為98%，上海源葉生物科技有限公司。

化妝品樣品：均來自市售美白祛斑類產(chǎn)品。實(shí)驗(yàn)用水為超純水。

1.2 色譜條件

色譜柱：Agilent Eclipse plus C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；檢測器：二極管陣列檢測器；檢測波長：煙酰胺和熊果苷230 nm，3-O-乙基-L-抗壞血酸250 nm，其余280 nm；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣體積：10 μL；流動(dòng)相A：0.02%(體積分?jǐn)?shù))磷酸溶液，流動(dòng)相B：甲醇，流量為1.0 mL/min。梯度洗脫程序(體積分?jǐn)?shù))：0～3 min，95%A；3～13 min，95%A→30%A；13～21 min，30%A→5%A；21～26 min，5%A；26～26.1 min，5%A→95%A；26.1～35 min，95%A。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

煙酰胺、3-O-乙基-L-抗壞血酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液：質(zhì)量濃度均為1 mg/mL，分別準(zhǔn)確稱取煙酰胺、3-O-乙基-L-抗壞血酸各50 mg，分別置于50 mL 容量瓶中，用水溶解并定容。

熊果苷標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液：2 mg/mL，準(zhǔn)確稱取別熊果苷100 mg，置于50 mL 容量瓶中，用甲醇溶解并定容。

氫醌、苯酚、阿魏酸、丁基間苯二酚、苯乙基間苯二酚、己基間苯二酚、光甘草定標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液：質(zhì)量濃度均為1 mg/mL，分別準(zhǔn)確稱取氫醌、苯酚、阿魏酸、丁基間苯二酚、苯乙基間苯二酚、己基間苯二酚、光甘草定各50 mg，分別置于50 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容。

混合標(biāo)準(zhǔn)溶液：分別吸取以上標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液適量，用甲醇稀釋定容，于4 ℃冰箱保存。

系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液：精確吸取混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，用甲醇稀釋成系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。各成分的質(zhì)量濃度見表1。

表1 系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液中各組分的質(zhì)量濃度 μg/mL

1.4 實(shí)驗(yàn)步驟

1.4.1 樣品溶液制備

準(zhǔn)確稱取化妝品樣品0.2 g(精確到0.001 g)于10 mL 具塞試管中，用80%(體積分?jǐn)?shù)，下同)甲醇定容至標(biāo)線，超聲提取20 min，使樣品完全分散，于3 500 r/min 離心10 min，經(jīng)0.45 μm 濾膜過濾后備用。

1.4.2 測定方法

取系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液及樣品溶液，按1.2 色譜條件進(jìn)樣分析，記錄色譜峰面積，以混合標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，對應(yīng)色譜峰面積為縱坐標(biāo)建立標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，計(jì)算線性方程，利用標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算樣品中待測成分的含量。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件的優(yōu)化

2.1.1 檢測波長的選擇

分別采集各組分的紫外吸收光譜圖，發(fā)現(xiàn)煙酰胺和熊果苷的吸收峰在230 nm附近；3-O-乙基-L-抗壞血酸吸收峰在250 nm 附近；氫醌、苯酚、阿魏酸、丁基間苯二酚、苯乙基間苯二酚、光甘草定和己基間苯二酚的吸收峰在280 nm附近，因此分別選擇230、250、280 nm作為對應(yīng)組分的檢測波長。

2.1.2 流動(dòng)相的選擇

在文獻(xiàn)8和11基礎(chǔ)上比較了水-甲醇、磷酸二氫鉀-甲醇、磷酸溶液-甲醇為流動(dòng)相時(shí)的分離效果。結(jié)果表明，在水-甲醇和磷酸二氫鉀-甲醇兩種體系下阿魏酸和苯酚分離效果不理想，最終選擇磷酸溶液-甲醇作為流動(dòng)相。10 種成分混合標(biāo)準(zhǔn)溶液、空白基質(zhì)、加標(biāo)樣品的色譜圖如圖1～圖3所示。

圖1 10種成分的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖

圖2 空白基質(zhì)色譜圖

圖3 基質(zhì)加標(biāo)色譜圖

2.2 提取溶劑的選擇

分別考察了甲醇、80%甲醇溶液和50%甲醇溶液作為提取溶劑時(shí)各組分的回收率。結(jié)果表明，采用50%甲醇溶液作為提取溶劑時(shí)，光甘草定和己基間苯二酚回收率較低，均未達(dá)到50%，采用甲醇溶液和80%甲醇溶液作為提取溶劑時(shí)，各成分的回收率均在85%～115%之間，符合相關(guān)要求，最終從節(jié)約環(huán)保角度考慮，選擇80%甲醇溶液為提取溶劑。

2.3 線性范圍、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限

利用所建實(shí)驗(yàn)方法對系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行測定，以各組分的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，對應(yīng)色譜峰面積為縱坐標(biāo)，計(jì)算其線性回歸方程及相關(guān)系數(shù)，結(jié)果顯示，10 種目標(biāo)物在各自線性范圍內(nèi)，各待測物的質(zhì)量濃度與對應(yīng)色譜峰面積線性關(guān)系良好。10 種目標(biāo)物的線性回歸方程、線性范圍、相關(guān)系數(shù)、檢出限(信噪比為3)、定量限(信噪比為10)見表2。

表2 10種目標(biāo)物線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限

2.4 準(zhǔn)確度與精密度

準(zhǔn)確稱取面霜、乳液、水劑、粉底液、凝膠五種類型空白樣品，進(jìn)行低、中、高三個(gè)濃度水平加標(biāo)，每個(gè)加標(biāo)水平平行制備6份，然后按1.4.1 方法制備樣品溶液，分別測定并計(jì)算各目標(biāo)物回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差，結(jié)果列于表3。結(jié)果表明，10種目標(biāo)物的回收率為93.43%～112.7%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.05%～3.11%，滿足《化妝品中禁用物質(zhì)和限用物質(zhì)檢測方法驗(yàn)證技術(shù)規(guī)范》的相關(guān)要求。

表3 樣品加標(biāo)回收試驗(yàn)結(jié)果(n=6)

3 結(jié)語

建立了高效液相色譜法測定化妝品中10 種美白成分的檢測方法，并對其進(jìn)行了方法學(xué)驗(yàn)證。該方法樣品處理簡單、準(zhǔn)確度高，能較好地評估化妝品的安全性與有效性，為化妝品的質(zhì)量監(jiān)督管理和消費(fèi)者的健康權(quán)益提供技術(shù)保障。