馮 杰,劉艷芳,蘇曉薇,唐傳紅,李娥賢,李樹(shù)紅,周 帥,張勁松*

(1 上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院食用菌研究所,國(guó)家食用菌工程技術(shù)研究中心,農(nóng)業(yè)農(nóng)村部南方食用菌資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,上海市農(nóng)業(yè)遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,上海 201403;2 云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)與種質(zhì)資源研究所,昆明 650223)

靈芝為多孔菌目靈芝科靈芝屬真菌,日常生活中所說(shuō)的靈芝都是指靈芝子實(shí)體,其是我國(guó)最受重視的傳統(tǒng)中藥之一,可藥食兩用[1]。 研究表明:由于靈芝的化學(xué)成分復(fù)雜,使其含有多樣的活性成分[2]。 靈芝已被證明具有治療癌癥、糖尿病和人類(lèi)免疫缺陷病毒(HIV)病的作用[3],從靈芝中分離出來(lái)的主要活性成分有三萜類(lèi)、多糖類(lèi)、生物堿類(lèi)、氨基酸類(lèi)、油脂類(lèi)及微量元素等。 靈芝三萜類(lèi)物質(zhì)因具有抗腫瘤、保肝、免疫調(diào)節(jié)、調(diào)血脂和降血糖、抗真菌、抗炎和延緩衰老等作用而日益受到國(guó)內(nèi)外研究人員的重視[4-5]。

根據(jù)異戊二烯定則,多數(shù)三萜被認(rèn)為是由6 個(gè)異戊二烯縮合而成的。 靈芝三萜是羊毛甾烷類(lèi)衍生物[6],羊毛甾醇是其前體物,羊毛甾烷型靈芝三萜按結(jié)構(gòu)可分為四環(huán)三萜和五環(huán)三萜,按碳原子數(shù)可分為C24、C27 和C30[7]。 根據(jù)官能團(tuán)和側(cè)鏈的不同,可將其分為靈芝酸、靈芝醇、靈芝醛和靈芝內(nèi)酯等,以靈芝酸和靈芝醇類(lèi)為主[8]。

靈芝三萜類(lèi)物質(zhì)主要存在于野生采摘和人工栽培的子實(shí)體或孢子粉以及液態(tài)深層發(fā)酵的菌絲體中。人工栽培主要分為原木栽培和代料栽培[9],原木栽培主要是椴木栽培,選擇以闊葉樹(shù)木為主的木頭栽培[10];代料栽培中代料指將樹(shù)木的下腳料和其他輔料如木屑、棉籽殼、麩皮等物質(zhì)混合制成的培養(yǎng)基,可分為瓶栽和袋栽,目前袋栽應(yīng)用較為廣泛[11]。 液態(tài)發(fā)酵是在富含必需營(yíng)養(yǎng)成分的液態(tài)培養(yǎng)基中培養(yǎng)靈芝菌絲體,所獲得的菌絲體具有較高的生物活性,目前主要利用搖瓶和發(fā)酵罐培養(yǎng),前者主要進(jìn)行菌種的選育和培養(yǎng)工藝的優(yōu)化,后者則應(yīng)用于工業(yè)化生產(chǎn)[12]。

目前,野生靈芝較為稀少而較難獲取,人工栽培技術(shù)不穩(wěn)定且生長(zhǎng)周期較長(zhǎng)、成本較高、存在連作障礙,而液態(tài)發(fā)酵技術(shù)有發(fā)酵周期短、培養(yǎng)條件易控、不受環(huán)境影響、生產(chǎn)效益高、可應(yīng)用于工業(yè)化等優(yōu)點(diǎn)[13-15],通過(guò)液態(tài)發(fā)酵可獲得高得率的菌絲體及高活性的靈芝三萜。

本文從靈芝三萜生物合成途徑、液態(tài)發(fā)酵高產(chǎn)靈芝三萜的培養(yǎng)條件調(diào)控、外源物對(duì)液態(tài)發(fā)酵高產(chǎn)靈芝三萜的影響等方面重點(diǎn)闡述靈芝三萜類(lèi)物質(zhì)液態(tài)發(fā)酵的進(jìn)展,并通過(guò)總結(jié)代謝通量方法在微生物發(fā)酵領(lǐng)域的研究進(jìn)展,討論代謝通量在靈芝三萜類(lèi)物質(zhì)液態(tài)發(fā)酵合成方面的應(yīng)用前景。

1 靈芝三萜類(lèi)物質(zhì)生物合成途徑

1.1 萜類(lèi)物質(zhì)生物合成途徑

植物萜類(lèi)合成主要為質(zhì)體中的2-C-甲基-D-赤蘚糖醇-4-磷酸(MEP)途徑和細(xì)胞質(zhì)中的甲羥戊酸(MVA)途徑。 有研究表明,MEP 途徑合成單萜、二萜和類(lèi)胡蘿卜素,而MVA 途徑主要合成倍半萜和三萜[16]。 MEP 途徑和MVA 途徑都可以生成前體物質(zhì)異戊烯焦磷酸(IPP)和二甲基烯丙基焦磷酸酯(DMAPP),且IPP 可以在細(xì)胞質(zhì)和質(zhì)體之間穿梭[17],說(shuō)明MEP 途徑和MVA 途徑并非獨(dú)立存在。 不同數(shù)量的IPP 與DMAPP 結(jié)合生成香葉基二磷酸(GPP)、法呢基二磷酸(FPP)、香葉基香葉基二磷酸(GGPP)。GPP、FPP 和GGPP 在萜烯合酶(TPS)的作用下生成不同類(lèi)型的萜烯[18]。 各類(lèi)烯丙基焦磷酸酯經(jīng)特異性萜類(lèi)合酶作用可產(chǎn)生各種萜類(lèi)的碳骨架,如植烯、鯊烯等[19]。

