翟新羽 黃太萍 馮國榮 陳意 劉洋 靳晶豪 陳孝仁

摘要：色菌界的疫霉菌所引發(fā)的作物疫病是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上的毀滅性病害，嚴(yán)重威脅糧食安全和農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展。為探明殼寡糖是否可用于作物疫病的綠色防控，分析殼寡糖對辣椒疫霉的抑菌活性及作用機制。在殼寡糖終濃度為0、10、30、50、100、300、500 mg/L的PDA平板上接種辣椒疫霉、惡疫霉、瓜類疫霉、寄生疫霉和荔枝霜疫霉，測定菌絲生長情況；在殼寡糖終濃度為0、10、30、50、100 mg/L的10% V8培養(yǎng)液中培養(yǎng)辣椒疫霉菌絲，觀察菌絲形態(tài)變化；添加0、10、30、50、100 mg/L殼寡糖，觀察對辣椒疫霉游動孢子囊的產(chǎn)生，以及游動孢子釋放、游動和萌發(fā)的影響；對本氏煙噴施濃度為0、10、30、50、100、1 000 mg/L的殼寡糖后接種辣椒疫霉，觀察病害發(fā)生情況。結(jié)果表明，殼寡糖能直接抑制辣椒疫霉和其他4種卵菌（惡疫霉、瓜類疫霉、寄生疫霉和荔枝霜疫霉）的菌絲生長，但抑菌效果在種間存在差異，當(dāng)濃度為100 mg/L時對辣椒疫霉的生長抑制率達(dá)到了52.50%。自50 mg/L濃度起，殼寡糖對辣椒疫霉的菌絲形態(tài)，游動孢子囊形成，以及游動孢子的釋放、游動和萌發(fā)均有強烈的抑制作用，當(dāng)濃度升高時抑制效果更加顯著。經(jīng) 1 000 mg/L 殼寡糖噴施處理過的本氏煙葉片上產(chǎn)生的病斑面積明顯小于對照葉片，顯示殼寡糖可以保護本氏煙免遭辣椒疫霉的侵染。本研究綜合表明，殼寡糖可抑制辣椒疫霉的營養(yǎng)生長、生長發(fā)育和侵染致病，具有防控作物疫病的生防潛力。

關(guān)鍵詞：殼寡糖；辣椒疫霉；卵菌；本氏煙；生物防治；綠色防控

中圖分類號：S436.418.1+9 文獻標(biāo)志碼：A

文章編號：1002-S432.11302（2023）13-0106-06

基金項目：國家自然科學(xué)基金（編號：32272477、32102154、31871907）；江蘇省農(nóng)業(yè)科技自主創(chuàng)新資金［編號：CX（20）3125］；廣東省植物保護新技術(shù)重點實驗室開放基金（編號：植重2021-04）；江蘇省大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計劃（編號：202211117153Y）；揚州大學(xué)優(yōu)秀青年骨干教師培養(yǎng)對象項目；揚州大學(xué)高端人才支持計劃（拔尖人才成長計劃）。

作者簡介：翟新羽（1999―），女，江蘇淮安人，碩士研究生，從事植物真菌病害研究，E-mail：1643755033@qq.com；共同第一作者：黃太萍（2001―），女，陜西安康人，從事植物病害研究，E-mail：hhhhtp1029@163.com。

通信作者：陳孝仁，博士，教授，主要從事植物真菌病害研究。E-mail：xrchen@yzu.edu.cn。

色菌界（Chromista）的卵菌（Oomycetes）是一群重要的植物病原菌，嚴(yán)重危害農(nóng)業(yè)的安全生產(chǎn)［1］。其中，疫霉屬（Phytophthora spp.）含有100多種重要病原菌，例如引起馬鈴薯晚疫病的致病疫霉（P. infestans）和引起大豆根腐病的大豆疫霉（P. sojae）［2］；辣椒疫霉（P. capsici）侵染危害茄科、葫蘆科和豆類等上百種農(nóng)作物，每年給全世界蔬菜生產(chǎn)造成的損失高達(dá)10億美元［3］。目前，應(yīng)用最為廣泛而高效的卵菌病害防控方法是施用化學(xué)農(nóng)藥。但隨著化學(xué)農(nóng)藥的長期大量使用，病原菌抗藥性、農(nóng)藥殘留、環(huán)境污染等問題日益嚴(yán)重，不利于現(xiàn)代農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展和生態(tài)文明建設(shè)，亟需開發(fā)出新型產(chǎn)品供農(nóng)業(yè)生產(chǎn)選擇使用。

