姚鵬程 關(guān)永林 馬斌祥 李振豪 張洋 鄧夢 常斌 張思源

1.甘肅中醫(yī)藥大學,甘肅 蘭州 730000

2.甘肅省中醫(yī)院,甘肅 蘭州 730050

骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis,OP)是一種以體內(nèi)骨代謝平衡失調(diào)導致成骨細胞減少、破骨細胞增加而形成的一種骨小梁退化、骨結(jié)構(gòu)脆性增加,易引發(fā)全身性骨折的中老年人常見疾病。骨質(zhì)疏松的發(fā)生多由基因及生活環(huán)境、生活方式的影響,導致成骨細胞(osteoblast,OB)、破骨細胞(osteoclast,OC)活化和凋亡受到影響使骨骼重塑失調(diào),造成骨穩(wěn)態(tài)失衡[1]。全基因組關(guān)聯(lián)研究(genome wide association studies,GWAS)研究發(fā)現(xiàn)骨質(zhì)疏松及骨質(zhì)疏松性骨折(osteoporotic fracture,OPF)的發(fā)病機制與DNA甲基化改變關(guān)系密切[2]。中醫(yī)遵循人與自然相統(tǒng)一的觀念,重視外部環(huán)境對人體的影響,通過藥物調(diào)理使機體陰陽平衡,與表觀遺傳學關(guān)注的重點相似。中醫(yī)認為骨質(zhì)疏松屬于“骨萎”的范疇,經(jīng)臨床實踐及基礎(chǔ)研究證實補益肝腎類中藥治療OP療效顯著[3]。筆者通過整理近期相關(guān)文獻進行綜述。

1 DNA甲基化介紹

DNA甲基化(DNA methylation)是目前研究最深入的表觀遺傳調(diào)控機制,作為一種對穩(wěn)定的修飾狀態(tài),在特定DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的催化下,基因組CpG二核苷酸的胞嘧啶5號碳位通過共價鍵結(jié)合化學修飾獲得甲基基團[4-5]。外環(huán)境對機體刺激,引起DNA甲基化修飾分子細胞調(diào)控基因表達,隨DNA的復制遺傳給子代[6],人體基因啟動子區(qū)多數(shù)存在于富含雙核苷酸“CG”周邊區(qū)域,稱其為“CPG島”;CPG島在染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的組成及基因調(diào)控表達方面起著關(guān)鍵作用,DNA甲基化主要在CPG島啟動子區(qū)完成[7-8]。通過基礎(chǔ)研究及實驗發(fā)現(xiàn)[9]DNA甲基化異?？梢l(fā)多種疾病,尤其是CPG島啟動子區(qū)的DNA甲基化,DNA的穩(wěn)定性、不同染色質(zhì)的構(gòu)形改變調(diào)控基因的表達。目前,研究DNA甲基化對不同疾病的影響已成為全球生命科學探索的焦點,被稱為研究后基因時代的引領(lǐng)者。

2 DNA甲基化在骨質(zhì)疏松發(fā)生發(fā)展中的作用

DNA甲基化在研究OB和OC兩方面,OB與OC代謝失調(diào)導致骨量減少,骨脆性增加、逐漸加重骨質(zhì)疏松的發(fā)病進程。Delgado[10]在全基因組骨組織中分析骨質(zhì)疏松和骨關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis,OA)的甲基化區(qū)域差異,對23 367個CPG位點中13 463個基因進行甲基化分析,發(fā)現(xiàn)甲基化與基因表達在全基因組范圍內(nèi)呈負相關(guān)關(guān)系。DNA甲基化參與調(diào)節(jié)骨相關(guān)細胞的基因表達,如雌激素受體α(estrogen receptor alpha,EAα)、堿性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)、骨保護素(osteoprotegerin,OPG)、核因子kB受體活化因子配體(receptor activator of NF-Kb ligand,RANKL)等[11]。OPG、RNAKL兩細胞在調(diào)節(jié)骨吸收起到關(guān)鍵作用[12]。DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNA methyltransferase,DNMT)由DNMT3A和DNMT3B組成介導DNA甲基化抑制基因轉(zhuǎn)錄[13]。Nishikawa等[14]研究DNMT3A在骨穩(wěn)態(tài)中占有重要地位、通過DNMT3A缺陷的OC前體細胞不能有效分化為OC,發(fā)現(xiàn)DNMT3A介導SAM介導的DNA甲基化通過表觀遺傳抑制OC生成基因來調(diào)節(jié)OC生成。Liu等[15]在研究胸苷磷酸化酶(thymidine phosphorylase,TP)對骨髓瘤骨吸收和骨形成的影響,發(fā)現(xiàn)在OB祖細胞中,TP上調(diào)RUNX2和osterix的甲基化,導致骨形成減少;在OC祖細胞中,TP上調(diào)IRF8甲基化,進而上調(diào)NFATc1(活化T細胞核因子,包漿1蛋白)表達,導致骨吸收增加。因此,在骨代謝過程中DNMT起到關(guān)鍵的調(diào)控作用。同時,研究發(fā)現(xiàn)DNA甲基化通過改變個體表觀遺傳及對骨穩(wěn)態(tài)影響隨DNA復制遺傳給子代。Laurent等[16]研究人類分化過程中甲基組動態(tài)變化,證實DNA甲基化后DNA復制的基因組可以遺傳給下代。因此,需更深入研究DNA甲基化對骨代謝的影響,闡明表觀遺傳機制,防治骨質(zhì)疏松的發(fā)生發(fā)展。

