袁 航，尹麗華，陳安珍，殷世寧，吳愛(ài)英，盧京光

（青島市食品藥品檢驗(yàn)研究院，國(guó)家藥品監(jiān)督管理局海洋中藥質(zhì)量研究與評(píng)價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 青島 266071）

養(yǎng)陰清肺丸由地黃、麥冬、玄參、川貝母、白芍、牡丹皮、甘草、薄荷8 味藥材組成，具有養(yǎng)陰潤(rùn)燥、清肺利咽的功效，臨床上用于治療陰虛肺燥、咽喉干痛、干咳少痰或痰中帶血，現(xiàn)收載于2020 年版《中國(guó)藥典》 一部，有大蜜丸、小蜜丸、水蜜丸、水丸4 種規(guī)格［1］，但僅對(duì)丹皮酚進(jìn)行控制，而且目前相關(guān)文獻(xiàn)也僅涉及芍藥苷［2-4］。中藥復(fù)方制劑藥味眾多，組成復(fù)雜，僅以單一成分為指標(biāo)無(wú)法實(shí)現(xiàn)全面客觀評(píng)價(jià)其質(zhì)量的目的［5-7］，故本實(shí)驗(yàn)采用UPLC 法同時(shí)測(cè)定養(yǎng)陰清肺丸中哈巴苷、芍藥苷、甘草苷、毛蕊花糖苷、哈巴俄苷、丹皮酚、甘草酸的含量，以期為提高該制劑質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)提供理論依據(jù)、技術(shù)支撐。

1 材料

Agilent 1290 Infinity 快速高分離液相色譜儀（美國(guó)Agilent 公司）；ME204T／02 型電子天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；AS10200BT 型超聲波清洗器（天津奧特賽恩斯儀器有限公司）。哈巴苷（批號(hào)111729-201707，純度96.8%）、芍藥苷（批號(hào)110736-201943，純度 100%）、甘草苷 （批號(hào)111610-201908，純度95.0%）、毛蕊花糖苷（批號(hào)111530-201914，純度95.2%）、哈巴俄苷 （批號(hào)111730-201709，純度95.9%）、丹皮酚 （批號(hào)110708-201407，純度99.9%）、甘草酸銨 （批號(hào)110731-201720，純度97.7%） 對(duì)照品均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院。養(yǎng)陰清肺丸共96 批，由14個(gè)廠家生產(chǎn)，其中3 個(gè)廠家生產(chǎn)水蜜丸，共46 批；12 個(gè)廠家生產(chǎn)大蜜丸，共46 批；1 個(gè)廠家生產(chǎn)小蜜丸，共3 批；1 個(gè)廠家生產(chǎn)水丸，共1 批（由于1 個(gè)廠家同時(shí)生產(chǎn)大蜜丸、水蜜丸，1 個(gè)廠家同時(shí)生產(chǎn)大蜜丸、水丸，1 個(gè)廠家同時(shí)生產(chǎn)大蜜丸、小蜜丸，故有交叉現(xiàn)象）。乙腈為色譜純 （美國(guó)Thermo Fisher Scientific 公司）；其余試劑均為分析純（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；水為純凈水（杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件、系統(tǒng)適用性考察 Agilent SB-C18色譜柱（4.6 mm×100 mm，2.7 μm），以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；流動(dòng)相乙腈（A）-0.1%磷酸（B），梯度洗脫 （0～3 min，3% A；3～16 min，3%～16%A；16～20 min，16%A；20～26 min，16%～25% A；26～31 min，25%～30% A；31～33 min，30%～37%A；33～38 min，37%～42%A；38～40 min，42%～45%A；40～45 min，45%～100%A）；體積流量1.0 mL／min；柱溫30 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)210 nm （0～8 min，哈巴苷）、230 nm （8～18 min，芍藥苷）、278 nm （18～21 min，甘草苷）、332 nm （21～27 min，毛蕊花糖苷）、278 nm（27～33 min，哈巴俄苷、丹皮酚）、252 nm （33～45 min，甘草酸銨）；進(jìn)樣量4 μL。

