汪洪濤，郭亞楠

（江蘇經(jīng)貿(mào)職業(yè)技術(shù)學(xué)院健康學(xué)院，江蘇省食品安全工程技術(shù)研究開發(fā)中心，江蘇 南京 211168）

羅漢果是我國特有的一種珍貴葫蘆科植物，被譽為良藥良果[1]。羅漢果花來自于羅漢果的干雄花，富含黃酮、多酚、精油等活性成分，有抗炎抑菌、降血糖、抗氧化、清熱解毒等功效[2]。目前，對羅漢果花的研究主要集中在其活性成分的提取和性質(zhì)研究[3]、提取液的生理功能研究方面[4]，對產(chǎn)品的開發(fā)應(yīng)用方面報道較少。

枸杞又稱枸杞果、枸杞豆、甜菜子等，是茄科植物，也作為藥食兩用的植物。枸杞味甘、性平，富含蛋白質(zhì)、脂肪、枸杞素、維B1、維B2和鈣、鐵、磷等營養(yǎng)成分，還富含類黃酮、枸杞多糖、甜菜堿、紅色素等有效成分[5]，具有補腎益精、潤肝明目、增強免疫力、抗疲勞、抗輻射、降血糖，降低動脈硬化等功效[6]。在世界上被公認(rèn)為抗衰老、抗腫瘤和疾病防治的“神仙果”[5]。目前，枸杞研究的較多，主要集中在活性成分的提取和產(chǎn)品的開發(fā)等方面[7-12]，但有關(guān)枸杞和羅漢果花搭配進(jìn)行產(chǎn)品的開發(fā)暫未見報道。

為了進(jìn)一步開發(fā)利用農(nóng)副產(chǎn)品資源，提高農(nóng)產(chǎn)品的附加值，豐富市場的健康飲料品種，擬通過將羅漢果花和枸杞搭配，利用兩者營養(yǎng)成分和活性成分互補的特點，通過酶促降解原料，提高活性成分的溶出率和原料的利用率，開發(fā)出一款富含多種活性成分、適合各種人群飲用的健康型飲料。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

KQ-500E 型超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司產(chǎn)品；FA1004N 型分析天平，上海民橋精密科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；FW100 型高速萬能粉碎機，天津市泰斯特儀器有限公司產(chǎn)品；GZX-9140MBE 型數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱，上海博迅實業(yè)有限公司產(chǎn)品；SHBIII 型循環(huán)水多用真空泵，上海比朗文儀器有限公司產(chǎn)品。

羅漢果花，購自廣西桂林，買回后挑選、清洗、于60 ℃下烘至恒質(zhì)量、粉碎過60 目篩后密封備用；枸杞（干果），購自寧夏中寧，經(jīng)人工挑選、清洗、于60 ℃下烘至恒質(zhì)量、粗粉碎后密封備用；食品級白砂糖，南京甘蔗園糖業(yè)有限公司提供；食品級纖維素酶（綠色木酶，1 萬U/g）、β - 葡聚糖酶（食用級，2 萬U/g）、檸檬酸，均為分析純，南京森貝伽生物科技有限公司提供；抗壞血酸（分析純），上海展云化工有限公司提供。

1.2 試驗方法

1.2.1 加工工藝

（1） 工藝流程。原料→浸泡→酶解→抽濾→調(diào)配→均質(zhì)→包裝→殺菌→成品。

（2） 操作要點。①酶解。將枸杞粉和羅漢果花粉按比例復(fù)配，按不同料液比、酶配比和酶解時間進(jìn)行浸提、抽濾，濾液定容后密封冷藏備用。②調(diào)配。根據(jù)最佳的酶解液加入最佳配方的檸檬酸、白砂糖、抗壞血酸攪拌均勻。③均質(zhì)。原料混合攪拌均勻，加熱至65 ℃。進(jìn)行均質(zhì)處理，均質(zhì)壓力20~25 MPa，均質(zhì)2 次。均質(zhì)后能提高飲料的穩(wěn)定性，防止分層，使產(chǎn)品口感細(xì)膩。④殺菌。產(chǎn)品裝罐后于121 ℃下殺菌10 min 后冷卻即得成品。

