鄧曉顏王小蘭李 孟張 莉李玉賢*鄭曉珂馮衛(wèi)生

（1.河南中醫(yī)藥大學藥學院，河南 鄭州 450046；2.河南省中藥開發(fā)工程技術研究中心，河南 鄭州 450046）

懷菊花為菊科植物菊Chrysanthemum morifoliumRamat.的干燥頭狀花序，具有清熱解毒、清肝明目功效，為河南道地藥材四大懷藥之一［1］。課題組前期對懷菊花及其莖葉化學成分進行研究，發(fā)現(xiàn)大量黃酮類化合物［2-3］，并對其抗炎活性進行篩選［4-5］。

中藥具有多成分、多靶點、多途徑的特點，其有效部位是發(fā)揮療效的物質基礎，故如何富集以增強臨床療效是相關研究的關鍵［6］。黃酮作為懷菊花主要成分，具有抗氧化［7］、降血壓［8］作用，并且菊花清熱解毒功效與抗炎作用有一定相關性［9］，活性成分主要為黃酮［10］，故對其富集純化有助于挖掘藥材更多藥用價值。

目前，關于懷菊花總黃酮的研究主要集中在提取工藝、含量測定方面［11-12］，鮮有涉及純化方面。因此，本實驗采用AB-8 型大孔吸附樹脂［13］對懷菊花總黃酮進行富集純化，響應面法優(yōu)化工藝，并通過氧化型低密度脂蛋白（ox-LDL） 誘導的HUVECs增殖細胞模型來評價抗炎活性，HPLC 法來分析成分組成，以期為綜合開發(fā)該成分提供科學依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器 DZTW 型調溫電熱套（上海力辰邦西儀器科技有限公司）；NVP-1000 型隔膜真空泵、OSB-2000 型旋轉蒸發(fā)儀、A-1000S 型水流抽氣機、FDU-2110 型冷凍干燥機、CA-1116A 型冷卻水循環(huán)裝置（上海愛朗儀器有限公司）；SHH.W21.420型智能恒溫水箱（北京市長風儀器儀表公司）；EVOLUTION300 型紫外可見分光光度計（美國賽默飛世爾科技公司）；BSA224S 型電子天平［賽多利斯科學儀器（北京） 有限公司］；Forma 3111 細胞培養(yǎng)箱 （美國Thermo Fisher Scientific 公司）；TS100 倒置顯微鏡 （日本Nikon 公司）；Milli-Q Advantage A10 超純水儀（美國Millipore 公司）；全波長酶標儀（美國BioTek 公司）；Centrifuge-5804R小型高速低溫冷凍離心機（德國Eppendorf 公司）；SW-CJ-2FD 超凈工作臺（蘇州安泰空氣技術有限公司）。

1.2 試劑與藥物 蘆丁對照品（批號B20771，上海源葉生物科技有限公司）。亞硝酸鈉、硝酸鋁（天津市風船化學試劑科技有限公司）；氫氧化鈉（成都市科隆化學品有限公司）。AB-8 型吸附樹脂（滄州寶恩吸附材料科技有限公司）。ox-LDL （批號YB-002-1，廣州奕源生物科技有限公司）；IL-1β、IL-6、TNF-α ELISA 檢測試劑盒 （批號KE00021，KE00139，KE00154，武漢三鷹生物科技有限公司）；CCK-8 （批號CA1210）、青霉素-鏈霉素-慶大霉素混合溶液（批號P1410） （北京索萊寶科技有限公司）；DMEM （批號2338234，美國Gibco 公司）；胎牛血清（批號20010502，杭州四季青生物工程研究所）。其他試劑均為分析純。

1.3 細胞 人臍靜脈內皮細胞（HUVECs），由河南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院李強老師惠贈。

1.4 藥材 懷菊花購自河南綠禾藥業(yè)有限公司，經(jīng)河南中醫(yī)藥大學藥學院董誠明教授鑒定為菊科植物菊Chrysanthemum morifoliumRamat 的干燥頭狀花序。