殼寡糖（chito-oligosaccharides）是降解殼聚糖得到的一類低聚糖，由2～10個氨基葡萄糖通過 β-1，4-糖苷鍵連接而成［4］。殼寡糖主要來源于真菌以及蝦、蟹、貝類等甲殼動物的殼［5］。由于其自然來源廣泛、可自然降解、水溶性好、易吸收，并且具有廣譜抗菌性且對人畜環(huán)境無毒等優(yōu)點，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上具有廣泛的研究和應(yīng)用價值［6］。Kendra等研究發(fā)現(xiàn)，濃度為4 mg/L、聚合度為7的殼寡糖能夠抑制豌豆根腐病病菌（Fusarium solani）在培養(yǎng)液中的生長發(fā)育［7］。徐俊光測定了多種物質(zhì)對病原真菌的抑菌活性，發(fā)現(xiàn)殼寡糖對幾種病原菌具有直接抑菌效果，其中對辣椒疫霉（P. capsici）的抑菌活性最高［8］。尹恒等研究發(fā)現(xiàn)，50 μg/g殼寡糖處理 1 d 后擬南芥抗煙草花葉病毒（TMV）侵染的能力顯著提高，植物表現(xiàn)出體內(nèi)TMV外殼蛋白含量明顯減少、抗性基因PR1上調(diào)表達(dá)以及水楊酸途徑被激活［9］。此外，還有大量研究表明，殼寡糖能夠提高小麥、油菜、大豆、黃瓜、番茄、煙草等多種作物的抗病能力［10-13］。

目前，國內(nèi)外研究者對殼寡糖的抑菌作用和誘導(dǎo)植物抗病性做了深入的研究。但由于殼寡糖的聚合度不一，關(guān)于其抑制疫霉等病原卵菌的作用機制也不明確。因此，筆者于2020年在揚州大學(xué)植病系作物疫病防控實驗室探究殼寡糖對辣椒疫霉（P. capsici）等幾種病原卵菌的抗菌活性和作用機制，并分析殼寡糖保護本氏煙免遭辣椒疫霉侵染的防治效果，以期為作物疫病綠色防控提供新的思路和方法。

1 材料與方法

1.1 供試藥劑

殼寡糖［分子式為（C12H24N2O9）n，分子量≤2 000］購自上海麥克林生化科技有限公司（貨號C875644），利用無菌水將其配制成50 mg/mL的母液。

97%甲霜靈原藥由江蘇寶靈化工股份有限公司提供。先用少量丙酮溶解甲霜靈，后加入0.1%吐溫-80水溶液配成5 mg/mL的母液。

1.2 供試菌株

本研究中使用到的菌株及其來源見表1。菌株均接種在10% V8固體平板上，置于25 ℃電熱恒溫箱中黑暗培養(yǎng)5～8 d。

1.3 供試植物

本氏煙（Nicotiana benthamiana）移栽于含有無菌土的塑料缽中，置于22～25 ℃、16 h/8 h光暗交替溫室培養(yǎng)，生長4～6周后使用。

1.4 培養(yǎng)基

1.4.1 PDA培養(yǎng)基

將馬鈴薯去皮切成薄片，稱取200 g；加入1 000 mL去離子水，煮沸；用紗布過濾掉馬鈴薯渣塊，濾液中加入20 g葡萄糖和18 g瓊脂，再加去離子水定容至1 000 mL，混勻后分裝到錐形瓶中；用高壓蒸汽滅菌（121 ℃、20 min，下同）后待用。

