蕭 晟, 熊 冉

(蕪湖職業(yè)技術(shù)學(xué)院,安徽 蕪湖 241003)

弓形蟲病(Toxoplasmosis)是由剛地弓形蟲(Toxoplasmagondii)感染人和多種動(dòng)物所引起的一種共患性傳染病[1-2]。弓形蟲經(jīng)口感染后在腸道部位侵入黏膜上皮,通過循環(huán)系統(tǒng)播散全身致病,嚴(yán)重危害人畜的健康[3]。青蒿具有清熱、截瘧、退黃之功效,研究表明其可以有效治療弓形蟲[4]、瘧原蟲[5]、日本血吸蟲[6]等寄生蟲的感染,但是其治療分子機(jī)制目前仍不明確。隨著高通量組學(xué)技術(shù)的發(fā)展,以及計(jì)算機(jī)技術(shù)的介入,在生物信息學(xué)技術(shù)背景下提出網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)說,該學(xué)說是以網(wǎng)絡(luò)靶標(biāo)方法將中藥、病證映射于生物分子網(wǎng)絡(luò),以網(wǎng)絡(luò)為基礎(chǔ)建立中藥與病證的關(guān)聯(lián)機(jī)制[7]。目前,利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)技術(shù)在系統(tǒng)性紅斑狼瘡[8]、腦型瘧[9]、新型冠狀病毒肺炎[10]等方面取得了突出的進(jìn)展,奠定了青蒿治療疾病的成分-靶點(diǎn)基礎(chǔ),但其用于治療弓形蟲病的研究較少。因此,為了明確青蒿抗弓形蟲病的成分-靶點(diǎn)基礎(chǔ),揭示青蒿抗弓形蟲病的內(nèi)在機(jī)制,本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法獲取青蒿抗弓形蟲病的成分-靶點(diǎn)信息,經(jīng)富集獲取弓形蟲病特異性靶點(diǎn),并使用小鼠弓形蟲感染模型進(jìn)行驗(yàn)證,揭示青蒿抗弓形蟲病的內(nèi)在機(jī)制,為青蒿治療弓形蟲病提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

30只體質(zhì)量(18±2) g SPF級(jí)ICR雌性小鼠(SCXK(皖)2017-001)購(gòu)自安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心;TRIzol RNA(Thermo Fisher Scientific);High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit(Thermo Fisher Scientific);PowerTrackTMSYBR Green Master Mix(Applied Biosystems)。青蒿采自安徽省蕪湖職業(yè)技術(shù)學(xué)院,榨汁機(jī)榨汁,3 000 r/min離心15 min,取上清液40 ℃下濃縮至生藥質(zhì)量濃度為1 mg/mL,備用。

1.2 TCMSP網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析

本研究從TCMSP(https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php)獲取20種代表性的青蒿成分(OB≥30%,DL≥0.18),使用Pub Chem數(shù)據(jù)庫(kù)(http://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov)獲取青蒿成分的SMILES文件,在Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.swisstargetprediction.ch)中構(gòu)建青蒿活性成分的化學(xué)結(jié)構(gòu)并預(yù)測(cè)靶點(diǎn);在Gene cards(www.genecards.org)獲取弓形蟲感染靶點(diǎn)。使用Draw Venn Diagram(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/)在線工具獲取青蒿和弓形蟲感染共表達(dá)靶點(diǎn)(cDEGs),使用String(https://string-db.org/)進(jìn)行cDEGs蛋白互作分析并使用Cytoscape 3.7.0構(gòu)建PPI蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖,并使用MCODE對(duì)PPI蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖上的cDEGs進(jìn)行篩選獲得高相關(guān)性靶點(diǎn)(hug DEGs)。使用hug DEGs對(duì)青蒿靶點(diǎn)進(jìn)行篩選,獲得hug DEGs相對(duì)應(yīng)的青蒿活性成分,并構(gòu)建network和type文檔導(dǎo)入Cytoscape 3.7.0構(gòu)建成分-靶點(diǎn)可視化網(wǎng)絡(luò)圖。使用David網(wǎng)站(https://david.ncifcrf.gov/)中GO和KEGG分析hug DEGs,進(jìn)行功能富集,獲得弓形蟲病特異性靶點(diǎn)。

