王紀(jì)坤 安鋒 周立軍 彭文濤 程琳琳 謝貴水

關(guān)鍵詞：鄰苯二甲酸；橡膠樹；種子萌發(fā)；生長(zhǎng)

橡膠樹（HeveabrasiliensisMuell.Arg.）是我國(guó)熱區(qū)最大的經(jīng)濟(jì)樹種，其割膠產(chǎn)生的天然橡膠在通用性能和抗撕裂性能方面顯著優(yōu)于合成橡膠，是重要的工業(yè)原料和戰(zhàn)略資源[1]。我國(guó)從20世紀(jì)50年代開始種植橡膠樹，目前種植面積約為113.3萬(wàn)hm2、年產(chǎn)天然橡膠約80萬(wàn)t[2]，但由于橡膠樹多年連作與多代種植，膠園已出現(xiàn)土壤酸化嚴(yán)重、地力衰減、根病面積擴(kuò)大[3-5]、單位面積產(chǎn)量下降等連作問題，影響了天然橡膠產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展，威脅到我國(guó)天然橡膠生產(chǎn)的戰(zhàn)略安全。

化感作用是指植物通過適當(dāng)?shù)耐緩较颦h(huán)境釋放特定的化學(xué)物質(zhì)，從而直接或間接影響鄰近或后續(xù)同種或是不同種植物萌發(fā)和生長(zhǎng)的效應(yīng)[6]，如果化感物質(zhì)的供體和受體是同一種植物，且對(duì)該植物的生長(zhǎng)發(fā)育產(chǎn)生不利影響，則這種現(xiàn)象被稱為自毒作用，是化感作用的一種特殊形式[7-8]。自毒作用是植物連作障礙形成的主要原因之一。有研究指出，酚酸類化合物是目前公認(rèn)的自毒物質(zhì)，會(huì)對(duì)植物細(xì)胞膜的通透性、酶的含量與活性、礦物質(zhì)元素的吸收與利用、蛋白質(zhì)和核酸的代謝、光合作用等生理活動(dòng)產(chǎn)生負(fù)面影響[8]。

鄰苯二甲酸是酚酸類物質(zhì)中最具代表性的化感物質(zhì)，也是橡膠樹根系分泌物的含量較高的物質(zhì)之一[9-10]。已有研究顯示鄰苯二甲酸能夠抑制萵苣和小豆根生長(zhǎng)[11-12]，而對(duì)蘿卜、辣椒種子萌發(fā)及幼苗生長(zhǎng)的影響表現(xiàn)為“低促高抑”[13-14]；還能導(dǎo)致燕麥、玉米以及百合幼苗膜脂過氧化，抑制幼苗生物量增加[15-17]。目前其對(duì)橡膠樹種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)等方面影響的研究未見報(bào)道。因此，為明確鄰苯二甲酸對(duì)橡膠樹是否存在自毒作用，本研究以橡膠樹RRIM600種子和幼苗為試驗(yàn)材料，采用外源鄰苯二甲酸模擬研究其對(duì)橡膠樹種子萌發(fā)、幼苗生長(zhǎng)和生理指標(biāo)的影響，探索橡膠樹自毒作用效應(yīng)，以期為客觀評(píng)價(jià)鄰苯二甲酸對(duì)橡膠樹自毒作用危害提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)支撐，進(jìn)而為橡膠樹連作障礙機(jī)制提供化感方面的理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

供試橡膠樹品種為RRIM600，種子采自中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院橡膠研究所種質(zhì)圃；鄰苯二甲酸為分析純，由國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司提供。

1.2方法

1.2.1種子發(fā)芽與幼苗生長(zhǎng)試驗(yàn)試驗(yàn)于2021年8—9月在中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院橡膠研究所實(shí)驗(yàn)室內(nèi)進(jìn)行，選取健康種子30粒，使用高錳酸鉀進(jìn)行消毒，然后放在鋪有3層濾紙的培養(yǎng)皿中，加入不同濃度的鄰苯二甲酸溶液（分別為0.05、0.50、1.00、2.00mmol/L），以加蒸餾水為對(duì)照，每個(gè)處理3次重復(fù)，然后將培養(yǎng)皿放置在溫度25℃、濕度70%的人工氣候箱中浸種培養(yǎng)，光周期為13h光照/11h暗室，每天補(bǔ)充相應(yīng)浸提液，保持濾紙濕潤(rùn)，連續(xù)浸種20d，每天9：00記錄種子萌發(fā)數(shù)量。