2.1 DNA甲基化與成骨細胞

OB主要由骨膜和骨髓中的間充質(zhì)干細胞(mesenchymal stem cells,MSCs)分化而來。Zhang等[17]研究多分化潛能骨髓(bone mesenchymal stem cells,BMSC)和脂肪組織(Adipose tissue,AT)人基質(zhì)細胞中基因表達與過渡CPG甲基化的關(guān)系,發(fā)現(xiàn)BMSC中RUNX2及ATSC中PPARgamma2基因表達出現(xiàn)CPG的低甲基化和強表達,且MSCs向OB分化伴隨基因啟動子甲基化改變,得出OB在分化的過程中DNA甲基化起著重要的調(diào)控作用。在OB分化過程中RUNX2和OSX是必不可少的轉(zhuǎn)錄因子,且OSX也是RUNX2下游作用靶點[18]。同時,RUNX2和OSX相互作用參與骨細胞的分化與基因的相關(guān)表達[19-20]。

骨形態(tài)發(fā)生蛋白通過影像骨中多種細胞類型(MSCs、OB、OC等)具有骨形成和分解代謝的作用。其中BMP2具有骨誘導性,誘導RUNX2和OSX的表達促進OB分化、骨生長,已批準用于骨折愈合和脊柱手術(shù)等方面[21]。研究表明,DNA甲基化(上調(diào))與BMP2子區(qū)甲基化(下調(diào))對骨形成的表達起相反結(jié)果[22-23]。Raje等[23]發(fā)現(xiàn)OP患者骨密度與位于CpG島甲基化程度相關(guān),BMP2轉(zhuǎn)錄起于CpG位點,此位點的甲基化水平較高,造成BMP2轉(zhuǎn)錄活性、基因表達降低,得出BMP2在OB分化中具有重要的調(diào)控作用。

β-catenin信號分子在通過Wnt/β-catenin通路起著關(guān)鍵作用。Wnt可抑制細胞漿內(nèi)β-catenin降解,調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄,加速OB分化和成熟[24]。在對Wnt/β-catenin信號通路及MSCs研究,發(fā)現(xiàn)MSCs向OB轉(zhuǎn)化中Wnt/β-catenin信號通路中甲基化分子發(fā)生相應改變[25]。García-Ibarbia等[26]從853例患者血液中提取DNA,對OPF和OA差異表達基因的24個單核苷酸多態(tài)性分析,得出OP患者的Wnt活性降低。以上研究表明,DNA甲基化可通過調(diào)控MSCs、BMP2、Wnt/β-catenin通路等分子的轉(zhuǎn)錄表達,參與OB的分化與成熟,影響骨質(zhì)疏松的發(fā)生發(fā)展。

