袁松,張才煜,庾莉菊,陳華,張慶生

(中國食品藥品檢定研究院,國家藥品監(jiān)督管理局化學(xué)藥品質(zhì)量研究與評價重點(diǎn)實驗室,北京 102629)

基因毒性雜質(zhì)是指在很低的濃度下即可誘導(dǎo)基因突變并導(dǎo)致染色體的斷裂和重排的雜質(zhì),具有潛在的致癌性[1]。N-亞硝胺類化合物由于在細(xì)胞色素P450酶介導(dǎo)代謝活化后,生成不穩(wěn)定的α-羥甲基-N-亞硝胺,最終形成的高度親電物質(zhì)與DNA反應(yīng)形成烷基化的DNA堿基對,從而具有很強(qiáng)的致癌性[2-3],ICH M7(R1)指南[4]已將N-亞硝胺類化合物列入“關(guān)注隊列”。近年來多個品種的藥品中檢測出了N-亞硝胺類化合物,引起了各國藥品監(jiān)管機(jī)構(gòu)的廣泛關(guān)注,出臺了一系列N-亞硝胺雜質(zhì)的控制方案,并要求申請人評估存在N-亞硝胺雜質(zhì)的風(fēng)險[5-7]。

氫氯噻嗪(hydrochlorothiazide,HZCT)作為一種噻嗪類利尿藥,在臨床上廣泛應(yīng)用于治療水腫和高血壓,不論是單用還是與其他降壓藥聯(lián)用都療效明確,尤其適用于老年高血壓、單純收縮期高血壓或伴心力衰竭患者,也是難治性高血壓的基礎(chǔ)用藥之一[8]。氫氯噻嗪結(jié)構(gòu)(見圖1)中存在2個環(huán)狀仲胺結(jié)構(gòu),由于其存在弱堿性的芳香環(huán)-烷基氨基,在強(qiáng)酸性條件下,氫氯噻嗪極易亞硝基化生成N-亞硝基氫氯噻嗪(4-nitrosohydrochlorothiazide,NO-HZCT),其結(jié)構(gòu)見圖1,Gold等[9]的研究顯示HZCT的亞硝化只發(fā)生在芳香環(huán)-烷基氨基位點(diǎn),并且與亞硝酸具有一級反應(yīng)動力學(xué),在極其微量亞硝酸鹽的存在下,氫氯噻嗪有生成基因毒性雜質(zhì)NO-HZCT可能,因此急需開發(fā)一種靈敏度高且專屬性強(qiáng)的定量方法對相關(guān)制劑中可能存在的NO-HZCT進(jìn)行檢測,以保證藥品安全。

圖1 氫氯噻嗪與N-亞硝基氫氯噻嗪化學(xué)結(jié)構(gòu)

由于基因毒性雜質(zhì)對檢測靈敏度有著很高的要求,文獻(xiàn)中N-亞硝基雜質(zhì)的檢測方法以超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(UHPLC-MS/MS)[10-13]或氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(GC-MS/MS)[14-16]為主。目前,尚無NO-HZCT雜質(zhì)檢測方法的報道。本研究擬參考文獻(xiàn)方法合成NO-HZCT[9],并建立UHPLC-MS/MS方法以檢測依那普利氫氯噻嗪片和依那普利氫氯噻嗪分散片中NO-HZCT含量,為質(zhì)量控制提供參考。

1 材料

1.1 儀器Agilent 1290 Infinity II-6470QQQ液質(zhì)聯(lián)用儀(美國Agilent公司),配有電噴霧離子源(ESI)以及MassHunter數(shù)據(jù)處理系統(tǒng);Thermo Ultimate3000-Orbitrap120液相色譜-靜電場軌道肼質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國Thermo公司),配有電噴霧離子源(H-ESI);XP205DR電子天平(0.01 mg,瑞士Mettler Toledo公司);XPE26電子天平(0.001 mg,瑞士Mettler Toledo公司); VD53真空干燥箱(德國Binder公司)。

1.2 試藥與試劑乙腈(質(zhì)譜級、中國迪科馬科技有限公司);甲酸(質(zhì)譜級、德國Merck公司);甲酸銨(質(zhì)譜級,德國Merck公司);水為超純水;乙酸、高氯酸、亞硝酸鈉均為分析純,購于國藥集團(tuán)有限公司;氫氯噻嗪原料藥(批號:H181007-1,常州制藥廠有限公司);依那普利氫氯噻嗪分散片、依那普利氫氯噻嗪片(Ⅰ)、依那普利氫氯噻嗪片(Ⅱ)均為市場采購。

2 方法與結(jié)果

2.1 NO-HZCT的合成稱取氫氯噻嗪原料藥1.183 g,加入25%乙酸溶液80 mL,振搖使混勻,用高氯酸調(diào)節(jié)pH值為1.022,緩慢加入亞硝酸鈉0.654 g,邊加邊振搖,以800 r·min-1攪拌90 min,過濾,取沉淀60 ℃減壓干燥4 h,即得淡黃色粉末1.132 4 g,得率為95.7%。采用高分辨質(zhì)譜(見圖2A)和核磁(見圖2B、2C)對其結(jié)構(gòu)進(jìn)行了確證,并采用核磁定量測得含量為94.7%。