1.2.2 原料酶解液的制備

（1） 原料酶解液制備的基本工藝參數(shù)。先將干燥粉碎后的枸杞粉和羅漢果花粉按質(zhì)量比1∶1 稱取混合至250 mL 錐形瓶中，按照料液比1∶30（g∶mL） 加入一定量的蒸餾水，于室溫下避光浸泡12 h，使原料充分吸水。然后在50 ℃的恒溫、pH 值為5~6時（加鹽酸用精密pH 值試紙） 按照纖維素酶和β -葡聚糖酶1∶1 的質(zhì)量配比，加入一定量的酶（占原料質(zhì)量的0.5%），利用超聲輔助酶解2 h。最后將酶解液用濾紙進(jìn)行抽濾，濾液定容后密封冷藏備用，濾渣烘干至恒質(zhì)量后稱量，計算原料的利用率。每個樣品重復(fù)3 次，取平均值。原料利用率計算見公式（1）：

（2） 原料酶解液制備單因素試驗。按1.2.2（1）的方法，以原料的利用率為考查指標(biāo)，其他條件不變，分別改變枸杞和羅漢果花配比、料液比、纖維素酶和β - 葡聚糖酶配比及酶解時間等因素來考查各種因素對原料利用率的影響。

（3） 響應(yīng)面優(yōu)化試驗。在單因素試驗的基礎(chǔ)上，選擇原料比、料液比和酶配比作為試驗因素，利用響應(yīng)面軟件進(jìn)行試驗及優(yōu)化，確定羅漢果花枸杞復(fù)合飲料酶解液的最佳工藝。

Box-behnken 設(shè)計因素與水平設(shè)計見表1。

表1 Box-behnken 設(shè)計因素與水平設(shè)計

1.2.3 復(fù)合飲料的研制

（1） 飲料配方的基本工藝參數(shù)。量取一定量的酶解液，以酶解液質(zhì)量為標(biāo)準(zhǔn)，加入5%白砂糖，0.04%檸檬酸，0.05%抗壞血酸，按照飲料制備工藝流程操作得到羅漢果花枸杞復(fù)合飲料。

（2） 單因素試驗。按1.2.3（1） 的方法，以感官評價為評定指標(biāo)，其他條件不變，通過改變白砂糖、檸檬酸和抗壞血酸的含量，考查各種因素對飲料風(fēng)味的影響。

（3） 響應(yīng)面優(yōu)化試驗。在單因素試驗的基礎(chǔ)上，利用響應(yīng)面軟件進(jìn)行試驗及優(yōu)化，采用感官評分法進(jìn)行分析和處理，確定羅漢果花枸杞復(fù)合飲料的最佳配方。

響應(yīng)面試驗因素與水平設(shè)計見表2。

表2 響應(yīng)面試驗因素與水平設(shè)計/%

1.2.4 感官評分標(biāo)準(zhǔn)

參照相關(guān)茶飲料感官標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)合該產(chǎn)品的特點，指定了產(chǎn)品感官評分標(biāo)準(zhǔn)。請10 名不同年齡、性別的學(xué)生根據(jù)感官評分表進(jìn)行評分，每個樣品重復(fù)3次，最后取評分的平均值。

感官評分標(biāo)準(zhǔn)見表3。

表3 感官評分標(biāo)準(zhǔn)

1.2.5 數(shù)據(jù)分析與處理

試驗數(shù)據(jù)采用Excel 2010 軟件和Design Expert8.0 軟件進(jìn)行分析處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 原料酶解液的制備

2.1.1 原料酶解液制備單因素試驗

按照1.2.2 中（2） 的方法，其他條件不變，分別改變枸杞與羅漢果花質(zhì)量比為4∶1，3∶1，2∶1，1∶1，1∶2，1∶3，1∶4（g∶g），料液比為1∶15，1∶20，1∶25，1∶30，1∶35，1∶40，1∶45（g∶mL），纖維素酶和β - 葡聚糖酶的質(zhì)量比為4∶1，3∶1，2∶1，1∶1，1∶2，1∶3，1∶4（g∶g），酶解時間為0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0，3.5 h 進(jìn)行單因素試驗。

枸杞和羅漢果花的質(zhì)量比對原料利用率的影響見圖1，料液比對原料利用率的影響見圖2，纖維素酶和β - 葡聚糖酶質(zhì)量比對原料利用率的影響見圖3，酶解時間對原料利用率的影響圖4。