1.4.2 10% V8培養(yǎng)基

量取100 mL的V8汁（美國Campbell Soup Company），加入0.2 g CaCO3、16 g瓊脂（液體培養(yǎng)基不加瓊脂），加去離子水定容至 1 000 mL，用高壓蒸汽滅菌后待用。

1.5 抑菌測定

以下各項測定中每個處理均設(shè)3組重復(fù)，試驗重復(fù)2次。用SPSS軟件分析處理間差異顯著性。

1.5.1 菌絲生長測定

將殼寡糖加入到已融化并冷卻至50 ℃左右的PDA培養(yǎng)基中，充分混勻后倒入培養(yǎng)皿（直徑為90 mm）中，每皿定量15 mL，形成殼寡糖終濃度分別為0（陰性對照）、10、30、50、100 mg/L 。以添加甲霜靈（濃度為5 mg/L）的培養(yǎng)平板為陽性對照。用直徑為5 mm的打孔器在新鮮培養(yǎng)的辣椒疫霉菌落邊緣打取菌絲塊，用接種針將菌絲塊接種到平板中間（菌絲面向下），用封口膜封好后倒置于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。6 d后拍照，用十字交叉法測量菌落直徑，計算菌落生長抑制率：

菌落生長抑制率=陰性對照菌落直徑-處理菌落直徑陰性對照菌落直徑×100%。

同法，測量殼寡糖對惡疫霉、瓜類疫霉、寄生疫霉以及荔枝霜疫霉菌絲生長的抑制作用，其終濃度為30、100、300、500 mg/L。

1.5.2 生長發(fā)育測定

1.5.2.1 菌絲形態(tài)

將5塊菌絲塊移入培養(yǎng)皿中，倒入15 mL 10% V8培養(yǎng)液，同時加入殼寡糖母液使其終濃度分別為10、30、50、100 mg/L，以不加殼寡糖的培養(yǎng)皿為陰性對照，而加入甲霜靈（濃度為 5 mg/L）的培養(yǎng)皿作為陽性對照。培養(yǎng)皿置于 25 ℃ 黑暗培養(yǎng)3 d，等待菌絲叢形成。取少量菌絲制成玻片，在BX53顯微鏡（日本奧林巴斯公司）下觀察菌絲的形態(tài)。

1.5.2.2 游動孢子囊的形成

將5塊菌絲塊移入培養(yǎng)皿中，倒入15 mL 10% V8培養(yǎng)液，置于 25 ℃ 黑暗培養(yǎng)3 d。棄去培養(yǎng)液，加入15 mL滅菌水重新浸沒菌絲叢，繼續(xù)培養(yǎng)，之后每隔12 h換1次水，共換3次。每次換滅菌水時加入殼寡糖母液，使其終濃度分別為10、30、50、100 mg/L。以不加殼寡糖為對照。在顯微鏡下觀察比較含與不含殼寡糖條件下游動孢子囊形成的差異，并計數(shù)顯微鏡同一個視野下游動孢子囊的數(shù)量。

1.5.2.3 游動孢子的釋放

按照“1.5.2.2”節(jié)中的方法培養(yǎng)形成菌絲叢，換水時不加殼寡糖，誘導(dǎo)菌絲叢形成游動孢子囊。往培養(yǎng)皿中加入殼寡糖母液，使之終濃度分別為10、30、50、100 mg/L，以不加殼寡糖為陰性對照。處理1～2 h后，置于4 ℃冰箱10～15 min、25 ℃恒溫箱10～30 min，冷熱刺激游動孢子囊釋放游動孢子。在顯微鏡下觀察游動孢子的釋放，計數(shù)同一個視野下的游動孢子囊釋放率和游動孢子濃度。

1.5.2.4 游動孢子的游動

按照“1.5.2.3”節(jié)中方法獲得辣椒疫霉的游動孢子懸浮液，此過程均不加殼寡糖。往游動孢子懸浮液中加入殼寡糖，使之分別形成10、30、50、100 mg/L的終濃度，立即在顯微鏡下觀察游動孢子的運動狀態(tài)并將其錄制下來。