2.2 對(duì)照品溶液制備 精密稱取哈巴苷、芍藥苷、甘草苷、毛蕊花糖苷、哈巴俄苷、丹皮酚、甘草酸銨對(duì)照品適量，70%甲醇制成每1 mL 分別含435、883.75、255、135、146、1 036.67、711 μg 上述成分的貯備液，分別精密吸取適量，70%甲醇制成適宜質(zhì)量濃度，即得（甘草酸含量＝甘草酸銨含量／1.020 7）。

2.3 供試品溶液制備 取本品（水蜜丸或水丸）適量，研成細(xì)粉，取約1.5 g，精密稱定；另取重量差異項(xiàng)下的大蜜丸或裝量差異項(xiàng)下的小蜜丸，剪碎，取約2.5 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇25 mL，密塞，稱定質(zhì)量，超聲（功率250 W，頻率33 kHz） 處理30 min，放冷，70%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.4 陰性樣品溶液制備 按本品處方比例，分別制成缺白芍和牡丹皮、缺地黃和玄參、缺甘草、缺玄參、缺白芍的陰性樣品，按“2.3” 項(xiàng)下方法制備，即得。

2.5 專屬性試驗(yàn) 取對(duì)照品、供試品、陰性樣品溶液各4 μL，在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)圖1。由此可知，陰性樣品在與對(duì)照品色譜峰相應(yīng)位置處無(wú)吸收峰，表明其他成分對(duì)測(cè)定結(jié)果無(wú)影響，該方法專屬性良好。

圖1 各成分HPLC 色譜圖Fig．1 HPLC chromatograms of various constituents

2.6 線性關(guān)系考察 精密吸取“2.2” 項(xiàng)下貯備液適量，甲醇逐級(jí)稀釋成5 個(gè)質(zhì)量濃度，在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定。以對(duì)照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y） 進(jìn)行回歸，并分別以信噪比S／N＝3、S／N＝10 時(shí)的質(zhì)量濃度為檢出限、定量限，結(jié)果見(jiàn)表1，可知各成分在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表1 各成分線性關(guān)系Tab．1 Linear relationships of various constituents

2.7 精密度試驗(yàn) 取對(duì)照品溶液適量，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定6 次，測(cè)得哈巴苷、芍藥苷、甘草苷、毛蕊花糖苷、哈巴俄苷、丹皮酚、甘草酸峰面積RSD 分別為1.48%、0.14%、0.27%、0.17%、0.26%、0.16%、0.15%，表明儀器精密度良好。

2.8 重復(fù)性試驗(yàn) 取水蜜丸（批號(hào)17035288）、大蜜丸（批號(hào)18010541） 適量，按“ 2.3” 項(xiàng)下方法分別制備6 份供試品溶液，在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得水蜜丸中哈巴苷、芍藥苷、甘草苷、毛蕊花糖苷、哈巴俄苷、丹皮酚、甘草酸含量 RSD 分別為 1.10%、1.51%、0.65%、0.77%、0.49%、0.98%、0.51%，大蜜丸中其含量RSD 分別為1.60%、1.69%、0.94%、0.51%、0.30%、0.75%、0.12%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.9 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取“2.8” 項(xiàng)下水蜜丸、大蜜丸供試品溶液各1 份，于0、2、8、10、12、24 h在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得水蜜丸中哈巴苷、芍藥苷、甘草苷、毛蕊花糖苷、哈巴俄苷、丹皮酚、甘草酸峰面積RSD 分別為1.05%、0.59%、0.97%、1.01%、1.14%、0.48%、0.55%，大蜜丸中其峰面積RSD 分別為1.41%、0.86%、0.99%、1.03%、1.47%、0.83%、0.64%，表明溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.10 加樣回收率試驗(yàn)

2.10.1 水蜜丸 取粉碎后的本品 （批號(hào)17035288） 約0.75 g，精密稱定，精密加入對(duì)照品溶液（未稀釋） 適量，按“2.3” 項(xiàng)下方法制備6 份供試品溶液，在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算回收率。結(jié)果，哈巴苷、芍藥苷、甘草苷、毛蕊花糖苷、哈巴俄苷、丹皮酚、甘草酸平均加樣回收率分別為 103.05%、103.51%、100.61%、97.81%、101.06%、95.67%、101.40%，RSD 分別為 1.94%、2.14%、2.92%、1.45%、1.17%、1.83%、1.46%。