圖1 枸杞和羅漢果花的質(zhì)量比對原料利用率的影響

圖2 料液比對原料利用率的影響

圖3 纖維素酶和β - 葡聚糖酶質(zhì)量比對原料利用率的影響

圖4 酶解時間對原料利用率的影響

由圖1 可知，隨著羅漢果花比例的增加原料利用率在逐漸降低，原因可能是羅漢果花中纖維較多，水解率較低。在枸杞和羅漢果花的質(zhì)量比為2∶1~ 1∶2 原料的利用率降低的非常明顯。枸杞比例過高對產(chǎn)品的口感有影響且不利于渣液分離，綜合考慮后選取枸杞和羅漢果花的質(zhì)量比為2∶1、1∶1，1∶2為響應(yīng)面試驗的試驗因素水平；由圖2 可知，隨著料液比的增加原料利用率在逐漸提高，在1∶30 處提高最為明顯，隨著料液比的繼續(xù)增加，原料利用率增加變慢。綜合考慮后選取料液比為1∶30、1∶35，1∶40 為響應(yīng)面試驗的試驗因素水平；由圖3 可知，隨著β - 葡聚糖酶比例的增加，原料利用率先增加后減少，在1∶3 處最高，在1∶3 之后開始降低。故選取纖維素酶和β - 葡聚糖酶的質(zhì)量比為1∶2， 1∶3，1∶4 為響應(yīng)面試驗因素的水平；由圖4可知，隨著酶水解反應(yīng)時間的延長，原料利用率先增加后減少在2 h 時處最大，隨著時間不斷延長，原料利用率處于相對平穩(wěn)狀態(tài)，而且不利于試驗的操作，浪費時間。綜合考慮后，將2 h 作為后續(xù)試驗的酶解時間。

2.1.2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，按照1.2.2 中（3） 的方法，采用Box-behnken 試驗設(shè)計，對原料酶解液工藝進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗。

響應(yīng)面優(yōu)化試驗方案及結(jié)果見表4，原料利用率方差分析見表5。

表4 響應(yīng)面優(yōu)化試驗方案及結(jié)果

表5 原料利用率方差分析

通過軟件Design Expert 8.0 對表5 數(shù)據(jù)進(jìn)行了回歸分析，得出以原料酶解液的原料利用率為響應(yīng)值的回歸方程為：

一次項F值的大小與因素對響應(yīng)值的影響程度大小成正比[8]。由表4 可知，每個因素對原料利用率的影響程度順序為原料比>酶質(zhì)量比>料液比。模型F值為17.61，p<0.001 說明差異非常顯著，失擬項p=0.084 5>0.050 0 差異不顯著，模型的相關(guān)系數(shù)R2=0.952 0，表明模型擬合程度較好。變異系數(shù)（Coefficient of Variation，C.V） 2.45%較小，說明該模型能較好地反映真實的試驗值?；貧w模型中的一次項原料比（A） 非常顯著，交互項和二次項A2，C2不顯著，說明每個因素對原料利用率的影響不是線性關(guān)系[13]。

由響應(yīng)面軟件分析可知原料最佳酶解液工藝參數(shù)為原料比2∶1，料液比1∶34.73，酶質(zhì)量比1∶2.26。在此條件下，復(fù)合飲料酶解液的原料利用率為60.1%?？紤]到方便實際操作將最佳配方優(yōu)化為原料質(zhì)量比2∶1，料液比1∶35，酶質(zhì)量比1∶2.3，并根據(jù)優(yōu)化后的最佳工藝參數(shù)進(jìn)行了5 次平行驗證試驗，結(jié)果表明原料利用率平均為60.6%，與預(yù)測值相對偏差為0.83%，得到的最佳酶解液工藝參數(shù)可靠。

2.2 復(fù)合飲料配方的確定

2.2.1 單因素試驗結(jié)果

按1.2.3 中（2） 的方法，其他條件不變，分別改變白砂糖添加量為3%，4%，5%，6%，7%；檸檬酸添加量為0.010%，0.025%，0.040%，0.055%，0.060%；抗壞血酸添加量為0.01%，0.03%，0.05%，0.07%，0.09%進(jìn)行試驗。