MEP 途徑主要是以丙酮酸和3-磷酸甘油醛(GAP)通過(guò)1-脫氧-5-磷酸-D-木酮糖合成酶(DXS)轉(zhuǎn)化成1-脫氧-木酮糖-5-磷酸(DXP),經(jīng)過(guò)多步反應(yīng),最后生成IPP 和DMAPP[18,20](圖1)。 DXS 及DXR 是MEP途徑的兩個(gè)關(guān)鍵酶,其活性直接影響下游萜類(lèi)化合物的合成[16]。

圖1 植物萜類(lèi)物質(zhì)合成的MEP 途徑Fig.1 MEP pathway for the synthesis of plant terpenoids

MVA 途徑是由乙酰輔酶A(Ac-CoA)經(jīng)過(guò)乙酰輔酶A 硫解酶(AACT)和β-羥基-β甲基戊二酰-CoA 合成酶(HMGS)催化、縮合生成羥甲基戊二酰CoA(HMG-CoA),再由3-羥基-3-甲基戊二酸單酰輔酶A 還原酶(HMGR)催化生成MVA,MVA 經(jīng)過(guò)多步反應(yīng)后在甲羥戊酸-5-焦磷酸脫羧酶(MDD)的作用下生成IPP[21](圖2)。 HMGR 是MVA 途徑的第一個(gè)關(guān)鍵限速酶,其活性直接影響下游產(chǎn)物的合成[17]。

圖2 植物萜類(lèi)物質(zhì)合成的MVA 途徑Fig.2 MVA pathway for the synthesis of plant terpenoids

1.2 靈芝三萜生物合成途徑

靈芝三萜類(lèi)化合物主要是一類(lèi)高度氧化的羊毛甾烷衍生物,靈芝酸是靈芝三萜中的一類(lèi),主要是通過(guò)甲羥戊酸途徑進(jìn)行生物合成。 甲羥戊酸途徑經(jīng)過(guò)多步反應(yīng)生成三萜的前體物質(zhì):IPP 和DMAPP,在萜類(lèi)合酶的作用下生成法呢基焦磷酸(FPP),后在鯊烯合酶(SQS)的作用下產(chǎn)生鯊烯(SQ),經(jīng)多步反應(yīng)合成羊毛甾醇(LS)。 合成途徑的下游部分是羊毛甾醇,羊毛甾醇在合成靈芝酸的同時(shí)還會(huì)產(chǎn)生麥角甾醇和酵母甾醇[22](圖3)。 目前羊毛甾醇合成靈芝酸的途徑仍然未知,有研究表明[23],細(xì)胞色素P450(CYP450)單加氧酶參與了合成途徑,并且發(fā)現(xiàn)CYP450 對(duì)應(yīng)的基因在修飾羊毛甾醇骨架、催化羊毛甾醇合成靈芝酸具有重要作用。 Zhang 等[24]經(jīng)過(guò)多次篩選不同培養(yǎng)條件下與類(lèi)固醇結(jié)合的P450 基因,在靈芝中過(guò)表達(dá)后發(fā)現(xiàn)CYP512v2 表達(dá)與靈芝酸T 的積累顯著相關(guān)。 Yang 等[25]研究發(fā)現(xiàn),CYP450 基因中的CYP512U6 可以促進(jìn)靈芝酸DM 和靈芝酸TR 生成靈芝酸Jc,利用釀酒酵母的甾醇還原酶還能夠羥基化改性靈芝酸DM,而CYP505D13 配合生成環(huán)狀靈芝三萜[26]。 從羊毛甾醇到靈芝三萜中的CYP450 基因方面的研究較復(fù)雜,且羊毛甾醇合成的靈芝三萜化合物種類(lèi)較多,而CYP450 基因的相關(guān)研究成果只是“冰山一角”,所以羊毛甾醇合成靈芝酸這一未知途徑仍需繼續(xù)深入研究[27]。