1.5.2.5 游動孢子的萌發(fā)

按照“1.5.2.3”節(jié)中方法獲得辣椒疫霉的游動孢子懸浮液，整個過程均不加殼寡糖。吸取2 mL懸浮液，置入15 mL離心管中，在渦旋振蕩器上振蕩使游動孢子的鞭毛脫落成為休止孢。依“1.5.2.4”節(jié)中方法加入殼寡糖（終濃度分別為10、30、50、100 mg/L），置于25 ℃孵育。1～2 h 后，在BX53顯微鏡下觀察游動孢子的萌發(fā)情況，利用軟件CellSens Dimension測量芽管的長度。

1.6 殼寡糖噴施試驗

1.6.1 噴施處理

配制10、30、50、100、1 000 mg/L的殼寡糖溶液，并在溶液中加入5‰的吐溫-20。利用噴壺對培養(yǎng)4～6周的本氏煙進行整株噴霧處理（每株噴施5 mL殼寡糖溶液），對照植株噴施等量無菌水。24 h后再次噴霧處理1次。

1.6.2 本氏煙接種

按照前法，獲得辣椒疫霉的游動孢子懸浮液，整個過程均不加殼寡糖；渦旋振蕩獲得休止孢，利用血球計數(shù)板計數(shù)孢子數(shù)量，計算出游動孢子的濃度（1×105孢子/mL）。

將游動孢子懸浮液接種在殼寡糖處理24 h后的離體本氏煙葉片，主葉脈兩側(cè)分別接種20 μL，葉片置于25 ℃孵育。接種后36～72 h持續(xù)觀察本氏煙的病斑擴展情況，在B-100AP手持式紫外燈（美國UVP公司）下拍照，并用臺盼藍(lán)對葉片進行染色。試驗共6個處理，每個處理設(shè)12組重復(fù)，試驗重復(fù)3次。

1.6.3 臺盼藍(lán)染色

稱取0.015 g臺盼藍(lán)置于燒杯中，依次加入10 mL乳酸、10 mL苯酚、10 mL甘油、10 mL無菌水、40 mL乙醇，將燒杯放入沸水中孵育10～15 min使臺盼藍(lán)充分溶解，制備染色液。室溫靜置6～8 h后，把本氏煙葉片放入染色液中染色6～8 h。用2.5 g/mL三氯乙醛水合物脫色葉片 2～3次，然后進行觀察并拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1 殼寡糖抑制辣椒疫霉和其他卵菌的營養(yǎng)生長

為測定殼寡糖對辣椒疫霉菌絲生長的影響，將后者接種到含10、30、50、100 mg/L殼寡糖濃度梯度的PDA平板上，計算殼寡糖對菌落生長的抑制率。結(jié)果（圖1、表2）表明，殼寡糖對辣椒疫霉菌絲生長有直接抑制作用，并且抑菌活性與其濃度呈正相關(guān)。當(dāng)殼寡糖濃度為10 mg/L時，辣椒疫霉的菌落直徑與對照相比差異并不明顯，菌落生長抑制率僅為4.99%；當(dāng)殼寡糖濃度達(dá)到30 mg/L時菌落直徑明顯小于對照，菌落生長抑制率上升了2.5倍；濃度升高殼寡糖的抑制作用進一步加強，當(dāng)濃度為 100 mg/L 時抑制率達(dá)到了52.50%。在測試濃度范圍內(nèi)，殼寡糖的抑制作用弱于甲霜靈。