經(jīng)上述處理后得到的橡膠苗，再繼續(xù)培養(yǎng)10d后，測(cè)定芽長(zhǎng)、根長(zhǎng)、苗鮮重、根鮮重等指標(biāo)，每個(gè)處理3次重復(fù)，每個(gè)重復(fù)選5株，并取樣品葉片在室內(nèi)測(cè)定其他生理指標(biāo)。

1.2.2生理指標(biāo)測(cè)定葉綠素（Chl）和類胡蘿卜素含量參考高俊鳳[18]的方法進(jìn)行測(cè)定。丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量采用硫代巴比妥酸法測(cè)定；可溶性糖含量采用蒽酮比色法測(cè)定；脯氨酸（proline，Pro）含量使用酸性茚三酮比色法測(cè)定；超氧化物歧化酶（superoxidedismutase，SOD）活性采用氮藍(lán)四唑法測(cè)定；過氧化物酶（peroxidase，POD）活性采用愈創(chuàng)木酚法測(cè)定；過氧化氫酶（catalase，CAT）活性采用紫外吸收法測(cè)定[19]。

1.3數(shù)據(jù)處理

種子發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽指數(shù)采用以下公式計(jì)算：

種子發(fā)芽率=發(fā)芽種子數(shù)/供試種子數(shù)×100%發(fā)芽勢(shì)=發(fā)芽高峰期種子數(shù)/供試種子數(shù)×100%

發(fā)芽指數(shù)（GI）=Σ（Gt/Dt）式中，Gt為發(fā)芽第ｔ天時(shí)的發(fā)芽數(shù)，Dt為相應(yīng)的發(fā)芽天數(shù)[20]。

采用Excel2016軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)整理，通過SPSS25軟件進(jìn)行單因素方差分析和Duncans多重樣本差異顯著性分析（P<0.05），利用Origin2016軟件作圖。

2結(jié)果與分析

2.1鄰苯二甲酸對(duì)橡膠樹種子萌發(fā)的影響

從圖1可以看出，鄰苯二甲酸均延緩了種子初始萌發(fā)時(shí)間，降低了種子發(fā)芽率。不同處理的橡膠樹種子初始發(fā)芽時(shí)間不同，對(duì)照種子在浸種后7d開始發(fā)芽，而鄰苯二甲酸處理的種子在浸種后9d才開始發(fā)芽；隨著浸種時(shí)間的增加，各處理的橡膠樹種子的發(fā)芽率逐漸增加，在浸種的20d后發(fā)芽率達(dá)到最高；整個(gè)發(fā)芽試驗(yàn)期間，對(duì)照種子發(fā)芽率始終高于所有鄰苯二甲酸浸種處理。說明所有濃度鄰苯二甲酸對(duì)橡膠樹種子萌發(fā)均存在抑制作用。

由表1可以看出，橡膠樹種子發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽指數(shù)和發(fā)芽速率均隨鄰苯二甲酸濃度升高呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，且各指標(biāo)均顯著低于對(duì)照，表明0.05～2.00mmol/L鄰苯二甲酸顯著抑制橡膠樹種子萌發(fā)；不同濃度鄰苯二甲酸處理的種子發(fā)芽率比對(duì)照分別下降了6.94%、19.40%、19.40%、23.60%，發(fā)芽勢(shì)比對(duì)照分別下降了32.61%、28.26%、50.00%、58.69%，發(fā)芽指數(shù)比對(duì)照分別下降了23.46%、28.13%、37.67%、42.75%，發(fā)芽速率比對(duì)照分別下降了17.20%、24.33%、31.39%、37.18%。由此可見，不同濃度鄰苯二甲酸均對(duì)橡膠樹種子發(fā)芽率、萌發(fā)速率和萌發(fā)的整齊度產(chǎn)生抑制作用，且濃度越高抑制作用越強(qiáng)。