圖3 靈芝三萜合成途徑Fig.3 Synthesis pathway of Ganoderma triterpenes

2 液態(tài)發(fā)酵高產(chǎn)靈芝三萜的培養(yǎng)條件調(diào)控

2.1 培養(yǎng)基因素調(diào)控

靈芝液態(tài)深層發(fā)酵的主要發(fā)酵過(guò)程與抗生素發(fā)酵過(guò)程較為類(lèi)似,其培養(yǎng)基主要由碳源、氮源、無(wú)機(jī)鹽和微量元素、生長(zhǎng)因子等組成。 通過(guò)對(duì)培養(yǎng)基的優(yōu)化,可以直接影響靈芝三萜的產(chǎn)生。 王謙等[28]研究發(fā)現(xiàn),玉米粉和葡萄糖較適合靈芝生長(zhǎng),發(fā)酵獲得的濕菌絲體產(chǎn)量達(dá)到35 g∕(100 mL);楊德等[29]研究表明,玉米粉可以提高靈芝菌絲體生物量至2.05 g∕(100 mL)。 金德寬[30]通過(guò)使用不同的碳源、氮源、無(wú)機(jī)鹽研究培養(yǎng)基組成對(duì)靈芝酸的影響,得到最佳發(fā)酵工藝條件為蔗糖40 g∕L、豆餅粉1.5 g∕L、KH2PO41.5 g∕L、MgSO41.5 g∕L,生物量和靈芝三萜產(chǎn)量分別為9.15 g∕L 和0.441 g∕L。 馮杰等[31]研究發(fā)現(xiàn),在‘滬農(nóng)靈芝1 號(hào)’培養(yǎng)過(guò)程中添加N-10 酵母自溶粉比對(duì)照的靈芝三萜產(chǎn)量提高了6.22%。 翟雙星等[32]在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中使用不同酵母粉進(jìn)行有機(jī)氮源復(fù)配試驗(yàn),發(fā)現(xiàn)將酵母粉N-1 與N-2 復(fù)配添加時(shí),靈芝三萜產(chǎn)量可達(dá)0.478 g∕L,比單一添加酵母粉N-1 和N-2 分別提高了21%和139%。 當(dāng)酵母粉N-1、N-2、N-3 混合添加時(shí),靈芝三萜產(chǎn)量可達(dá)0.514 g∕L,比3 種氮源的對(duì)照組分別提高了30%、157%和74%。 Wei 等[33]通過(guò)葡萄糖蔗糖混合分批補(bǔ)料方式對(duì)靈芝進(jìn)行液態(tài)發(fā)酵,靈芝三萜產(chǎn)量比對(duì)照提高了40%。

2.2 培養(yǎng)環(huán)境因素調(diào)控

除了培養(yǎng)基因素調(diào)控,發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間、溶氧、攪拌轉(zhuǎn)速、pH 等培養(yǎng)條件對(duì)靈芝三萜產(chǎn)量的影響也有相關(guān)研究。 溫度對(duì)靈芝消耗葡萄糖的速率有一定影響,促使胞內(nèi)發(fā)生各種生化反應(yīng),進(jìn)而影響菌絲體的生長(zhǎng)以及代謝物質(zhì)的生成。 汪金萍等[34]研究發(fā)現(xiàn),28 ℃為靈芝菌絲體最適生長(zhǎng)溫度。 Wang 等[35]在靈芝液態(tài)發(fā)酵過(guò)程中對(duì)發(fā)酵溫度和初始pH 進(jìn)行調(diào)控,發(fā)現(xiàn)溫度為28.6 ℃、初始pH 為5.9 時(shí),胞內(nèi)三萜產(chǎn)量可達(dá)到308.1 mg∕L。 Feng 等[36]研究了不同發(fā)酵時(shí)間段的溫度對(duì)靈芝液態(tài)發(fā)酵的影響,發(fā)現(xiàn)在0—61 h 時(shí),32 ℃的發(fā)酵溫度促進(jìn)菌絲體生長(zhǎng);在62—127 h 時(shí),溫度從31 ℃降到30 ℃,保持菌絲體生長(zhǎng)的同時(shí)促進(jìn)靈芝三萜的合成;在128 h 后,溫度維持在29 ℃,穩(wěn)定靈芝三萜的合成,使得產(chǎn)量達(dá)到0.269 g∕L。 發(fā)酵時(shí)間的長(zhǎng)短會(huì)影響菌絲體的生長(zhǎng)及靈芝三萜的生成。 Liu 等[37]研究發(fā)現(xiàn),當(dāng)培養(yǎng)基中的葡萄糖為44.4 g∕L、蛋白胨為5.0 g∕L、發(fā)酵時(shí)間為437.1 h 時(shí),可得到菌絲體干重11.3 g∕L,靈芝酸Me 產(chǎn)量4.8 mg∕L。

靈芝液態(tài)深層發(fā)酵的過(guò)程需要氧氣促進(jìn)菌絲體生長(zhǎng)以及在發(fā)酵中后期促進(jìn)靈芝三萜的合成。 有研究表明,較高的氧濃度可以促進(jìn)菌絲體生長(zhǎng),而較低的氧濃度可以促使靈芝三萜的產(chǎn)生。 通氣量與培養(yǎng)環(huán)境下的溶氧直接相關(guān)。 Zhang 等[38]研究發(fā)現(xiàn),當(dāng)溶氧量達(dá)到80%時(shí),靈芝三萜產(chǎn)量可達(dá)到1.43 g∕L。馮杰等[39]采用5 L 發(fā)酵罐研究通氣量對(duì)靈芝液態(tài)發(fā)酵的影響,發(fā)現(xiàn)當(dāng)通氣量為8 L∕min 時(shí),靈芝三萜得率為0.204 g∕L,最大菌絲體得率達(dá)到8.77 g∕L。 攪拌轉(zhuǎn)速也會(huì)通過(guò)影響溶氧量和剪切力的變化而影響靈芝液態(tài)發(fā)酵。 馮杰等[40]發(fā)現(xiàn),在發(fā)酵40 h 前,將轉(zhuǎn)速調(diào)整為150 r∕min,40 h 后調(diào)整至100 r∕min,可得到三萜含量0.720 mg∕(100 mg)。