2 方法與結果

2.1 總黃酮含量測定

2.1.1 粗提物制備 參考文獻［14］ 報道，稱取藥材20 g，以料液比1 ∶25 加入70%乙醇500 mL，加熱回流提取2 次，每次2 h，合并提取液，減壓回收乙醇，濃縮液冷凍干燥，即得，提取率為55.2%。

2.1.2 線性關系考察 精密稱取蘆丁對照品5 mg，70%乙醇溶解并定容至25 mL 量瓶中，分別精密量取0.5、1.5、2.5、3.5、5.5、7.5 mL 至25 mL 量瓶中，依次加入顯色劑亞硝酸鈉、硝酸鋁后定容，以70%乙醇為空白對照，在510 nm 波長處測定吸光度。以蘆丁質量濃度為橫坐標（X），吸光度為縱坐標 （A） 進行回歸，得方程為A＝11.621X+0.003 3 （r＝0.999 0），在0.004 0～0.060 0 mg／mL 范圍內線性關系良好。

2.1.3 測定方法 精密量取“2.1.1” 項下濃縮液2.5 mL 至25 mL 量瓶中，70%乙醇超聲溶解并定容，得到樣品溶液，量取10 mL 至25 mL 量瓶中，按“2.1.2” 項下方法顯色，測得總黃酮含量為14.015 mg／mL。

2.2 純化工藝優(yōu)化 在單因素試驗基礎上，采用Box-Behnken 響應面法。

2.2.1 大孔吸附樹脂預處理 參考文獻［15］ 報道，采用95%乙醇浸泡樹脂24 h 以上，充分溶脹后將漂浮雜質除去，濕法裝柱，95%乙醇沖柱至沖洗液無白色混濁，大量蒸餾水沖洗至無醇味。

2.2.3 單因素試驗 以上樣質量濃度、上樣液pH值、上樣量、乙醇解吸體積分數(shù)、水除雜體積、乙醇解吸體積為影響因素，考察它們對純化工藝的影響。（1） 上樣質量濃度，稱取6 份預先處理好的AB-8 型樹脂10 g，濕法裝柱，70%乙醇將濃縮液稀釋定容為含總黃酮0.12、0.36、0.56、0.67、0.83、1.46 mg／mL 的上樣液各25 mL，分別量取7 mL上樣，收集流出液；（2） 上樣液pH 值，分別配制pH 值為2、3、4、5、6、8 的0.56 mg／mL 總黃酮溶液，上樣，收集流出液；（3） 上樣量，配制pH 值為4 的0.56 mg／mL 總黃酮溶液，上樣2 BV，分別在0.4、0.8、1.2、1.6、2 BV 收集過柱液；（4） 乙醇解吸體積分數(shù)，配制pH 值為4 的0.56 mg／mL 總黃酮溶液，上樣0.9 BV，4 BV 蒸餾水除雜，分別用70%、80%、90%、95% 乙醇各2 BV 解吸，收集解吸液；（5） 水除雜體積，配制pH 值為4 的0.56 mg／mL 總黃酮溶液，上樣，分別用2、3、4、5、6 BV 蒸餾水除雜，2 BV 80%乙醇解吸，收集解吸液；（6） 乙醇解吸體積，配制pH 值為4 的0.56 mg／mL 總黃酮溶液，上樣，4 BV蒸餾水除雜，分別用0.5、1、2、3、4 BV 80%乙醇解吸，收集解吸液，結果見圖1。

圖1 單因素試驗結果Fig．1 Results of single factor tests

由此可知，吸附率、解吸率都隨著各影響因素增加先升后降，當上樣液質量濃度為0.56 mg／mL，pH 值為4 時，樹脂吸附飽和，吸附率達到最大。前期報道，當流出液中總黃酮質量濃度達到上樣液體積分數(shù)的10%時，即達到泄漏點［16］，而本實驗發(fā)現(xiàn)，上樣1.2 BV 時已超過泄漏點，故選取接近泄漏點的0.9 BV 作為最優(yōu)上樣量。另外，用4 BV水除雜，2 BV 80%乙醇解吸時，總黃酮解吸完全并不被稀釋，解吸率達到最大。最終，分別選擇80%、2 BV、4 BV 作為乙醇解吸體積分數(shù)、乙醇解吸體積、水除雜體積的響應面中心點。