2.2鄰苯二甲酸對(duì)橡膠樹生長(zhǎng)的影響

由表2可以看出，0.05～2.00mmol/L的鄰苯二甲酸處理均不同程度抑制芽長(zhǎng)、芽基徑、根粗的生長(zhǎng)，并減少了幼苗生物量的積累，所有生長(zhǎng)指標(biāo)在鄰苯二甲酸達(dá)到2.00mmol/L降至最低。與對(duì)照相比芽長(zhǎng)下降12.91%～40.70%、芽基徑下降20.05%～21.59%、根粗下降7.89%～34.13%、芽重下降16.18%～26.47%、根重下降20.00%～36.00%，但不同濃度鄰苯二甲酸處理間的芽基徑、芽重和根重等指標(biāo)差異不顯著。與對(duì)照相比，0.05mmol/L的鄰苯二甲酸處理促進(jìn)了根的伸長(zhǎng)，當(dāng)鄰苯二甲酸濃度達(dá)到1.00mmol/L時(shí)，開始抑制根的伸長(zhǎng)，且濃度越高抑制作用越強(qiáng)。所有生長(zhǎng)指標(biāo)在2.00mmol/L時(shí)達(dá)到最低。上述結(jié)果表明，鄰苯二甲酸抑制橡膠樹幼苗芽的伸長(zhǎng)和生物量積累，降低了芽基徑和根粗的生長(zhǎng)，而對(duì)根長(zhǎng)生長(zhǎng)的影響表現(xiàn)為“低促高抑”，且2.00mmol/L鄰苯二甲酸對(duì)幼苗生長(zhǎng)抑制作用最大。

2.3鄰苯二甲酸對(duì)橡膠樹幼苗色素含量的影響

如圖2所示，除葉綠素a外，橡膠樹葉片其他色素含量隨鄰苯二甲酸處理濃度的增加表現(xiàn)為先增加后減少的趨勢(shì)。0.05mmol/L的鄰苯二甲酸處理幼苗葉綠素a顯著下降，比對(duì)照降低21.18%，葉綠素b顯著升高，并達(dá)到峰值，比對(duì)照增加58.01%，葉綠素總量和類胡蘿卜素含量無(wú)顯著變化；當(dāng)鄰苯二甲酸濃度達(dá)到0.50mmol/L時(shí)，葉綠素a、葉綠素總量與類胡蘿卜素含量達(dá)到峰值，與對(duì)照相比，葉綠素a增加37.78%，葉綠素總量增加33.92%、類胡蘿卜素增加29.06%；當(dāng)濃度達(dá)到1.00mmol/L時(shí)，葉綠素a、葉綠素b、葉綠素總量與類胡蘿卜素含量均下降，至2.00mmol/L時(shí)所有色素含量降至最低。這些結(jié)果說明，0.05mmol/L與0.50mmol/L鄰苯二甲酸誘導(dǎo)葉綠素和類胡蘿卜素含量的增加，進(jìn)行補(bǔ)償生長(zhǎng)，提高光能利用效率；1.00mmol/L和2.00mmol/L鄰苯二甲酸處理導(dǎo)致色素結(jié)構(gòu)被破壞，色素含量下降，抑制幼苗光合作用。

2.4鄰苯二甲酸對(duì)橡膠樹丙二醛和滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量的影響

由圖3可見，鄰苯二甲酸對(duì)橡膠樹幼苗丙二醛和滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量變化均隨處理濃度增加基本上呈現(xiàn)逐漸增加的趨勢(shì)。不同濃度鄰苯二甲酸處理的橡膠樹MDA含量均顯著高于對(duì)照，2.0mmol/L鄰苯二甲酸處理的MDA含量最高，比對(duì)照高50.95%。說明鄰苯二甲酸使幼苗細(xì)胞中發(fā)生膜脂過氧化作用，且隨處理濃度增加膜脂過氧化程度逐漸增加。

由圖3可見，不同濃度鄰苯二甲酸處理均顯著促進(jìn)橡膠樹游離脯氨酸含量的增加，2.00mmol/L鄰苯二甲酸處理的游離脯氨酸含量最高，比對(duì)照高71.91%。0.05mmol/L鄰苯二甲酸處理的可溶性糖與對(duì)照差異不顯著，當(dāng)鄰苯二甲酸濃度超過0.50mmol/L時(shí)，可溶性糖均不同程度增加（P<0.05），2.0mmol/L鄰苯二甲酸處理的可溶性糖含量最高，比對(duì)照高35.32%。這說明游離脯氨酸在0.05mmol/L鄰苯二甲酸脅迫處理時(shí)產(chǎn)生響應(yīng)，當(dāng)濃度達(dá)到0.50moml/L后，游離脯氨酸和可溶性糖共同產(chǎn)生響應(yīng)，且游離脯氨酸響應(yīng)鄰苯二甲酸脅迫的啟動(dòng)濃度低于可溶性糖。