pH 會(huì)影響靈芝細(xì)胞膜通透性,進(jìn)而影響營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)吸收、產(chǎn)物分泌以及三萜酸合成相關(guān)酶的活性[41]。Wang 等[42]在靈芝的液態(tài)發(fā)酵研究中發(fā)現(xiàn),pH 6.0 是產(chǎn)生靈芝酸的關(guān)鍵培養(yǎng)條件之一。 潘江安等[43]在靈芝的液態(tài)發(fā)酵中提出了四階段pH 控制策略,在0—26 h 時(shí)pH 自然,26—36 h 時(shí)pH 為4.0,36—81 h 時(shí)pH 為4.5,81—168 h 時(shí)pH 為5.0,得到菌絲體干重為14.18 g∕L,三萜產(chǎn)量為279.59 mg∕L。 Tang 等[44]運(yùn)用多階段調(diào)節(jié)pH 結(jié)合溶氧量控制的方法對(duì)靈芝液態(tài)發(fā)酵進(jìn)行研究,發(fā)現(xiàn)初始自然pH、在4 d 時(shí)pH 控制在3.0、在6 d 時(shí)pH 調(diào)為4.5,溶氧量在0—6 d 為25%、6 d 后為10%,靈芝三萜產(chǎn)量可達(dá)到754.6 mg∕L。

3 外源物對(duì)液態(tài)發(fā)酵高產(chǎn)靈芝三萜的影響

近年來(lái),靈芝液態(tài)發(fā)酵過(guò)程中添加外源物質(zhì)促進(jìn)目的產(chǎn)物的增加已成為一種新的調(diào)控手段。 外源添加物可以提高菌絲體生物量和靈芝三萜產(chǎn)量,降低培養(yǎng)基原材料的成本、控制環(huán)境條件的耗能。 外源物通過(guò)調(diào)節(jié)代謝產(chǎn)物生物合成途徑中的關(guān)鍵酶活性、誘導(dǎo)特定酶的基因表達(dá)、改變細(xì)胞通透性來(lái)最大限度地積累目的產(chǎn)物[45]。

3.1 細(xì)胞色素P450 誘導(dǎo)劑和抑制劑

在靈芝三萜生物合成的下游途徑中,細(xì)胞色素P450 是從羊毛甾醇到靈芝三萜生成途徑中一個(gè)關(guān)鍵的影響因素。 Wang 等[46]通過(guò)轉(zhuǎn)錄組動(dòng)力學(xué)分析發(fā)現(xiàn),cyp5150L8 是調(diào)節(jié)羊毛甾醇的關(guān)鍵基因。 Xu 等[47]通過(guò)透明顫菌血紅蛋白表達(dá)提高靈芝酸的研究發(fā)現(xiàn),cyp512a2、cyp512v2 和cyp512a13 轉(zhuǎn)錄水平上調(diào),推測(cè)這些P450 基因與靈芝酸生成有關(guān)。

Liang 等[48]研究表明,靈芝液態(tài)發(fā)酵中在靜置培養(yǎng)的第5 天添加100 μmol∕L 的細(xì)胞色素P450 誘導(dǎo)劑苯巴比妥,總靈芝酸含量、靈芝酸Mk、S、T 和Me 含量都增加,HMGR、SQS 和LS 的轉(zhuǎn)錄水平均有提高,說(shuō)明苯巴比妥對(duì)靈芝酸合成的誘導(dǎo)作用可能歸因于其對(duì)代謝流的促進(jìn)。 梁翠霞[49]研究發(fā)現(xiàn),在第7 天添加10 μmol∕L 的麥角固醇合成抑制劑咪康唑抑制了麥角固醇合成,促進(jìn)了羊毛甾醇積累,提高了靈芝酸產(chǎn)量,推測(cè)咪康唑?qū)`芝酸合成的促進(jìn)作用機(jī)制可能是通過(guò)基因以外的方式實(shí)現(xiàn)的。 Nojokiden 等[50]在靈芝液態(tài)發(fā)酵的第9 天添加100 μmol∕L 細(xì)胞色素P450 誘導(dǎo)劑利福平,靈芝酸產(chǎn)量達(dá)到18.6 mg∕g,并發(fā)現(xiàn)利福平雖然能夠提高靈芝酸產(chǎn)量,但同時(shí)也抑制了菌絲體的生成。

靈芝酸的生成也可能建立在細(xì)胞凋亡的基礎(chǔ)上,You 等[51]使用阿司匹林誘發(fā)ROS 增加,促使細(xì)胞凋亡、靈芝酸生成,角鯊烯合酶和羊毛甾醇的表達(dá)合酶編碼基因也有所下調(diào)。