2.2 DNA甲基化與破骨細胞

核因子kB受體活化因子(receptor activator of NF-Kb,RANK)、配體(RANKL和OPG)位于OC表面,兩配體由OB和骨髓基質(zhì)細胞合成分泌[27-28]。RANK、OPG、RANKL在骨代謝過程中占據(jù)重要的地位,有效調(diào)控OC活性及分化[29]。研究ST2小鼠的MSCs發(fā)現(xiàn),誘導分化后MSCs中的RANKL基因周圍出現(xiàn)CPG甲基化,抑制RANKL表達,降低OB分化,表明誘導RANKL基因轉(zhuǎn)錄可調(diào)節(jié)CpG位點甲基化改變,影響OC分化[30]。Delgado-Calle等[31]探討CPG甲基化對調(diào)節(jié)OC生成的RANKL和OPG轉(zhuǎn)錄水平的影響,發(fā)現(xiàn)DNA甲基化與RANKL和OPG表達抑制之間關(guān)聯(lián)強烈,表明甲基化影響這些基因的轉(zhuǎn)錄,而其在OC生成中起關(guān)鍵作用。雖然Husain等[32]在人體研究中未發(fā)現(xiàn)OP患者與常人RANKL基因甲基化無明顯差異。但Wang等[33]在對比非OP與OPF兩組患者OPG與RANKL中CPG甲基化狀態(tài)的差異,發(fā)現(xiàn)OP組RANKL基因的表達遠高于非OP組,但RANKL基因甲基化水平卻低于非OP組。分析得出,RANKL基因甲基化水平降低,促使RANKL和OPG降低可增加OC活性,加速骨量的丟失,促進骨質(zhì)疏松的發(fā)生。因此,RANK、RANKL、OPG在骨穩(wěn)態(tài)平衡過程中具有重要調(diào)控作用[34]。見圖1。

圖1 DNA甲基化對成骨、破骨細胞平衡過程的調(diào)節(jié)作用

3 中醫(yī)理論與DNA甲基化

祖國醫(yī)學在診療時注重整體觀念,強調(diào)人與自然相統(tǒng)一,通過改善患者飲食起居、舒暢情志配合藥物調(diào)理使機體內(nèi)陰陽平衡,促使疾病治愈;研究發(fā)現(xiàn)表觀遺傳學也將外界環(huán)境與自身遺傳兩因素相結(jié)合,使基因組具有較高的穩(wěn)定性,更加適用于外界環(huán)境改變機體做出準確的反應[35]。因此,表觀遺傳學與中醫(yī)整體觀念、人與自然相統(tǒng)一的理念相符合。對于骨質(zhì)疏松的發(fā)病進程,中醫(yī)認為與臟腑功能密切相關(guān),脾腎為先后天之本,可因外界環(huán)境、飲食結(jié)構(gòu)的改變導致脾腎功能失調(diào),誘發(fā)骨質(zhì)疏松的發(fā)生[36]。現(xiàn)經(jīng)表觀遺傳學研究發(fā)現(xiàn),飲食結(jié)構(gòu)改變通過影響宿主腸道菌群的穩(wěn)態(tài)可參與骨質(zhì)疏松的發(fā)病過程[37]。另有研究發(fā)現(xiàn)多種疾病都同時包含高、低不同的異常甲基化狀態(tài),這與中醫(yī)對體內(nèi)陰陽失衡而導致疾病的發(fā)生觀點相一致[38]。因此,應用表觀遺傳學方式對骨質(zhì)疏松的發(fā)病機制進行研究,具有深遠的研究意義。