鑒于殼寡糖對辣椒疫霉生長的抑制作用，本研究同時將惡疫霉、瓜類疫霉、寄生疫霉和荔枝霜疫霉接種到含殼寡糖（濃度梯度為30、100、300、500 mg/L）的PDA平板上，并計算它對菌落生長的抑制率。結(jié)果（圖2、表2）表明，荔枝霜疫霉對殼寡糖的敏感性最高，殼寡糖濃度為100 mg/L時抑制率達(dá)到了63.79%；殼寡糖對惡疫霉、瓜類疫霉、寄生疫霉也有較好的抑菌活性，在接種后7 d時 500 mg/L 的抑制率分別達(dá)到29.33%、34.29%、52.85%。上述結(jié)果說明，殼寡糖能夠抑制疫霉菌和荔枝霜疫霉的生長，但抑菌效果在種間存在差異。

2.2 殼寡糖影響辣椒疫霉的生長發(fā)育

2.2.1 影響菌絲的形態(tài)

為分析殼寡糖對辣椒疫霉菌絲生長的影響，將其添加到菌絲培養(yǎng)液中，結(jié)果表明殼寡糖處理后導(dǎo)致辣椒疫霉菌絲形態(tài)發(fā)生了明顯的變化：對照菌絲正常舒展，形態(tài)規(guī)則；殼寡糖處理過的菌絲分枝變多，形態(tài)出現(xiàn)扭曲、膨脹等畸變 類似甲霜靈處理過的菌絲形態(tài)。10、30 mg/的殼寡糖處理時菌絲形態(tài)變化不明顯，當(dāng)殼寡糖濃度為50 mg/L時菌絲形態(tài)變化明顯，濃度高達(dá) 100 mg/L 時則加劇了菌絲畸變（圖3）。

2.2.2 影響游動孢子囊的形成

本研究發(fā)現(xiàn)，不同濃度的殼寡糖處理會影響辣椒疫霉游動孢子囊的形成。由圖4可知，在較低濃度的殼寡糖（10、30 mg/L）處理時，辣椒疫霉游動孢子囊的數(shù)量與對照相比，出現(xiàn)明顯減少；當(dāng)殼寡糖濃度為50 mg/L時，游動孢子囊數(shù)量顯著下降；殼寡糖濃度到達(dá) 100 mg/L 時，菌絲上只形成很少的游動孢子囊，殼寡糖幾乎完全抑制了游動孢子囊的產(chǎn)生。統(tǒng)計分析不同殼寡糖濃度下游動孢子囊的數(shù)量，結(jié)果表明處理間存在顯著差異（圖5）。

2.2.3 影響游動孢子的釋放

本研究發(fā)現(xiàn)，殼寡糖處理能抑制辣椒疫霉游動孢子的釋放。由圖6、圖7-A 可知，在空白對照中，80%左右的游動孢子囊已經(jīng)放空，當(dāng)殼寡糖添加后，游動孢子囊的釋放逐漸受到影響。當(dāng)殼寡糖的濃度為10 mg/L時，游動孢子囊的釋放率與空白對照相比差異不顯著；當(dāng)殼寡糖濃度升高到 50 mg/L 時，游動孢子的釋放受到明顯的抑制；濃度為100 mg/L時游動孢子囊的釋放抑制率達(dá)到了90%。測定游動孢子的濃度，統(tǒng)計分析結(jié)果（圖7-B）也進一步佐證了這個結(jié)論。

2.2.4 影響游動孢子的游動

本研究發(fā)現(xiàn)，10、30、50、100 mg/L殼寡糖對辣椒疫霉游動孢子的游動均有強烈的抑制作用。在顯微鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)無殼寡糖時，游動孢子的游動行為正常；當(dāng)添加了殼寡糖后大多數(shù)游動孢子迅速休止，在低濃度（10 mg/L）時就有明顯的休止現(xiàn)象（相關(guān)錄像可與通訊作者聯(lián)系索?。?。

2.2.5 影響游動孢子的萌發(fā)

本研究發(fā)現(xiàn)，殼寡糖可抑制辣椒疫霉游動孢子的萌發(fā)并可導(dǎo)致孢子破裂（圖8）。在顯微鏡下觀察 發(fā)現(xiàn)在不含殼寡糖的對照中，大部分孢子正常萌發(fā)；在殼寡糖處理后，約30%的孢子沒有萌發(fā)，35%的孢子萌發(fā)但芽管整體短于對照，還有35%的孢子發(fā)生了裂解并釋放出內(nèi)含物，并且隨著時間的延長，裂解的孢子數(shù)量不斷增加；隨著殼寡糖濃度的增加，孢子裂解情況逐漸加重，當(dāng)殼寡糖濃度為100 mg/L時，孢子全部裂解。

