朱先飛，韓仁長(zhǎng)，黃冠，丁龍，余洪根，陳世春，方先勇，夏金鳳，劉金師

（安徽國(guó)豪農(nóng)業(yè)科技有限公司，安徽合肥 230000）

油菜是世界四大油料作物之一，也是我國(guó)第一大油料作物，作為食用植物油和植物蛋白的主要來(lái)源，油菜在農(nóng)產(chǎn)品中占有重要地位。隨著生物育種技術(shù)的發(fā)展，分子標(biāo)記輔助育種已經(jīng)成為油菜育種的重要手段，油菜品種的真實(shí)性檢測(cè)和雜交種純度的DNA 檢測(cè)已經(jīng)開(kāi)展得越來(lái)越多[1-3]，而油菜DNA 的提取是以上分子生物學(xué)操作的基礎(chǔ)。一般實(shí)驗(yàn)室提取DNA 的方法有磁珠法[4]、CTAB 法[5]、SDS 法[6]等，這些方法提取的DNA 濃度高、完整性好，但操作步驟繁瑣復(fù)雜、耗時(shí)長(zhǎng)，每次提取大致需要3～4 h，提取量大時(shí)耗費(fèi)時(shí)間更久。

前人對(duì)DNA 快速提取方法已經(jīng)進(jìn)行了許多研究。郭景倫、易紅梅等[7-8]利用堿裂解法對(duì)玉米的DNA 進(jìn)行快速提取，并成功應(yīng)用于PCR 反應(yīng)；孫林靜等[9]利用堿裂解法對(duì)水稻的DNA 進(jìn)行快速提取，并成功應(yīng)用于PCR 反應(yīng)。此外，該方法在花生[10]、大豆[11]等油料作物中都有研究。油菜DNA 提取已經(jīng)有了不少研究[12-13]，該文在前人研究的基礎(chǔ)上對(duì)油菜的堿煮法DNA 提取方法進(jìn)行了改良，無(wú)需采用研磨，使用普通PCR 板即可，更加簡(jiǎn)化，成本更低，同時(shí)與磁珠法提取效果進(jìn)行比較，簡(jiǎn)單的SSR 分子標(biāo)記操作上并無(wú)明顯差異。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 植物材料。供試材料為安徽國(guó)豪農(nóng)業(yè)科技有限公司科研基地所選取的油菜組織。

1.1.2 主要試劑與儀器。固體NaOH 購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；1.5 mol/L Tris-HCl 緩沖液（pH=8.8）以及瓊脂糖凝膠電泳所用的核酸染色劑（GoldViewⅠ型核酸染色劑）購(gòu)于索萊寶生物科技有限公司；50×TBE 緩沖液；DNA Marker 購(gòu)于索萊寶生物科技有限公司；2×TaqMaster Mix for PAGE 購(gòu)自南京諾維贊；PCR 擴(kuò)增儀型號(hào)為T100，購(gòu)自美國(guó)伯樂(lè)公司；高速離心機(jī)為賽默飛Micro 17R；電泳儀型號(hào)為DYY-8C，購(gòu)自北京市六一儀器廠；凝膠成像系統(tǒng)型號(hào)為Azure Biosystems C200；磁珠法提取試劑盒購(gòu)自天根生物科技有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 DNA 提取。堿煮法：分別剪取油菜的根、莖稈或葉片約100 mg 放入96 孔板（200 μL）中，每孔加入DNA 提取液0.2 mol/L NaOH 40 μL，100℃水浴鍋中水浴1 min 后取出，加入提取液0.17 mol/L Tris-HCl 60 μL，100℃水浴鍋中水浴2 min 后取出，提取后的DNA 放4℃冰箱保存留用或直接吸取1 μL 的上清液用于PCR 反應(yīng)。

磁珠法：取新鮮植物組織或粉狀干燥組織50～200 mg，用液氮在研缽中研磨充分，加入1 mL 的Lysis Buffer（65℃預(yù)熱）研磨均勻，然后轉(zhuǎn)移到1.5 mL 的EP 管，混合均勻。將EP 管置于恒溫水箱中65℃溫浴30～60 min。期間不時(shí)搖動(dòng)，溫浴結(jié)束后，12 000 r/min 離心10 min。取200 μL上清液于新的1.5 mL EP 管中，加入20 μL RNA 酶混勻，5 min 后加入20 μL bead、200 μL 異丙醇，顛倒混勻靜置5 min 后，將EP 管置于磁力架上磁分離，吸棄上清液。移去磁力架，加入800 μL Wash Buffer，振蕩混勻靜置5 min 后，將EP 管置于磁力架上磁分離，吸棄上清液。若有團(tuán)狀或絲狀物可增加振蕩時(shí)間及力度，重復(fù)該步驟1 次。移去磁力架，加入100 μL Elution Buffer，移液槍緩慢吹打混勻1～2 min，將離心管在磁力架上靜置0.5 min，小心吸走上清液放入新離心管即為提取的DNA，存放于2℃～8℃，長(zhǎng)期存放需置于-20℃（洗脫液在65℃～70℃中預(yù)熱后洗脫效果更好，減小洗脫體積或多次洗脫可增大DNA 濃度）。