3.2 植物激素

植物激素是指植物生長(zhǎng)過(guò)程中產(chǎn)生的微量但能響應(yīng)環(huán)境脅迫調(diào)節(jié)自身生理過(guò)程的有機(jī)化合物,在植物的生長(zhǎng)過(guò)程中可以調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)、影響次級(jí)代謝、激發(fā)免疫防御系統(tǒng)等[52-53]。 植物激素作為信號(hào)分子可通過(guò)激活特定代謝途徑來(lái)提高目的代謝產(chǎn)物。 近年來(lái),關(guān)于植物激素誘導(dǎo)靈芝酸生成的研究以茉莉酸甲酯(MeJA)和水楊酸(SA)為主。

辛燕花等[54]在研究MeJA 對(duì)靈芝液態(tài)深層發(fā)酵的影響時(shí)發(fā)現(xiàn),在發(fā)酵的第4 天添加100 μmol∕L MeJA,靈芝菌絲體中靈芝酸含量積累到最大50.02 mg∕g。 任昂[55]以吐溫-20 為助劑,研究MeJA 對(duì)靈芝液態(tài)深層發(fā)酵的影響,發(fā)現(xiàn)在第6 天加入254 μmol∕L MeJA,靈芝三萜含量可達(dá)到4.52 mg∕(100 mg)干菌絲體,比對(duì)照提高了45.3%。 考察MeJA 對(duì)關(guān)鍵酶基因轉(zhuǎn)錄水平的影響時(shí)發(fā)現(xiàn),不同濃度MeJA 在不同時(shí)間的誘導(dǎo)下,每個(gè)基因響應(yīng)MeJA 誘導(dǎo)的變化情況各不相同,但靈芝三萜生物合成途徑中的羥甲基戊二酰CoA 還原酶(HMGR)、法呢基焦磷酸合酶(FPPS)和羊毛甾醇合成酶(OSC)基因被MeJA 上調(diào)最為顯著。Cao 等[56]研究發(fā)現(xiàn),SA 能夠誘導(dǎo)靈芝三萜合成,HMGR、SQS 基因的轉(zhuǎn)錄水平也顯著提高。 Liu 等[57]研究發(fā)現(xiàn),SA 信號(hào)可以通過(guò)抑制線粒體復(fù)合物Ⅲ調(diào)節(jié)胞內(nèi)ROS 水平,參與調(diào)控靈芝的次級(jí)代謝合成。 Ye等[58]研究發(fā)現(xiàn),單獨(dú)添加150 μmol∕L SA 誘導(dǎo)靈芝液態(tài)發(fā)酵時(shí)可以提高37.19%的三萜含量,上調(diào)法呢基焦磷酸合酶(FPPS)、鯊烯合酶(SQS)和羊毛甾醇合酶(LS)基因的表達(dá),將鈣離子和SA 結(jié)合添加可以提高46.9%的三萜含量,上調(diào)6 種基因表達(dá),推測(cè)SQS 是該途徑的關(guān)鍵酶。 褪黑素是一種植物生長(zhǎng)促進(jìn)劑,鮑銳等[59]研究表明,褪黑素可以提高靈芝生物量和促進(jìn)靈芝酸產(chǎn)生,并推測(cè)作用機(jī)理可能與SA 誘導(dǎo)靈芝酸生物合成相關(guān)酶的基因表達(dá)、促進(jìn)靈芝酸的生物合成相似。 Zhang 等[60]研究表明,靈芝液態(tài)發(fā)酵中添加乙烯可以提高靈芝酸產(chǎn)量,達(dá)到33 mg∕g 干菌絲體,比對(duì)照提高了90%,同時(shí)羊毛甾醇和鯊烯含量增加。

3.3 油脂物質(zhì)

油脂物質(zhì)通過(guò)改變真菌細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和通透性或直接影響代謝途徑中某些重要的酶活性以促進(jìn)真菌的次生代謝產(chǎn)物合成。 朱會(huì)霞[61]研究發(fā)現(xiàn),當(dāng)添加油酸、α-萘乙酸、L-谷氨酸時(shí),油酸是影響靈芝酸生成的最顯著因素。 姚強(qiáng)等[62]使用不同的脂肪酸作為外源添加物進(jìn)行靈芝液態(tài)發(fā)酵,發(fā)現(xiàn)硬脂酸、亞油酸和棕櫚酸對(duì)生物量有促進(jìn)生長(zhǎng),僅亞油酸對(duì)胞內(nèi)三萜表現(xiàn)出較強(qiáng)的促進(jìn)作用,其他兩者均呈現(xiàn)抑制作用,說(shuō)明不同脂肪酸對(duì)靈芝三萜的產(chǎn)生表現(xiàn)出不同的效果,可能與其鏈的長(zhǎng)短以及飽和度的差異有關(guān)。

