莊肯,郭娜,廖文君,袁華,孫銅,吳春勇*

(1.中國藥科大學(xué)藥物分析系,江蘇 南京 211198;2.濟(jì)南市食品藥品檢驗(yàn)檢測中心,山東 濟(jì)南 250102;3.昆藥集團(tuán)股份有限公司,云南 昆明 650106;4.山東省食品藥品檢驗(yàn)研究院,山東 濟(jì)南 250101)

糖代謝主要包括糖的無氧氧化、有氧氧化、磷酸戊糖途徑、糖異生及糖原的合成與分解,是機(jī)體主要的供能途徑,也為脂質(zhì)、蛋白質(zhì)及核苷酸等生物大分子的合成提供原料。脂代謝是指人體攝入的脂肪經(jīng)脂肪酶水解為游離脂肪酸和甘油而進(jìn)入血液循環(huán)的過程,可為維生素、激素和細(xì)胞膜的合成提供原料,并參與機(jī)體內(nèi)多種信號調(diào)節(jié)。糖代謝和脂代謝的關(guān)系復(fù)雜,糖代謝的氧化過程和磷酸戊糖途徑為脂質(zhì)的合成提供能量及原料,而糖異生途徑則可利用脂代謝產(chǎn)物合成糖類,二者的動態(tài)平衡對于維持機(jī)體穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要(見圖1)[1]。

圖1 糖脂代謝總覽

隨著經(jīng)濟(jì)發(fā)展,糖尿病、超重和肥胖等糖脂代謝紊亂性疾病嚴(yán)重威脅公共衛(wèi)生安全[2]。由于發(fā)病機(jī)制復(fù)雜,相關(guān)藥物研發(fā)亟需合適的糖脂代謝模型。此外,腫瘤細(xì)胞在適宜環(huán)境下表現(xiàn)出的無限增殖特性,主要是通過糖酵解和氧化磷酸化(OXPHOS)過程的相互轉(zhuǎn)換實(shí)現(xiàn)的[3],因此糖脂代謝模型研究對于腫瘤治療也有重要意義。動物模型可從整體層面研究生理狀態(tài)和不同疾病狀態(tài)下糖脂代謝的變化及相關(guān)藥物的治療作用[4],但模型構(gòu)建難度大,存在種屬差異[5-6]。為此,各種體外研究模型應(yīng)運(yùn)而生。本文將對糖脂代謝體外研究常用的細(xì)胞及研究模型進(jìn)行綜述,為后續(xù)糖脂代謝體外研究模型的開發(fā)和改進(jìn)提供參考。

1 糖脂代謝體外研究常用細(xì)胞

1.1 肝細(xì)胞作為糖類和脂質(zhì)等內(nèi)源性物質(zhì)合成、代謝、儲存和再分配的主要器官,以及藥物等外源性物質(zhì)代謝的主要器官,肝臟是目前糖脂代謝機(jī)制研究及相關(guān)藥物篩選的主要研究器官。糖脂代謝體外研究常用的人肝細(xì)胞系主要有人原代肝細(xì)胞(primary human hepatocytes,PHH)、HepaRG細(xì)胞和HepG2細(xì)胞。PHH是肝臟體外代謝研究的金標(biāo)準(zhǔn),在3D培養(yǎng)條件下,其體外代謝能力與體內(nèi)條件相當(dāng),但獲取難度高、不易實(shí)現(xiàn)體外長期培養(yǎng)[7]。HepaRG細(xì)胞是衍生自PHH的終末分化細(xì)胞,具有與PHH相近的糖脂代謝和藥物代謝表達(dá)譜,但其獲取成本較高,體外3D長期培養(yǎng)條件較為復(fù)雜,通常需要額外添加L-谷氨酰胺和地塞米松等添加劑[8-9]。Samanez等[10]發(fā)現(xiàn)HepaRG細(xì)胞的糖酵解過程由葡萄糖濃度和胰島素水平共同調(diào)節(jié),而脂肪生成途徑僅由胰島素調(diào)節(jié),脂蛋白分泌主要受葡萄糖濃度影響。HepG2細(xì)胞獲取難度低,體外3D長期培養(yǎng)條件簡單,是體外糖脂代謝及藥物代謝研究使用最多的細(xì)胞系,但其體外代謝能力與PHH和HepaRG相比嚴(yán)重不足[11-12]。Boon等[13]發(fā)現(xiàn)細(xì)胞外的營養(yǎng)成分水平是細(xì)胞成熟度的主要決定因素,培養(yǎng)體系中加入超生理量的氨基酸可以提高HepG2細(xì)胞的葡萄糖敏感性,促進(jìn)其線粒體功能形成,增強(qiáng)其糖脂代謝和藥物代謝能力。