1.3 動(dòng)物試驗(yàn)靶點(diǎn)驗(yàn)證

2 結(jié)果與分析

2.1 青蒿活性成分和弓形蟲感染共表達(dá)靶點(diǎn)篩選

從TCMSP中獲取20種代表性的青蒿成分,經(jīng)過Swiss Target Prediction預(yù)測(cè)獲得519個(gè)青蒿成分的靶點(diǎn)信息;在Gene cards中查詢弓形蟲感染的靶點(diǎn)346個(gè),Draw Venn Diagram在線工具對(duì)青蒿成分的靶點(diǎn)和弓形蟲感染進(jìn)行交集分析,共獲得47個(gè)cDEGs(圖1)。

圖1 青蒿成分和弓形蟲感染靶點(diǎn)Venn圖Fig.1 The Venn of Artemisia apiaceaingredients and cough expression target

2.2 PPI蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建

如圖2所示,使用String數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)cDEGs分析并獲得TSV文件,導(dǎo)入Cytoscape 3.7.0構(gòu)建PPI蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖,該網(wǎng)絡(luò)圖包含46 nodes和550 edges;使用MCODE對(duì)PPI蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖上的cDEGs進(jìn)行篩選獲得19 hug DEGs(19 nodes和282 edges)。

圖2 PPI蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖Fig.2 PPI protein interaction network targets

2.3 靶點(diǎn)-成分網(wǎng)絡(luò)圖構(gòu)建

使用hug DEGs對(duì)青蒿靶點(diǎn)進(jìn)行篩選,獲得19個(gè)與hug DEGs相對(duì)應(yīng)的青蒿成分-靶點(diǎn)信息,利用Cytoscape 3.7.0軟件將篩選出的19 hug DEGs與19種青蒿成分的靶點(diǎn)構(gòu)建靶點(diǎn)-成分可視化網(wǎng)絡(luò)圖,網(wǎng)絡(luò)圖中38 nodes和131 edges直觀反應(yīng)成分和靶點(diǎn)之間的相互作用。通過比較Degree值的大小(Degree≥7),推測(cè)出青蒿成分中的青蒿黃素、青蒿素、脫氧青蒿素、雙氫青蒿素、線薊素、甲氧基壽菊素、澤蘭黃醇素、異鼠李素、山奈酚、萬壽菊素、槲皮素、檉柳黃素等與青蒿抗弓形蟲感染靶點(diǎn)密切相關(guān)(圖3)。

圖3 靶點(diǎn)-成分網(wǎng)絡(luò)圖Fig.3 The targets-ingredients network

2.4 功能富集分析

使用David網(wǎng)站對(duì)hug DEGs進(jìn)行篩選富集分析,GO富集結(jié)果顯示,生物過程(BP)主要富集在細(xì)胞對(duì)活性氧的反應(yīng)、正調(diào)控凋亡過程、蛋白質(zhì)磷酸化、正調(diào)控細(xì)胞增殖、MAPK級(jí)聯(lián)途徑等,細(xì)胞組分主要富集在細(xì)胞核、細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)、線粒體、細(xì)胞表面等,分子功能(MF)主要富集在蛋白激酶活性、蛋白結(jié)合、泛素蛋白連接酶結(jié)合等方面(圖4A)。KEGG富集結(jié)果顯示,PI3K-Akt信號(hào)通路、MAPK信號(hào)通路、趨化因子信號(hào)通路、弓形蟲病等方面(圖4B),其中,與弓形蟲病相關(guān)靶點(diǎn)有AKT1、MAPK1、MAPK14、MAPK3、NOS2、STAT1、TNF,涉及MAPK信號(hào)通路、Toll樣受體信號(hào)通路、Jak/STAT信號(hào)通路等(圖5)。