Feng 等[63]考察了6 種外源添加劑油酸、大豆油、正己烷、正十二烷、乙酸乙酯和吐溫-80 對(duì)靈芝液態(tài)發(fā)酵的影響,發(fā)現(xiàn)當(dāng)油酸為主要外源添加劑時(shí),得到最大菌絲干重為12.15 g∕L、三萜產(chǎn)量為0.776 g∕L,說(shuō)明培養(yǎng)基中加入油酸是最有效的。 孫冰沁等[64]考察油酸對(duì)靈芝三萜生物合成途徑中關(guān)鍵酶編碼基因的影響時(shí)發(fā)現(xiàn),油酸可以上調(diào)SQS 和CYP51 基因表達(dá),抑制14α-LDM 酶基因表達(dá),但達(dá)到最高靈芝三萜產(chǎn)量時(shí),SQS、CYP51 基因表達(dá)上調(diào)并不是最高,14α-LDM 基因表達(dá)也沒(méi)有下調(diào)到最低,推測(cè)油酸誘導(dǎo)產(chǎn)生靈芝三萜的機(jī)理可能是改變細(xì)胞膜的通透性或靈芝的基礎(chǔ)代謝、轉(zhuǎn)錄調(diào)控和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄。

薏苡仁油是主要成分含9.26%油酸、17.83%棕櫚酸、31.94%亞油酸的油脂類(lèi)物質(zhì)[65]。 黎李平[65]研究發(fā)現(xiàn),當(dāng)初始pH 為6.9,發(fā)酵第2 天添加3%的薏苡仁油時(shí),菌絲體內(nèi)的靈芝三萜得率為44.01 mg∕g。Yang 等[66]研究發(fā)現(xiàn),與玉米油、紅花油、橄欖油相比,薏苡仁油可以更好地促進(jìn)菌絲體和靈芝三萜的生長(zhǎng),在第0 天添加薏苡仁油后,菌絲體生物量是對(duì)照的3.34 倍,靈芝三萜產(chǎn)量是對(duì)照的2.76 倍。 畢澎洋[67]在靈芝液態(tài)發(fā)酵的第48 小時(shí)添加2%薏苡仁油,菌絲體生物量可達(dá)到11.44 g∕L,是對(duì)照的3.58 倍;在發(fā)酵過(guò)程的第24 小時(shí)添加,靈芝酸產(chǎn)量可達(dá)到130.4 mg∕L,是對(duì)照的4.04 倍。 Liu 等[68]研究表明,薏苡仁油誘發(fā)NO、H2O2的增加,NO 和H2O2參與了薏苡仁油誘導(dǎo)靈芝三萜合成的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程,從而促進(jìn)靈芝三萜含量的提高。 張容容[69]研究發(fā)現(xiàn),在第0 天添加1.5 g∕L 薏苡仁油不僅可以顯著提高靈芝液態(tài)發(fā)酵的生物量和三萜產(chǎn)量,而且菌絲體細(xì)胞在指數(shù)生長(zhǎng)末期到穩(wěn)定期間對(duì)誘導(dǎo)作用表現(xiàn)最為敏感,說(shuō)明薏苡仁油可在較長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)誘導(dǎo)靈芝菌絲體產(chǎn)生次級(jí)代謝產(chǎn)物,進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)NO 和H2O2作為信號(hào)分子在薏苡仁油的誘導(dǎo)過(guò)程中具有協(xié)同作用。 Zhou 等[70]研究發(fā)現(xiàn),添加0.2%薏苡仁酯可以促進(jìn)靈芝液態(tài)發(fā)酵的菌絲體生長(zhǎng),推測(cè)薏苡仁酯可作為促進(jìn)因子影響靈芝液態(tài)發(fā)酵。

4 代謝通量方法在微生物發(fā)酵領(lǐng)域的研究進(jìn)展

通過(guò)靈芝三萜合成途徑可以看出,從羊毛甾醇到靈芝三萜生成的中間反應(yīng)是未知的,無(wú)法通過(guò)信號(hào)通路和基因表達(dá)解釋,但也無(wú)法規(guī)避該反應(yīng),所以尋找一種新方法研究靈芝三萜合成途徑的機(jī)理是有必要的。 代謝通量方法是代謝途徑中一種常用的研究菌種調(diào)控生成代謝產(chǎn)物機(jī)理的方法,可以圍繞次生代謝產(chǎn)物合成途徑中的關(guān)鍵中間前體進(jìn)行定量分析,發(fā)現(xiàn)是否有同一前體的非目標(biāo)產(chǎn)物的通量生成,從而進(jìn)一步深入研究。 代謝通量方法可以直接應(yīng)用于菌種的初級(jí)代謝產(chǎn)物,也可以控制初級(jí)代謝產(chǎn)物的通量[71]。

4.1 代謝通量方法在細(xì)菌代謝合成目的產(chǎn)物方面的應(yīng)用

朱文澤等[72]建立了谷氨酸棒桿菌合成L-組氨酸的代謝網(wǎng)絡(luò)模型,發(fā)現(xiàn)在發(fā)酵初期添加檸檬酸鈉能夠改變L-組氨酸生物合成途徑的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)6-磷酸葡萄糖、丙酮酸及乙酰輔酶A 的代謝流分布,維持糖酵解途徑、磷酸戊糖途徑與三羧酸循環(huán)之間的代謝流量平衡,有利于提高L-組氨酸生物合成途徑的代謝流量,最終使L-組氨酸的代謝流增加了7.86%。 張克旭等[73]應(yīng)用黃色短桿菌發(fā)酵合成L-纈氨酸,通過(guò)物料衡算和MATLAB 線性規(guī)劃方法,發(fā)現(xiàn)發(fā)酵中后期L-纈氨酸合成過(guò)程中的代謝流量分步主要通過(guò)糖酵解途徑和磷酸戊糖途徑,再進(jìn)入三羧酸循環(huán)途徑,找到關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)6-磷酸葡萄糖、磷酸烯醇丙酮酸以及丙酮酸節(jié)點(diǎn),得出降低三羧酸循環(huán)的代謝流量,增大糖酵解途徑的流量可以使L-纈氨酸產(chǎn)量增加。