1.2 腫瘤細(xì)胞腫瘤細(xì)胞在適宜環(huán)境下的無限增殖需要高效的能量生成,這主要是通過糖酵解和氧化磷酸化(OXPHOS)過程的增強(qiáng)及相互轉(zhuǎn)換實(shí)現(xiàn)的,因此糖脂代謝研究對于癌癥治療有重要意義。Dai等[14]發(fā)現(xiàn)在人結(jié)直腸癌細(xì)胞系(HCT116和SW480等)和人結(jié)直腸癌臨床樣本中葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體3(GLUT3)具有高表達(dá)水平,在生理?xiàng)l件(5 mmol·L-1葡萄糖)下GLUT3可通過增加葡萄糖攝取和促進(jìn)核苷酸合成加速結(jié)直腸癌細(xì)胞生長,并增加結(jié)直腸癌細(xì)胞對維生素C的敏感性,可為臨床治療提供參考。Shen等[15]發(fā)現(xiàn)血小板型磷酸果糖激酶(PFKP)在人肺癌細(xì)胞系(H358和H827等)和人肺癌臨床樣本中高度表達(dá),該酶可通過抑制糖酵解途徑減少肺癌細(xì)胞的葡萄糖攝取,進(jìn)而抑制其增殖。

2 糖脂代謝體外2D模型

2D模型通常將細(xì)胞以單層形式進(jìn)行平面培養(yǎng),操作簡便、重復(fù)性好,但體內(nèi)相似性不足。Nagarajan等[16]發(fā)現(xiàn)在2D條件下,HepG2細(xì)胞的葡萄糖攝取量是人體生理?xiàng)l件下的14倍,但糖原含量和葡萄糖氧化率僅有50%左右,葡萄糖產(chǎn)生量僅為30%左右,且上述結(jié)果均不受胰島素刺激影響,表明2D條件下HepG2細(xì)胞的糖代謝行為與人體生理?xiàng)l件相差較大。同時,Wei等[17]發(fā)現(xiàn)在2D條件下,HepG2細(xì)胞的24 h葡萄糖消耗量為5 μmol/106個細(xì)胞,PHH為20 μmol/106個細(xì)胞,而人體生理?xiàng)l件下可達(dá)133.2 μmol/106個細(xì)胞。Vinci等[18]發(fā)現(xiàn)在2D條件下,HepG2細(xì)胞的甘油含量為0.28 mmol·L-1/106個細(xì)胞,僅為人體生理?xiàng)l件的1.4%(20 mmol·L-1/106個細(xì)胞)。

3 糖脂代謝體外3D模型

3D模型是將細(xì)胞在具有不同3D結(jié)構(gòu)的載體上或通過其他方式使其在3D立體空間中生長、遷移和分化的模型。相較于2D模型而言,3D模型中整個細(xì)胞表面都存在與其他細(xì)胞或基質(zhì)的相互作用,細(xì)胞生長形態(tài)更加接近體內(nèi),可更加真實(shí)地反映體內(nèi)情況[19]。目前應(yīng)用于糖脂代謝體外研究的3D模型主要有細(xì)胞球樣體和器官芯片。