圖4 GO(A)和KEGG(B)富集分析結(jié)果Fig.4 Results of GO(A)and KEGG(B) enrichment analysis

圖5 弓形蟲病信號(hào)通路圖Fig.5 Toxoplasmosis signaling pathway

2.5 動(dòng)物試驗(yàn)靶點(diǎn)驗(yàn)證

動(dòng)物試驗(yàn)表明,模型組小鼠弓形蟲感染死亡率要高于空白組,與模型組相比,青蒿能顯著提高小鼠的生存率(圖6)。選取與弓形蟲病相關(guān)靶點(diǎn)AKT1、MAPK14、NOS2、STAT1、TNF-α等進(jìn)行qRT-PCR驗(yàn)證,結(jié)果如圖7所示,弓形蟲感染能夠顯著上調(diào)AKT1、MAPK14、NOS2、STAT1、TNF-αmRNA的表達(dá)(P<0.05),使用青蒿干預(yù)治療后,AKT1、MAPK14、NOS2、STAT1、TNF-αmRNA顯著下調(diào)(P<0.05)。

圖6 弓形蟲感染生存率變化Fig.6 The percent survival of toxoplasmosis

圖7 弓形蟲感染小鼠肝臟相關(guān)基因表達(dá)結(jié)果Fig.7 Relative liver gene expression in toxoplasmosis induced mice

3 結(jié)論與討論

青蒿是我國(guó)傳統(tǒng)的抗寄生蟲中藥,其有效成分青蒿素、雙氫青蒿素具有顯著的抗瘧疾作用,并被作為指定用于臨床的抗瘧藥物[12]。研究表明,青蒿及其提取物對(duì)剛地弓形蟲、利什曼原蟲、岡比錐蟲和枯氏錐蟲均有不同程度抑制作用[13]。尹衛(wèi)東等[14]研究發(fā)現(xiàn),雙氫青蒿素可以有效治療小鼠弓形蟲速殖子感染,并可使弓形蟲速殖子細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)發(fā)生損傷。本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)構(gòu)建靶點(diǎn)-成分可視化網(wǎng)絡(luò)圖發(fā)現(xiàn),青蒿的抗弓形蟲感染可能與青蒿素、雙氫青蒿素、青蒿黃素、脫氧青蒿素、線薊素、甲氧基壽菊素、澤蘭黃醇素、異鼠李素、山奈酚、萬壽菊素、槲皮素、檉柳黃素密切相關(guān)。

王盼[15]研究表明,青蒿素抗按蚊傳瘧能力與Toll信號(hào)通路有關(guān),其通過活化關(guān)鍵分子MyD88和Rel 1發(fā)揮抗瘧作用。周永華等[16]研究表明,青蒿琥酯可以通過下調(diào)HSP47的表達(dá)水平抑制膠原合成,進(jìn)而減輕日本血吸蟲誘導(dǎo)的早期肝纖維化。但是該研究沒有揭示青蒿抗弓形蟲感染機(jī)制,本研究通過KEGG富集分析發(fā)現(xiàn),青蒿抗弓形蟲感染機(jī)制可能與MAPK信號(hào)通路、Toll樣受體信號(hào)通路、Jak/STAT信號(hào)通路等有關(guān),涉及AKT1、MAPK1、MAPK14、MAPK3、NOS2、STAT1、TNF等靶點(diǎn)。同時(shí)通過小鼠弓形蟲感染驗(yàn)證,弓形蟲感染能夠顯著上調(diào)AKT1、MAPK14、NOS2、STAT1、TNF-αmRNA的表達(dá),使用青蒿進(jìn)行干預(yù)治療后,生存率顯著升高,AKT1、MAPK14、NOS2、STAT1、TNF-αmRNA顯著下調(diào)。表明這些基因在青蒿治療弓形蟲感染過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。

綜上,青蒿治療弓形蟲感染的機(jī)制可能與AKT1、MAPK14、NOS2、STAT1、TNF-α等靶點(diǎn)密切相關(guān),可能涉及MAPK信號(hào)通路、Toll樣受體信號(hào)通路以及Jak/STAT信號(hào)通路。