黃金等[74]建立了不同溶氧條件下大腸桿菌合成L-蘇氨酸的代謝網(wǎng)絡(luò)模型,對(duì)關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)6-磷酸葡萄糖、磷酸烯醇丙酮酸以及α-酮戊二酸進(jìn)行代謝通量分析發(fā)現(xiàn),增加磷酸戊糖途徑代謝流量,減少糖酵解途徑和三羧酸循環(huán)代謝流量,可以大幅降低碳物質(zhì)的流失;確定溶氧是發(fā)酵中后期的關(guān)鍵因素,增加溶氧有利于L-蘇氨酸的生成,抑制副產(chǎn)物生成。 Niu 等[75]建立了大腸桿菌發(fā)酵促使甘油生成L-蛋氨酸的代謝網(wǎng)絡(luò)模型,發(fā)現(xiàn)L-蛋氨酸主要來(lái)源于磷酸烯醇丙酮酸轉(zhuǎn)化為草酰乙酸的途徑,增強(qiáng)磷酸戊糖途徑可提供大量NADPH,增加溶氧水平促使目的產(chǎn)物合成。 Yao 等[76]建立了大腸桿菌產(chǎn)乙醇的代謝模型,對(duì)菌株HJ06PN 的產(chǎn)醇通量分布分析發(fā)現(xiàn),磷酸二羥丙酮節(jié)點(diǎn)的碳分配將更多的碳從較低的糖酵解途徑逐漸引導(dǎo)到乙醇的生物合成途徑,三羧酸循環(huán)減少了乙酸的生成,NADH 轉(zhuǎn)化為NADPH 的轉(zhuǎn)氫化通量不斷增大。 Hong 等[77]建立了兩種大腸桿菌菌株高產(chǎn)白藜蘆醇模型,第一株菌株以酪氨酸為前體,通過(guò)磷酸戊糖途徑合成對(duì)香豆酸,第二株菌株結(jié)合第一株菌株產(chǎn)生的對(duì)香豆酸和糖酵解途徑合成的乙酰輔酶A 合成丙二酰輔酶A 生成白藜蘆醇,以20 g∕L 葡萄糖為底物可獲得55.7 mg∕L 的白藜蘆醇。 通過(guò)代謝通量分析表明,檸檬酸循環(huán)和丙二酰輔酶A 供應(yīng)節(jié)點(diǎn)之間的平衡是白藜蘆醇產(chǎn)生的關(guān)鍵點(diǎn)。

王澤建等[78]建立了糞產(chǎn)堿桿菌發(fā)酵合成凝膠多糖的代謝網(wǎng)絡(luò)模型,通過(guò)分析葡萄糖和麥芽糖作為底物對(duì)凝膠多糖代謝通量的影響,發(fā)現(xiàn)麥芽糖比葡萄糖的凝膠多糖得率高出45.8%,原因是以麥芽糖為碳源時(shí)磷酸戊糖途徑的絕對(duì)代謝通量提升了40%以上。 磷酸二羥丙酮途徑通量的增加提升了NADPH 還原力供給速率,加快了碳源作為底物向產(chǎn)物的摩爾轉(zhuǎn)化速率。

林美君[79]使用代謝通量方法構(gòu)建了4 種乳酸菌中央碳代謝網(wǎng)絡(luò)模型,找出關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)為6-磷酸葡萄糖、6-磷酸果糖、磷酸烯醇丙酮酸、丙酮酸、草酰乙酸和α-酮戊二酸,并對(duì)乳酸產(chǎn)量和乳酸菌OD 值的相關(guān)性進(jìn)行了研究。

4.2 代謝通量方法在真菌代謝合成目的產(chǎn)物方面的應(yīng)用

Zhang 等[80]通過(guò)代謝通量方法探討了不同氮源對(duì)糖多孢紅霉菌8 號(hào)產(chǎn)紅霉素的影響,發(fā)現(xiàn)在氮源優(yōu)化條件下,磷酸戊糖途徑為紅霉素合成提供了更多的NADPH。 較高的正丙醇比消耗率促進(jìn)紅霉素合成,正丙醇通過(guò)甲基丙二酰輔酶A 節(jié)點(diǎn)流入中樞碳代謝。

Li 等[81]建立了熱帶念珠菌CICC1779 利用葡萄糖和木糖產(chǎn)乙醇的代謝模型,發(fā)現(xiàn)溶氧量是高產(chǎn)乙醇的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn),誘變菌株產(chǎn)生的乙醇為24.85 g∕L,是野生菌株的1.41 倍,溶氧量增加后可以達(dá)到26.56 g∕L,且突變株的木糖還原酶和木糖脫氫酶活性均高于原株,表明誘變株可以有效利用木糖促進(jìn)目的產(chǎn)物代謝。