白砂糖添加量對飲料感官指標(biāo)的影響見圖5，檸檬酸添加量對飲料感官指標(biāo)的影響見圖6，抗壞血酸添加量對飲料感官指標(biāo)的影響見圖7。

圖5 白砂糖添加量對飲料感官指標(biāo)的影響

圖6 檸檬酸添加量對飲料感官指標(biāo)的影響

圖7 抗壞血酸添加量對飲料感官指標(biāo)的影響

由圖5 可知，隨著白砂糖添加量增加飲料感官評分先增后降，在6%時感官評分最高。當(dāng)白砂糖添加量較低時，飲料的味道偏淡有少許苦味；白砂糖添加量過高時飲料味道太甜。因此，選取白砂糖添加量5%，6%，7%為響應(yīng)面試驗的因素水平。由圖6 可知，隨著檸檬酸添加量的增加，飲料的感官評分值也逐漸增大，在檸檬酸添加量為0.04% 時達(dá)到最大值。此時飲料酸甜適中，繼續(xù)增加檸檬酸添加量時，飲料則由于味道太酸導(dǎo)致評分值逐漸下降。因此，選取檸檬酸添加量0.025%，0.040%，0.055%為響應(yīng)面試驗的因素水平。由圖7 可知，隨著抗壞血酸添加量的增加，飲料的酸度逐漸增加，在抗壞血酸添加量為0.07%時達(dá)到最大值，此時飲料酸甜適中。繼續(xù)增加抗壞血酸量時飲料由于酸度過大而使評分值逐漸下降?？箟难岢峁┧嵛锻膺€是抗氧化劑，加入飲料中可保持其外觀和風(fēng)味。綜合考慮后，選取抗壞血酸添加量0.05%，0.07%，0.09%為響應(yīng)面試驗的因素水平。

2.2.2 飲料配方的響應(yīng)面優(yōu)化試驗

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，按照1.2.3（3） 的方法，采用Box-behnken 試驗設(shè)計，對飲料的配方進(jìn)行優(yōu)化。

響應(yīng)面優(yōu)化試驗方案及結(jié)果見表6。

表6 響應(yīng)面優(yōu)化試驗方案及結(jié)果

通過軟件Design Expert 8.0 對表6 數(shù)據(jù)進(jìn)行了回歸分析，得出以飲料感官評分為響應(yīng)值的回歸方程為：

飲料配方試驗方差分析見表7。

表7 飲料配方試驗方差分析

一次項F值的大小與因素對響應(yīng)值的影響程度大小成正比[8]。由表7 可知，每個因素對飲料感官評分的影響程度順序為抗壞血酸添加量>白砂糖添加量>檸檬酸添加量。模型F值為10.48，p=0.002 7<0.05 說明差異顯著，失擬項p=0.148 3>0.05 差異不顯著，模型的相關(guān)系數(shù)R2=0.928 3，表明模型擬合程度較好。變異系數(shù)（C.V） 2.78%較小，說明該模型能很好的反映真實的試驗值?；貧w模型中的一次項抗壞血酸（C） 顯著，交互項不顯著和二次項A2非常顯著、B2和C2顯著，說明每個因素對原料利用率的影響不是線性關(guān)系[13]。為進(jìn)一步考查各因素中交互作用對飲料感官評分的影響，用Design Expert 8.0.6軟件繪制三維曲線圖（圖8）。響應(yīng)曲面圖是每個試驗因素響應(yīng)值的三維空間曲線圖，表面的幅度越大，則表明對試驗結(jié)果的影響越大[14]。等高線圖的形狀可反映出各因素效應(yīng)強弱的大小，橢圓形這2 個因素之間的相互作用顯著，而圓形則相反[15]。3 個因素可在選定的范圍內(nèi)均能產(chǎn)生最好的響應(yīng)值，這表明3 個因素的試驗范圍合理有效，能夠最佳反映響應(yīng)值的影響趨勢。

圖8 因素交互作用對飲料感官評分的影響

因素交互作用對飲料感官評分的影響見圖8。

利用Design Expert 8.0.6 軟件分析得出羅漢果花枸杞復(fù)合飲料的最佳配方為白砂糖添加量5.9%，檸檬酸添加量0.04%，抗壞血酸添加量0.06%。在此最佳配方下復(fù)合飲料感官評分為89.4 分。為了檢驗響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果的可靠性進(jìn)行了5 次平行驗證試驗，得到飲料的感官評分平均值為90.1 分，與預(yù)測值有0.78%的相對偏差。結(jié)果表明，得到的復(fù)合飲料的最佳配方參數(shù)可靠。

3 結(jié)論

通過優(yōu)化原料酶解液的工藝參數(shù)，從而大大提高了原料利用率。對飲料的配方進(jìn)行優(yōu)化后所生產(chǎn)的復(fù)合飲料色澤紅亮透明，含有羅漢果花淡淡的清香和枸杞的醇香，口感酸甜可口，無沉淀析出。由于該飲料所使用原料羅漢果花和枸杞本身是一種可食用資源，再加上整個生產(chǎn)過程中僅使用水和食品級酶制劑，無任何化學(xué)試劑。其他輔助材料都是可食用級別，利用超聲波輔助酶法水解原料具有操作簡便、能耗低的特點。因此，該飲料的制作工藝簡單，具有原料的特有風(fēng)味，是一款營養(yǎng)豐富、口感純正的健康飲料，適合各類人群長期飲用。關(guān)于飲料中具體的活性成分和衛(wèi)生指標(biāo)有待于進(jìn)一步的試驗。