2.10.2 大蜜丸 取剪碎的本品（批號(hào)18010541）約1.25 g，精密稱定，精密加入對(duì)照品溶液（未稀釋） 適量，按“2.3” 項(xiàng)下方法制備6 份供試品溶液，在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算回收率。結(jié)果，哈巴苷、芍藥苷、甘草苷、毛蕊花糖苷、哈巴俄苷、丹皮酚、甘草酸平均加樣回收率分別為 103.46%、104.24%、100.17%、95.97%、102.65%、95.41%、101.31%，RSD 分別為0.83%、1.97%、2.62%、0.76%、2.43%、2.33%、2.35%。

2.11 樣品含量測(cè)定 取46 批樣品，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算含量，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 各成分含量測(cè)定結(jié)果（mg／g）Tab．2 Results of content determination of various constituents （mg／g）

3 討論

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，哈巴苷、哈巴俄苷、芍藥苷、毛蕊花糖苷、丹皮酚、甘草苷最大吸收波長(zhǎng)分別為210、282、230、332、274、278、252 nm，由于要使每種成分都處在最佳檢測(cè)波長(zhǎng)下，故采用分段變換波長(zhǎng)法。另外，丹皮酚、哈巴俄苷色譜峰保留時(shí)間、最大吸收波長(zhǎng)相近，故在278 nm 處對(duì)兩者進(jìn)行檢測(cè)。

前期報(bào)道，哈巴苷、哈巴俄苷歸屬于玄參，芍藥苷歸屬于白芍、牡丹皮［8］，丹皮酚歸屬于牡丹皮，毛蕊花糖苷歸屬于地黃［9］、玄參［10］，甘草苷、甘草酸歸屬于甘草。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，投料質(zhì)量較差的藥味主要涉及玄參、地黃，1 家企業(yè)全部3 批大蜜丸均未檢測(cè)出哈巴苷、哈巴俄苷，其中1 批未檢出毛蕊花糖苷，1 批含量較低，僅1 批含量處于中上游水平，提示該廠家應(yīng)關(guān)注上述2 種藥材的投料風(fēng)險(xiǎn)；1 家企業(yè)全部3 批樣品均未檢出哈巴苷，并且哈巴俄苷含量均較低，而毛蕊花糖苷含量均處于正常水平，研究表明，不同產(chǎn)地玄參中哈巴苷、哈巴俄苷含量差異較大，大多數(shù)是前者高于后者，也有少數(shù)恰好相反［11-13］，提示該廠家需關(guān)注該藥材投料風(fēng)險(xiǎn)。

甘草中黃酮類（如甘草苷等）、三萜類（如甘草酸等） 化合物含量較高，為該藥材主要藥效成分［14］。研究表明，甘草中甘草苷、甘草酸含量與基原［15-16］、產(chǎn)地［17］、生長(zhǎng)年限［18］相關(guān)，而本實(shí)驗(yàn)中不同企業(yè)或同一企業(yè)不同批次樣品中兩者含量差異較大，與上述文獻(xiàn)報(bào)道一致。另外，1 家企業(yè)5批水蜜丸中甘草苷含量均處于較低水平，12 批樣品中甘草酸含量亦然，提示該廠家在后續(xù)生產(chǎn)中應(yīng)關(guān)注該藥材質(zhì)量風(fēng)險(xiǎn)。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)采用HPLC 法同時(shí)測(cè)定養(yǎng)陰清肺丸中哈巴苷、芍藥苷、甘草苷、毛蕊花糖苷、哈巴俄苷、丹皮酚、甘草酸的含量，該方法簡(jiǎn)便快速，專屬性強(qiáng)，可有效實(shí)現(xiàn)對(duì)白芍、地黃、玄參、甘草、牡丹皮投料情況的考察，從而為該制劑質(zhì)量控制提供理論依據(jù)、技術(shù)支撐。