3.1 細(xì)胞球樣體細(xì)胞球樣體主要是細(xì)胞經(jīng)懸滴培養(yǎng)、低黏附培養(yǎng)板培養(yǎng)、旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)或利用細(xì)胞支架培養(yǎng)而自組裝形成的細(xì)胞聚集體,可更真實(shí)地模擬體內(nèi)條件下的細(xì)胞-細(xì)胞、細(xì)胞-細(xì)胞外基質(zhì)相互作用(見圖2a[20])。Balkrishna等[21]通過懸滴培養(yǎng)法構(gòu)建了HepG2細(xì)胞球樣體非酒精性脂肪性肝炎(NASH)模型,該模型甘油含量可達(dá)16 mmol·L-1/106個細(xì)胞,與人體生理?xiàng)l件接近,且在糖尿病治療藥物吡格列酮的作用下,其甘油含量可降低至8 mmol·L-1/106個細(xì)胞,經(jīng)處方藥利沃沙(Livogrit)治療后,該模型的谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)和谷胱甘肽(GSH)明顯下調(diào)至正常生理水平,發(fā)現(xiàn)了利沃沙有作為肝保護(hù)劑的潛力。Rousset等[22]通過懸滴培養(yǎng)法構(gòu)建了人結(jié)直腸癌細(xì)胞(HCT116)球樣體,并結(jié)合電化學(xué)技術(shù)成功構(gòu)建了葡萄糖氧化酶生物傳感器(見圖3),通過葡萄糖氧化酶(GOx)功能化水凝膠氧化葡萄糖,產(chǎn)生H2O2,測定H2O2濃度以反映葡萄糖濃度,實(shí)現(xiàn)了對細(xì)胞球樣體的葡萄糖動力學(xué)研究,發(fā)現(xiàn)形成球樣體后葡萄糖消耗更加迅速、消耗量更多,并建立了體外-體內(nèi)外推(IVIVE)函數(shù)關(guān)系式,具有高度體內(nèi)相關(guān)性。Pingitore等[23]通過低黏附培養(yǎng)板構(gòu)建了由HepG2細(xì)胞和肝星狀細(xì)胞LX-2構(gòu)成的共培養(yǎng)細(xì)胞球樣體NASH模型,將其暴露于游離脂肪酸環(huán)境中染色后可通過顯微鏡觀察到脂肪和膠原蛋白的積累,其分布情況與體內(nèi)相似,且經(jīng)NASH治療藥物利拉魯肽治療后,脂肪變性程度減少了50%。Tidwell等[24]利用低黏附培養(yǎng)板構(gòu)建了人結(jié)直腸癌細(xì)胞(HCT116和SW948)球樣體,發(fā)現(xiàn)與2D條件相比,3D細(xì)胞球樣體的糖酵解作用更強(qiáng),ATP生成量更多。Kurano等[25]利用旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)法構(gòu)建了HepG2細(xì)胞球樣體,2D條件下HepG2細(xì)胞分泌的載脂蛋白(Apo)含量為5 ng·mg-1,而該模型的Apo分泌量可達(dá)27 ng·mg-1,更加接近人體生理?xiàng)l件下的40 ng·mg-1。Smith等[26]利用旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)法構(gòu)建了人結(jié)直腸癌上皮細(xì)胞(DLD1)球樣體,發(fā)現(xiàn)處于“靜止”狀態(tài)(即暫停增殖狀態(tài))的DLD1細(xì)胞代謝活性比增殖狀態(tài)更高,其葡萄糖和谷胱甘肽消耗量增加了2倍,乳酸分泌量增加了1.8倍,解釋了體內(nèi)條件下觀察到的“靜止”狀態(tài)的腫瘤細(xì)胞的高代謝活性和腫瘤組織內(nèi)部環(huán)境呈酸性的原因。Wei等[17]通過將半乳糖枝接在聚苯乙烯纖維上形成了一種全新的細(xì)胞支架,并以此構(gòu)建了HepG2細(xì)胞球樣體,與2D條件相比,細(xì)胞球樣體的24 h葡萄糖消耗量和糖原含量均提高了近2倍,糖異生率、總膽固醇含量和甘油三酯含量提高了近3倍,更加接近人體生理水平,且對于激素和降糖降脂藥物更加敏感,可用于藥物篩選。

a.細(xì)胞球樣體;b.器官芯片

a.電化學(xué)裝置示意圖;b、c.檢測原理圖(GOx:葡萄糖氧化酶)