4 中藥干預DNA甲基化防治骨質(zhì)疏松

近年來,隨著我國對中醫(yī)藥事業(yè)的大力發(fā)展、生命科學及人類疾病譜系的深入研究,認識到中藥多靶點、多成分的特性,難以產(chǎn)生耐藥性,且副作用較少,尤其在治療OP方面具有獨特優(yōu)勢[39]。目前中藥調(diào)控DNA甲基化的研究集中在全基因組、單一化合物和中藥復方的異常甲基化狀態(tài)[40],發(fā)現(xiàn)補益肝腎類藥物(如淫羊藿、骨碎補、補骨脂、續(xù)斷等中藥及復方)具有強筋健骨、促進骨量吸收、調(diào)節(jié)骨代謝等作用,對DNA甲基化有較強的調(diào)控作用[41],能夠防治骨質(zhì)疏松的發(fā)展。觀察葛根素對骨質(zhì)疏松的影響,發(fā)現(xiàn)能有效抑制雌激素受體α(estrogen receptor α,ERα)甲基化,增強ERα mRNA表達促進OB成熟分化[42]。趙剛等[43]通過CCK-8法驗證葛根素和柚皮苷對小鼠OB增值效應的影響,發(fā)現(xiàn)葛根素與柚皮苷均刺激堿性磷酸酶的分泌促進OB的合成。中藥在對疾病相關(guān)靶點進行干預時,具有多成分、多環(huán)節(jié)、多基因相互作用的特點,中藥復方治療疾病時更具有相互協(xié)同作用,增強臨床療效。王劍等[44]通過在骨質(zhì)疏松大鼠上給予補腎健骨中藥復方(鹿茸、續(xù)斷、牡蠣等),觀察對骨組織leptin啟動子甲基化的影響,發(fā)現(xiàn)有效降低Runx2、Osterix啟動子甲基化及下丘腦leptin蛋白水平,同時上調(diào)其骨組織蛋白的表達,有效防治骨質(zhì)疏松的發(fā)生[45]。同實驗觀察鹿茸中藥復方對骨質(zhì)疏松大鼠療效機制的研究,其復方可降低Runx2、Osterix啟動子甲基化,防治骨質(zhì)疏松發(fā)生[46],可見多成分的中藥復方對基因甲基化的影響具有雙向調(diào)節(jié)的作用。金匱腎氣丸干預去勢大鼠觀察大鼠組織中ERα基因甲基化水平,發(fā)現(xiàn)去勢大鼠其基因表達與雌激素受體甲基化水平呈負相關(guān),表明金匱腎氣丸對去勢骨質(zhì)疏松大鼠雌激素受體甲基化水平有抑制作用[47]。另有研究,補腎藥方(左歸丸、右歸丸)在不同節(jié)點干預成骨、成脂不同誘導環(huán)境中的MSCs,通過檢測PPARy、β-catenin甲基化及基因的表達,探討補腎藥物對表觀遺傳學機制的影響,發(fā)現(xiàn)補益肝腎類藥可調(diào)節(jié)控制MSCs基因的表達,促進成骨抑制成脂分化,調(diào)控骨脂分化平衡[48]。由此可見,單味中藥及復方治療疾病可通過表觀遺傳學作用機制改變?nèi)梭w微環(huán)境、調(diào)控疾病DNA甲基化整體水平及疾病發(fā)展中關(guān)鍵基因的DNA甲基化狀態(tài),干預疾病的發(fā)展,從而實現(xiàn)對疾病的防治。

綜上所述,補益肝腎類藥物在防治OP的發(fā)展具有良好的臨床療效,其藥物作用機制是通過影響OB、OC及MSCs等DNA甲基化轉(zhuǎn)錄表達,促進OB分化和抑制OC活性、增加骨量,進而防治骨質(zhì)疏松的發(fā)病進程。

5 總結(jié)

骨質(zhì)疏松是一種由多因素引發(fā)的骨代謝性疾病,其發(fā)病涉及多種機制,目前對其發(fā)病機制尚不清晰,因此,對于OP的治療還未有根治的手段。隨著表觀遺傳學對骨質(zhì)疏松進行深入研究,人們對其發(fā)病機制的認知到達了微觀層面,DNA甲基化可通過調(diào)控OB、OC、MSCs、BMP2、RANK、RANKL、OPG、Wnt/β-catenin通路等分子的轉(zhuǎn)錄與表達,參與到OB和OC的分化,影響骨質(zhì)疏松的發(fā)病進程。通過網(wǎng)絡藥理學分析發(fā)現(xiàn),中藥治療疾病具有多靶點、多途徑等特點,與病變相關(guān)基因、蛋白進行多位點結(jié)合;通過DNA甲基化對關(guān)聯(lián)基因轉(zhuǎn)錄表達影響骨質(zhì)疏松的病理變化。目前對于中藥干預骨質(zhì)疏松基因變化還未進行深入研究,相關(guān)研究報道較少。從中醫(yī)整體觀來看,與表觀遺傳學關(guān)注重點相似,因此,可從DNA甲基化的角度來探討OP的防治,更好地服務于骨質(zhì)疏松患者。

目前對于骨質(zhì)疏松中藥干預其DNA甲基化的研究存在以下問題:骨質(zhì)疏松是一個逐漸發(fā)展、演變的過程,中藥對骨質(zhì)疏松的干預機制未能明確闡述;且現(xiàn)有的基礎(chǔ)實驗研究籠統(tǒng)地闡述中藥對引發(fā)骨質(zhì)疏松相關(guān)基因、細胞、DNA甲基化的影響,未能明確點明對某一環(huán)節(jié)或途徑產(chǎn)生影響、進而改變基因表達,研究深度不夠;其次,中藥干預臨床觀察研究納入樣本量較少,不能完成大樣本量的隨機對照觀察和客觀的系統(tǒng)評價。