2.2.4 Box-Behnken 響應面法 結合單因素試驗結果，選擇乙醇解吸體積分數(shù)（A）、乙醇解吸體積（B）、水除雜體積（C） 作為影響因素，解吸率（Y） 作為評價指標，設計三因素三水平試驗，具體見表1，結果見表2。

表1 因素水平Tab．1 Factors and levels

表2 試驗設計與結果Tab．2 Design and results of tests

采用Design-Expert 11.0 軟件對表2 數(shù)據(jù)進行二次多項式擬合，得方程為Y＝84.93+2.88A+10.26B+ 2.31C-0.256 3AB-3.28AC+ 4.34BC-12.86A2-20.56B2-5.74C2，結果見表3。由此可知，模型P＜0.01，具有高度顯著性；失擬項P＞0.05，表明是由隨機誤差引起的殘差［17］；確定系數(shù)R2＝0.933 2，AdjustedR2＝0.847 3，表明模型擬合程度較好，響應值變化有84.73%來源于影響因素；因素B、A2、B2有極顯著影響（P＜0.01）；各因素影響程度依次為B＞A＞C。

表3 方差分析Tab．3 Analysis of variance

響應面分析見圖2［18-19］。由此可知，因素B對解吸率的影響最大，A次之，C最小，與表2 結果一致；各因素交互項影響程度依次為BC＞AC＞AB。

圖2 各因素響應面圖Fig．2 Response surface plots for various factors

2.2.5 驗證試驗 按“2.2.4” 項下結果，得到最優(yōu)純化工藝為乙醇解吸體積分數(shù)80.73%，乙醇解吸體積2.28 BV，水除雜體積4.28 BV，考慮到實際可操作性，將其調整為乙醇解吸體積分數(shù)80%，乙醇解吸體積2 BV，水除雜體積4 BV。按優(yōu)化工藝進行3 批驗證試驗，測得平均解吸率為84.93%，與預測值86.80%接近；純化前總黃酮純度為11.74%，而純化后升至52.71%，表明該工藝穩(wěn)定可靠。

2.3 抗炎活性研究

2.3.1 細胞培養(yǎng)、分組及給藥 HUVECs 細胞復蘇后，用含10%胎牛血清的DMEM 高糖培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，設定溫度為37 ℃ （含5% CO2），分為對照組（正常培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h）、ox-LDL 組（正常培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h 后，150 μg／mL ox-LDL 處理24 h）、給藥組（500 μg／mL 總提物及25、50、100 μg／mL總黃酮含藥培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h 后，150 μg／mL ox-LDL 處理24 h），每組6 個復孔。

2.3.2 總黃酮對細胞增殖的影響 將HUVECs 細胞懸液接種于96 孔板（密度4.0×104／孔），細胞貼壁后更換無血清的培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h 使其生長同步化，分組并給藥24 h 后取上清液，加入100 μL新鮮培養(yǎng)基，再加入10 μL CCK-8 孵育4 h，在全波長酶標儀540 nm 波長處檢測吸光度，計算細胞增殖率［20］，公式為增殖率＝（實驗組吸光度／對照組吸光度） ×100%，結果見圖3。由此可知，與對照組比較，ox-LDL 組細胞增殖率降低（P＜0.01）；與ox-LDL 組比較，總提物、總黃酮組細胞增殖率升高（P＜0.05，P＜0.01），并且總黃酮組呈一定劑量依賴性。

圖3 懷菊花總黃酮對ox-LDL 誘導HUVECs 細胞增殖率的影響Fig．3 Effect of total flavonoids from Huai Chrysanthemum on proliferation rate of HUVECs cells induced by ox-LDL

2.3.3 總黃酮對炎癥因子水平的影響 將“2.3.2”項下細胞上清液在4 ℃下離心5 min 后，按照ELISA 試劑盒說明書檢測IL-1β （圖4A）、IL-6（圖4B）、TNF-α （圖4C） 水平，結果見圖4。由此可知，與對照組比較，ox-LDL 組IL-1β、IL-6、TNF-α 水平升高（P＜0.05，P＜0.01）；與ox-LDL組比較，總提物、100 μg／mL 總黃酮組IL-1β、IL-6 水平降低（P＜0.05，P＜0.01），總提物、不同劑量總黃酮組TNF-α 水平降低（P＜0.05，P＜0.01）。