Tomàs-Gamisans 等[82]研究發(fā)現(xiàn),以甘油為碳源可以促進(jìn)畢赤酵母產(chǎn)氨基酸。 Hayakawa 等[83]建立了添加乙醇促進(jìn)釀酒酵母產(chǎn)腺苷蛋氨酸的代謝模型,發(fā)現(xiàn)乙醇培養(yǎng)中三羧酸循環(huán)和乙醛酸分流的代謝通量水平顯著高于葡萄糖培養(yǎng),更多的ATP 是由乙醇通過(guò)氧化磷酸化產(chǎn)生的。 沈?qū)幯嗟萚84-85]對(duì)法夫酵母發(fā)酵生成蝦青素的前中后期進(jìn)行代謝通量分析,并對(duì)關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)乙酰輔酶A、α-酮戊二酸以及5-磷酸核酮糖進(jìn)行研究,得出在發(fā)酵前期,法夫酵母JMU-VDL668 的糖酵解途徑通量增大,為合成新細(xì)胞提供前體物和能量;在發(fā)酵中后期,三羧酸循環(huán)及磷酸戊糖途徑的通量都增大,為細(xì)胞內(nèi)代謝產(chǎn)物的合成提供NADPH和ATP。

4.3 代謝通量方法在其他方面的應(yīng)用

王景川等[86]建立了螺旋藻合成β-胡蘿卜素的代謝網(wǎng)絡(luò)模型,研究了不同溫度對(duì)β-胡蘿卜素代謝通量的影響。 Cheah 等[87]研究了長(zhǎng)球藻PCC 7942 產(chǎn)醛的代謝通量,發(fā)現(xiàn)丙酮酸是其產(chǎn)醛的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn),在該節(jié)點(diǎn)上丙酮酸激酶(PK)和乙酰烯烴合成酶(ALS)與醛產(chǎn)量直接相關(guān),而丙酮酸脫氫酶(PDH)和磷酸烯醇丙酮酸羧化酶(PPC)的通量隨著醛產(chǎn)量的增加而變化。

5 討論

靈芝是我國(guó)著名的藥用真菌,其含有多種活性成分,目前的研究以靈芝多糖和靈芝三萜較多。 靈芝三萜是羊毛甾烷型萜類(lèi)物質(zhì),其具有廣泛的藥理活性,主要來(lái)源是子實(shí)體和孢子粉以及液態(tài)發(fā)酵的菌絲體和胞外液,液態(tài)發(fā)酵以發(fā)酵周期短、條件易控制、目的產(chǎn)物較穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)成為獲得靈芝三萜的主要手段之一。

通過(guò)培養(yǎng)基組成、pH、攪拌速度、溫度、溶氧量等方面的工藝條件優(yōu)化可以使靈芝的生物量以及菌絲體三萜含量增加,但單從以上方面進(jìn)行工藝優(yōu)化可能需要較高成本,且并不能較大幅度提高單體靈芝酸產(chǎn)量。 通過(guò)添加外源物可以從調(diào)控靈芝次生代謝產(chǎn)物的關(guān)鍵酶活性、關(guān)鍵酶基因轉(zhuǎn)錄水平以及細(xì)胞通透性等方面促進(jìn)靈芝生物量和菌絲體靈芝三萜含量增長(zhǎng),可以避免工業(yè)上的成本浪費(fèi),降低環(huán)境污染等。

目前,外源添加物主要通過(guò)活性氧(ROS)、一氧化氮(NO)等信號(hào)通路方向進(jìn)行研究。 通過(guò)靈芝三萜合成途徑來(lái)看,從羊毛甾醇到靈芝三萜生成的中間反應(yīng)是未知的,無(wú)法通過(guò)信號(hào)通路方面的研究進(jìn)行解釋,尋找一種新的方法對(duì)靈芝三萜合成途徑進(jìn)行研究進(jìn)而揭秘其合成機(jī)理是有必要的。 另外,目前圍繞靈芝三萜生物合成途徑的研究大多集中在基因方面,可對(duì)關(guān)鍵酶的基因轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行檢測(cè)。 由于靈芝三萜合成下游過(guò)程中碳環(huán)骨架的復(fù)雜修飾,從羊毛甾醇到靈芝三萜生成的中間途徑較為復(fù)雜,目前主要聚焦在P450 家族基因的研究。 代謝通量方法可以圍繞次生代謝產(chǎn)物的關(guān)鍵中間前體進(jìn)行定量分析,作為代謝途徑中的一種研究菌種調(diào)控生成代謝產(chǎn)物機(jī)理的常用方法還未曾在藥用真菌的研究中出現(xiàn)過(guò)。 筆者通過(guò)國(guó)家自然科學(xué)基金青年基金項(xiàng)目的實(shí)施已建立了靈芝三萜代謝網(wǎng)絡(luò)模型,項(xiàng)目通過(guò)靈芝三萜代謝通量分析,強(qiáng)化靈芝三萜類(lèi)物質(zhì)合成的代謝流向,為提高靈芝三萜的產(chǎn)量奠定了一定基礎(chǔ)。