1.2.2 PCR 擴(kuò)增。PCR 反應(yīng)體系：采用15 μL 反應(yīng)體系，其中DNA 模板1 μL，正向引物和反向引物各1 μL，2×Mix 7.5 μL，ddH2O 4.5 μL。PCR 反應(yīng)引物見(jiàn)表1。

表1 PCR 反應(yīng)所用引物名稱和序列

PCR 反應(yīng)程序：將PCR 反應(yīng)所需的成分配置完后，在PCR 儀上于94℃預(yù)加熱5 min，使模板DNA 充分變性，然后進(jìn)入擴(kuò)增循環(huán)。在每一個(gè)循環(huán)中，94℃保持30 s 使模板變性，然后將溫度降到55℃，保持30 s，使引物與模板充分退火；在72℃保持30 s，使引物在模板上延伸，合成DNA。重復(fù)循環(huán)30 次，使擴(kuò)增的DNA 片段大量累積。最后，在72℃保持5 min，使產(chǎn)物延伸完整，在4℃保存。

電泳檢測(cè)：PCR 產(chǎn)物凝膠電泳檢測(cè)以3 μL DNA 2000 Marker 作為標(biāo)記，然后吸取8 μL DNA 溶液點(diǎn)入瓊脂糖凝膠的膠孔中，電泳25 min（U=120 V），將瓊脂糖凝膠置于凝膠成像系統(tǒng)中拍照分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 高通量快速提取法與磁珠法提取DNA 效果對(duì)比

高通量快速提取與磁珠法提取的DNA 用同樣的一組引物，采用相同的PCR 運(yùn)行程序，點(diǎn)樣3 μL，電泳條件完全相同。凝膠成像系統(tǒng)結(jié)果顯示，兩種方法提取的DNA 效果并無(wú)明顯差異，磁珠法提取的擴(kuò)增效果濃度稍大（圖1～2）。

圖1 堿煮法高通量提取的DNA 擴(kuò)增效果

圖2 磁珠法高通量提取的DNA 擴(kuò)增效果

2.2 油菜不同生長(zhǎng)時(shí)期的DNA 提取效果

凝膠成像系統(tǒng)結(jié)果顯示，油菜不同生長(zhǎng)時(shí)期提取的DNA 擴(kuò)增效果無(wú)明顯差異，條帶亮度與Marker 接近，均清晰可讀（圖3）。

圖3 不同時(shí)期葉片堿煮法高通量提取的DNA 擴(kuò)增效果

2.3 油菜不同部位的DNA 提取效果

凝膠成像系統(tǒng)結(jié)果顯示，油菜植株不同部位提取的DNA 的擴(kuò)增效果無(wú)明顯差異，條帶亮度與Marker 接近，均清晰可讀（圖4）。

圖4 不同部位堿煮法高通量提取的DNA 擴(kuò)增效果

3 討論與結(jié)論

與傳統(tǒng)提取DNA 的方法相比，該試驗(yàn)方法有諸多優(yōu)點(diǎn)：一是不需要復(fù)雜多樣的有毒試劑，如三氯甲烷等；二是使用的儀器設(shè)備少，避免DNA 提取過(guò)程中的污染；三是操作簡(jiǎn)單、提取時(shí)間短，96 孔PCR 板提取完畢只需要20～30 min，大大提高了油菜群體基因型篩選和分子標(biāo)記輔助選擇的效率。

俎峰等[13]改良了傳統(tǒng)油菜DNA 提取方法，通過(guò)油菜雜交種深孔板內(nèi)發(fā)芽，簡(jiǎn)化堿裂解法提取DNA 步驟，配合高通量研磨器的使用，提供了快速高通量低成本獲取油菜雜交種子葉片DNA 樣品的集約化方案，提高了DNA 獲取效率，有利于利用分子標(biāo)記對(duì)雜交油菜種子進(jìn)行純度鑒定。該文在以上研究的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步優(yōu)化試驗(yàn)步驟，找到一種快速、高通量、低成本提取油菜DNA 的方法，并將其應(yīng)用到品種篩選及分子標(biāo)記輔助選擇中。

與以磁珠法為代表的傳統(tǒng)提取法相比較，該研究提供的堿煮法快速高通量提取的DNA 擴(kuò)增效果上并沒(méi)有明顯差異，對(duì)于簡(jiǎn)單的SSR 引物擴(kuò)增基本沒(méi)有影響，因此對(duì)于簡(jiǎn)單的基因分型和分子標(biāo)記輔助育種等試驗(yàn)來(lái)說(shuō)，堿煮法可以大大提高工作效率。

同時(shí)，通過(guò)對(duì)油菜不同時(shí)期不同部位提取的DNA 進(jìn)行擴(kuò)增，凝膠成像顯示并無(wú)明顯差異，因此堿煮法提取DNA 可以在油菜不同時(shí)期和不同部位應(yīng)用，進(jìn)一步提高了堿煮法的使用效率。