圖2 結(jié)構(gòu)確證-高分辨質(zhì)譜圖(A,H-ESI-)、核磁共振氫譜(B)和碳譜(C)

2.2 溶液制備

2.2.1 對照品溶液配制精密稱取NO-HZCT對照品10.70 mg,置100 mL量瓶中,加乙腈 溶解并稀釋至刻度,搖勻,作為對照品儲備液;精密量取對照品儲備液0.1 mL,置100 mL量瓶中,用乙腈稀釋至刻度,搖勻,作為100 ng·mL-1的溶液,精密量取1.0、1.0、2.0、5.0、10.0、10.0、10.0 mL,分別置200、100、100、100、100、50、20 mL量瓶中,用乙腈稀釋至刻度,搖勻,制成每1 mL中分別約含NO-HZCT 0.5、1、2、5、10、20、50 ng的對照品溶液,作為系列線性溶液。

2.2.2 供試品溶液制備取依那普利氫氯噻嗪片(Ⅰ)、依那普利氫氯噻嗪片(Ⅱ)或依那普利氫氯噻嗪分散片20片,精密稱定,研細(xì),精密稱取約相當(dāng)于氫氯噻嗪25 mg的細(xì)粉,置15 mL離心管中,精密加入乙腈5 mL,渦旋5 min,濾過,取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.3 色譜及質(zhì)譜條件

2.3.1 色譜條件采用Agilent Eclipse Plus C18RRHD(3.0 mm×150 mm,1.8 μm)色譜柱,以10 mmol·L-1甲酸銨-0.1%甲酸的水溶液作為流動相A,以0.1%甲酸的乙腈溶液作為流動相B,梯度洗脫:0.0→7.0 min,20% B～30% B;7.0→7.1 min,30% B～20% B;7.1→10.0 min,20% B。體積流量0.6 mL·min-1,柱溫40 ℃,進(jìn)樣盤溫度為5 ℃,進(jìn)樣體積5 μL。

2.3.2 質(zhì)譜條件采用電噴霧離子源(Electrospray Ionization Source,ESI),負(fù)離子掃描模式,干燥氣溫度300 ℃,干燥氣體積流量6 L·min-1,霧化氣壓力310.275 kPa,鞘氣溫度325 ℃,電離電壓500 V。采用多反應(yīng)監(jiān)測(multiple reaction monitor,MRM)模式,以m/z324.9→280.9作為定量離子對,碎裂電壓為70 V,碰撞能量為8 V,m/z324.9→293.9作為定性離子對,碎裂電壓為70 V,碰撞能量為28 V。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 專屬性試驗取乙腈、“2.2.1”項下5 ng·mL-1的對照品溶液和供試品溶液按“2.3”項下條件分別進(jìn)樣檢測,記錄色譜圖(見圖3),結(jié)果顯示,在所建立的色譜-質(zhì)譜條件下NO-HZCT的保留時間約為4.6 min,主成分依那普利氫氯噻嗪和乙腈對其檢測均沒有干擾。

圖3 乙腈(A)、對照品溶液(B)和供試品溶液(C)提取離子流色譜圖

2.4.2 檢測限與定量限取“2.2.1”項下0.5 ng·mL-1的對照品溶液,用乙腈逐級稀釋,直至NO-HZCT峰的信噪比(S/N)約為3時的質(zhì)量濃度作為檢測限(LOD),S/N約為10時作為定量限(LOQ),測得NO-HZCT的檢測限與定量限分別為0.08 ng·mL-1和0.27 ng·mL-1。

2.4.3 線性關(guān)系考察分別取“2.2.1”項下各質(zhì)量濃度的系列線性溶液,按 “2.3”項條件進(jìn)樣檢測,并記錄峰面積,以NO-HZCT質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X),峰面積為縱坐標(biāo)(Y)進(jìn)行線性回歸,得線性方程為Y=124.07X-1.16,相關(guān)系數(shù)(r)為0.999 8,結(jié)果表明NO-HZCT雜質(zhì)質(zhì)量濃度0.51～50.67 ng·mL-1范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.4.4 系統(tǒng)精密度取“2.2.1”項下1 ng·mL-1的對照品溶液,按 “2.3”項條件連續(xù)進(jìn)樣6次,記錄峰面積,計算得NO-HZCT峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為4.43%,結(jié)果表明系統(tǒng)精密度良好。

2.4.5 重復(fù)性取依那普利氫氯噻嗪片(Ⅰ),按“2.2.2”項下方法平行制備6份供試品溶液,照“2.3”項下色譜條件進(jìn)樣檢測,記錄峰面積,按外標(biāo)法計算6份供試品溶液中NO-HZCT含量的RSD為3.31%,表明方法具有良好的重復(fù)性。