2.3 殼寡糖保護本氏煙免遭辣椒疫霉的侵染

鑒于殼寡糖對辣椒疫霉具有直接的抑制作用，本研究分析殼寡糖是否可以用于植物疫病的防控。用不同濃度的殼寡糖噴施本氏煙植株，再接種辣椒疫霉游動孢子懸浮液。結(jié)果（圖9）表明，經(jīng) 1 000 mg/L 殼寡糖噴施處理過的本氏煙葉片上產(chǎn)生的病斑面積明顯小于對照葉片，顯示殼寡糖可以保護本氏煙免遭辣椒疫霉的侵染。但用10、30、50、100 mg/L濃度的殼寡糖處理本氏煙，發(fā)現(xiàn)葉片病斑面積與對照無顯著差異，這表明殼寡糖對本氏煙的保護效果可能依賴于逐漸增高的濃度。

3 討論

殼寡糖具有無毒害、不污染環(huán)境，兼有藥效和肥效的雙重生物調(diào)節(jié)功能特點，備受研究者關(guān)注，也在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上得到了一定的應(yīng)用［14］。研究表明，殼寡糖具有直接抑菌和誘導(dǎo)植物抗病性的雙重作用［6，15］。然而，殼寡糖抑菌抗病的機制尚不十分清楚，尤其是對作物病原卵菌的抑制效果和機制尚不明確。

本研究利用不同濃度的殼寡糖處理5種常見卵菌，結(jié)果表明殼寡糖能直接抑制辣椒疫霉、惡疫霉、瓜類疫霉、寄生疫霉和荔枝霜疫霉的菌絲生長。為進一步探究殼寡糖對卵菌的抑菌機制，以辣椒疫霉為例，本研究探討了殼寡糖對其不同生長發(fā)育階段的影響。結(jié)果表明，殼寡糖對辣椒疫霉的菌絲形態(tài)，游動孢子囊的形成與釋放，游動孢子的游動和萌發(fā)均有顯著的影響和抑制作用；當(dāng)殼寡糖濃度為 50 mg/L 時，抑制效果就較為顯著，并且抑制作用與其濃度呈正相關(guān)；而且，殼寡糖還可以保護植物免遭辣椒疫霉的侵染。類似地，雷菲等發(fā)現(xiàn)，葉面噴施殼寡糖可防控櫻桃番茄晚疫病的發(fā)生［16］。結(jié)果表明，殼寡糖對作物疫病的防控方式之一是通過直接抑制病原菌的生長發(fā)育發(fā)揮作用。

本研究發(fā)現(xiàn)，噴施低于1 000 mg/L的殼寡糖未能有效保護本氏煙免遭辣椒疫霉的侵染。這說明殼寡糖發(fā)揮抑菌作用需要高濃度，也可能是低濃度殼寡糖未能有效誘導(dǎo)植物產(chǎn)生抗病性。實際上殼寡糖在應(yīng)用中還存在較多的局限性，比如提純成本高、誘抗效果不穩(wěn)定以及誘導(dǎo)抗性具有遲滯性、抗病強度有限，針對不同植物、不同病原菌的最佳處理濃度、抗性持續(xù)時間也可能不一樣等［17］。此外，多個因素也影響著殼寡糖的防治效果，包括殼寡糖的純度、分子量、脫乙酰度等［8］。

殼寡糖具有來源廣、抗病譜廣、對環(huán)境無污染等優(yōu)點，在作物病害防控方面具有廣闊的應(yīng)用前景［4，14，17］。如果能夠解決實踐中存在的上述問題，將有助于殼寡糖用于作物卵菌病害的綠色防控。

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