圖4 懷菊花總黃酮對ox-LDL 誘導HUVECs 細胞炎癥因子水平的影響Fig．4 Effects of total flavonoids from Huai Chrysanthemum on inflammatory factor levels in HUVECs cells induced by ox-LDL

2.4 成分組成分析 采用HPLC 法。

2.4.1 色譜條件 Symmetry C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相乙腈 （A）-0.2% 磷酸（B），梯度洗脫 （0～5 min，11%～16% A；5～15 min，16%A；15～18 min，16%～19%A；18～30 min，19%A；30～35 min，19%～22% A；35～55 min，22%A；55～57 min，22%～28% A；57～70 min，28%A；70～95 min，28%～80%A）；體積流量1.0 mL／min；柱溫30 ℃；檢測波長270 nm；進樣量10 μL。

2.4.2 對照品溶液制備 取各對照品適量，置于10 mL 量瓶中，甲醇超聲溶解，定容，制成分別含101 μg／mL 木犀草苷、201 μg／mL 異綠原酸A、107 μg／mL 芹菜素-7-O-葡萄糖苷、759.05 μg／mL香葉木素-7-O-葡萄糖苷、796 μg／mL 木犀草素、663.48 μg／mL 金合歡素-7-O-葡萄糖苷、832 μg／mL芹菜素、762 μg／mL 香葉木素、855 μg／mL 金合歡素的貯備液，分別取0.5 mL，甲醇稀釋1 倍，過0.22 μm 微孔濾膜，即得。

2.4.3 供試品溶液制備 取純化后的總黃酮凍干粉約1 mg，置于錐形瓶中，加1 mL 甲醇溶解，搖勻，過0.22 μm 微孔濾膜，即得。

2.4.4 結果分析 取對照品、供試品溶液適量，在“2.4.1” 項色譜條件下進樣測定，通過比對色譜峰保留時間、紫外最大吸收波長結合相關文獻確認成分，結果見圖5，共發(fā)現(xiàn)9 種成分，包括8 種黃酮、1 種有機酸，分別為木犀草苷、芹菜素-7-O-葡萄糖苷、香葉木素-7-O-葡萄糖苷、木犀草素、金合歡素-7-O-葡萄糖苷、芹菜素、香葉木素、金合歡素、異綠原酸A。

圖5 各成分HPLC 色譜圖Fig．5 HPLC chromatograms of various constituents

3 討論與結論

在純化工藝中，上樣液濃度大、黏性增加、雜質增多、pH 過高或過低均會造成黃酮存在形式發(fā)生變化，從而影響大孔吸附樹脂吸附，并且在除雜、解吸時其用量過大也會將吸附上的黃酮解吸下來而造成損失。純化前，懷菊花總提物凍干粉呈偏黑褐色，易吸潮而變黏稠；純化后，它呈偏黃棕色，吸濕性降低，總黃酮純度明顯提高。

在前期研究基礎上，本實驗采用ox-LDL 誘導HUVECs 細胞損傷模型，評價懷菊花總提物及其總黃酮對HUVECs 細胞的保護作用。結果顯示，總黃酮可通過降低細胞炎性因子分泌來保護內皮細胞，具有潛在的抗動脈粥樣硬化活性，但其藥效和作用機制還有待通過體內藥理實驗作進一步研究。

目前，關于懷菊花所含成分含量測定的報道大多只涉及2020 年版《中國藥典》 規(guī)定的3 種指標成分［21］（綠原酸、木犀草苷、3，5-O-二咖啡?；鼘幩幔?，僅王月茹［22］測定了其他5 種黃酮含量。本實驗采用HPLC 法指認了懷菊花總黃酮中8 種黃酮、1 種有機酸，數(shù)量多于目前相關文獻所發(fā)表，可為該藥材開發(fā)利用提供參考依據(jù)，具有一定實際意義。