2.4.6 加樣回收率試驗精密稱取依那普利氫氯噻嗪片(Ⅰ)細(xì)粉9份(約相當(dāng)于氫氯噻嗪 25 mg),置15 mL量瓶中,精密加入“2.2.1”項下制備的5、10、20 ng·mL-1的對照品溶液5 mL,照“2.2.2”項下方法制備溶液,低、中、高3個質(zhì)量濃度點(diǎn)的供試品各3份,按照“2.3”項下色譜條件進(jìn)樣檢測,結(jié)果見表1,低、中、高3個濃度點(diǎn)的回收率分別為 93.10%(RSD3.7%,n=3)、104.30%(RSD1.0%,n=3)和106.48%(RSD1.8%,n=3 ),結(jié)果表明方法回收率良好。

表1 加樣回收率結(jié)果

2.4.7 溶液穩(wěn)定性取“2.2.1”項下5 ng·mL-1的對照品溶液,放置于進(jìn)樣盤(5 ℃),樣品溶液檢測完畢后再次進(jìn)樣檢測,0 h和5 h時NO-HZCT峰面積的相對偏差為3.75%,結(jié)果表明在5 ℃條件下,對照品溶液5 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4.8 提取效率考察取依那普利氫氯噻嗪片(I),按“2.2.2”項下方法平行制備2份供試品溶液,分別渦旋5 min和10 min,照“2.3”項下色譜條件進(jìn)樣檢測,計算得兩份供試品溶液中NO-HZCT含量的相對偏差為2.07%,結(jié)果表明渦旋5 min即可提取完全,為提高實驗效率,將渦旋時間設(shè)定為5 min。

2.5 樣品測定取依那普利氫氯噻嗪片(Ⅰ)、依那普利氫氯噻嗪片(Ⅱ)或依那普利氫氯噻嗪分散片20片,精密稱定,研細(xì),精密稱取約相當(dāng)于氫氯噻嗪25 mg的細(xì)粉,置15 mL離心管中,精密加入乙腈5 mL,渦旋5 min,濾過,取續(xù)濾液作為供試品溶液。測得依那普利氫氯噻嗪分散片,依那普利氫氯噻嗪片(Ⅰ),依那普利氫氯噻嗪片(Ⅱ)中NO-HZCT均有檢出。

3 討論

本研究初期首先對樣品溶解/提取的溶劑進(jìn)行了考察,由于流動相為水-乙腈體系,且NO-HZCT在水中溶解性較差,為避免溶劑效應(yīng),選擇以乙腈溶解后用水稀釋至刻度,但在考察中發(fā)現(xiàn),稀釋劑中加入水-乙腈溶劑后(水-乙腈=80∶20),NO-HZCT極其不穩(wěn)定,并且其降解速率與水的pH值有關(guān)。以pH 7.0的磷酸鹽緩沖液-乙腈(80∶20)為稀釋劑時,在25 ℃條件下,NO-HZCT經(jīng)過30 min后降解約60%(按峰面積計),180 min時幾乎降解完全;以pH 2.0的磷酸鹽緩沖液-乙腈(80∶20)為稀釋劑時,在25 ℃條件下,NO-HZCT經(jīng)過30 min后降解約47%(按峰面積計),180 min時降解約80%,且其主要降解雜質(zhì)為氫氯噻嗪;以純乙腈作為稀釋劑時NO-HCZT在5 h內(nèi)穩(wěn)定,故本次試驗以乙腈作為稀釋劑對色譜-質(zhì)譜條件進(jìn)行優(yōu)化。后續(xù)將對NO-HZCT在水中的降解情況進(jìn)行進(jìn)一步的深入研究。

NO-HZCT為N-亞硝基類化合物,屬于ICH M7(R1)指南中“關(guān)注隊列”的遺傳毒性雜質(zhì),需對其限度進(jìn)行嚴(yán)格控制。目前尚沒有N-亞硝基氫氯噻嗪的毒理學(xué)數(shù)據(jù),暫無明確數(shù)據(jù),還需對其生理毒性進(jìn)行進(jìn)一步研究。檢測結(jié)果提示應(yīng)在生產(chǎn)和存儲過程中加強(qiáng)監(jiān)控,并進(jìn)行安全風(fēng)險評估,建立適當(dāng)?shù)目刂撇呗?保證藥品安全。

4 結(jié)論

本研究通過合成氫氯噻嗪中潛在基因毒性雜質(zhì)N-亞硝基氫氯噻嗪,首次建立了依那普利氫氯噻嗪復(fù)方制劑中N-亞硝基氫氯噻嗪的超高效液相-串聯(lián)質(zhì)譜的檢測方法,該方法靈敏度高、專屬性強(qiáng),可準(zhǔn)確地對依那普利氫氯噻嗪復(fù)方制劑中基因毒性雜質(zhì)N-亞硝基氫氯噻嗪進(jìn)行定量檢測,可為依那普利氫氯噻嗪制劑的質(zhì)量控制提供參考,保障藥品質(zhì)量安全。