3.2 器官芯片器官芯片又稱“生物反應(yīng)器”,是將細(xì)胞接種在主要以聚二甲基硅氧烷(PDMS)為材料的反應(yīng)室中,借助微流控技術(shù),通過機(jī)械作用將培養(yǎng)基以極低的流速持續(xù)灌注至反應(yīng)室中以實(shí)現(xiàn)液體循環(huán)流動的裝置,可以模擬細(xì)胞在體內(nèi)條件下受到的因液體流動而引起的機(jī)械作用(見圖2b[27])。Vinci等[28]構(gòu)建了一個多室器官芯片,發(fā)現(xiàn)HepG2細(xì)胞與脂肪細(xì)胞、人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)共培養(yǎng)后,24 h葡萄糖消耗量提高了近8倍,達(dá)到79.6 μmol/106個細(xì)胞,接近人體生理水平。Tao等[29]利用人誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞(hiPSCs)構(gòu)建了人肝臟-胰島類器官芯片,共培養(yǎng)體系使肝細(xì)胞糖脂代謝相關(guān)酶和CYP450酶的基因表達(dá)量顯著提高,24 h葡萄糖消耗量提高了1.1倍,達(dá)到85 μmol/106個細(xì)胞,與人體生理水平相近,同時在高糖條件(25 mmol·L-1葡萄糖)下,肝細(xì)胞表現(xiàn)出線粒體功能障礙和葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)能力降低,通過二甲雙胍治療得到顯著改善。Kemas等[30]利用器官芯片進(jìn)行了PHH的3D長期培養(yǎng),發(fā)現(xiàn)每個PHH細(xì)胞球樣體的細(xì)胞數(shù)在3 000個以下時,球樣體的葡萄糖消耗量與細(xì)胞數(shù)呈正比例關(guān)系,同時利用該球樣體構(gòu)建了胰島素抵抗(IR)模型,證明了肝臟特異性IR會導(dǎo)致脂肪生成和糖異生率增加,并揭示了IR是導(dǎo)致NASH的關(guān)鍵因素。Cipriano等[31]利用中空纖維式器官芯片對HepG2細(xì)胞進(jìn)行了3D培養(yǎng),與2D條件相比,3D條件下HepG2細(xì)胞的24 h葡萄糖消耗量提高了近5倍,達(dá)到66.7 μmol/106個細(xì)胞,同時CYP450酶和糖脂代謝相關(guān)酶的基因表達(dá)量也均有顯著提高,對于具有細(xì)胞毒性的雙氯芬酸也更加敏感,適合用于藥物篩選。

4 總結(jié)與展望

隨著糖尿病、超重和肥胖等糖脂代謝紊亂性疾病患病率逐年提高,糖脂代謝機(jī)制研究及相關(guān)藥物篩選的重要性不言而喻,對于具有高度體內(nèi)相似性的糖脂代謝體外模型的需求愈發(fā)迫切。體外3D模型可以模擬細(xì)胞-細(xì)胞、細(xì)胞-細(xì)胞外基質(zhì)的相互作用,相較于2D模型更加接近體內(nèi)環(huán)境,同時通過多種細(xì)胞共培養(yǎng),可進(jìn)一步提高3D模型的體內(nèi)相似性。但目前已構(gòu)建的體外3D模型的糖脂代謝能力與體內(nèi)條件相比仍有差距,模型構(gòu)建技術(shù)、細(xì)胞培養(yǎng)條件和共培養(yǎng)體系還需進(jìn)一步優(yōu)化,相信在未來會出現(xiàn)更多種類的體外模型,在糖脂代謝機(jī)制研究及相關(guān)藥物篩選中發(fā)揮更重要的作用。