2.5鄰苯二甲酸對(duì)橡膠樹幼苗酶活性的影響

由圖4可見，橡膠樹SOD、POD活性隨鄰苯二甲酸處理濃度增加而逐漸減少，1.00mmol/L與2.00mmol/L鄰苯二甲酸處理橡膠樹SOD活性顯著低于對(duì)照（P<0.05），0.50、1.00、2.00mmol/L鄰苯二甲酸處理橡膠樹POD活性顯著低于對(duì)照；CAT活性隨鄰苯二甲酸處理濃度增加而先增加后減少，0.05、0.50mmol/L鄰苯二甲酸處理橡膠樹CAT活性均顯著高于對(duì)照，CAT活性峰值均為0.05mmol/L，其活性比對(duì)照高80.15%；當(dāng)鄰苯二甲酸濃度達(dá)到2.00mmol/L時(shí)，所有酶活性均降至最低。上述結(jié)果表明，在低濃度鄰苯二甲酸脅迫過程中，SOD、POD活性受到抑制，CAT活性未完全受到抑制，CAT在抵御鄰苯二甲酸脅迫作用明顯；但高濃度鄰苯二甲酸抑制所有酶活性，且2.00mmol/L對(duì)所有酶活性影響最大。

3討論

植物的自毒作用一般會(huì)對(duì)同種或同類植物的生長(zhǎng)發(fā)育和器官建成具有抑制作用。種子萌發(fā)和植株生長(zhǎng)對(duì)外界環(huán)境脅迫較為敏感，常被作為鑒定植物自毒作用的生物指標(biāo)。鄰苯二甲酸是橡膠樹根系分泌的主要次生代謝產(chǎn)物之一，已被證明是一種典型的酚酸類自毒物質(zhì)。本研究結(jié)果表明，0.05～2.00mmol/L鄰苯二甲酸脅迫的橡膠樹種子發(fā)芽率和幼苗植株鮮重顯著減少，說明鄰苯二甲酸對(duì)橡膠樹種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)存在抑制作用。這與前人觀察到鄰苯二甲酸對(duì)小豆、玉米、馬鈴薯[21-23]等作物種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)的抑制作用的研究結(jié)果一致。種子在萌發(fā)過程中內(nèi)部發(fā)生復(fù)雜的物質(zhì)代謝和酶促反應(yīng)。鄰苯二甲酸抑制橡膠樹種子萌發(fā)機(jī)制可能是影響種子內(nèi)部的物質(zhì)代謝及代謝關(guān)鍵酶的活性，使種子發(fā)生劣變、活力下降，進(jìn)而導(dǎo)致種子初始萌發(fā)時(shí)間延后，發(fā)芽率下降的關(guān)鍵因素。該機(jī)制在蘇文楨等[13]發(fā)現(xiàn)的鄰苯二甲酸能夠抑制辣椒種子活力，降低其發(fā)芽率中得到印證。

葉綠素是光合作用的主要色素，其含量水平是植物受到脅迫的特征指標(biāo)之一。類胡蘿卜素是輔助色素，被認(rèn)為是低分子量的抗氧化劑，具有淬滅活性氧的作用，保證葉綠體正常的光電子傳遞。非生物脅迫環(huán)境下，植株中葉綠素含量減少，光合膜透性急劇增加，光合膜受損加劇，由于膜的損傷促使葉綠素分子從葉綠素復(fù)合蛋白中暴露，更容易與O2接觸，促使活性氧生成，加劇光合色素的降解和光合機(jī)構(gòu)的損傷，使植株光合能力下降[24]。本研究中，低濃度鄰苯二甲酸誘導(dǎo)幼苗提高葉片葉綠素含量和類胡蘿卜素，隨著鄰苯二甲酸濃度增加，脅迫加劇，葉綠素含量和類胡蘿卜素逐漸降低，并呈現(xiàn)不可逆的趨勢(shì)。說明橡膠樹在低濃度鄰苯二甲酸脅迫時(shí)，通過積累幼苗葉綠素含量，提高光能利用效率，進(jìn)行補(bǔ)償生長(zhǎng)，同時(shí)提高類胡蘿卜素含量來(lái)淬滅過多的活性氧，避免對(duì)葉綠體膜結(jié)構(gòu)的傷害，維持葉片的光合作用；但隨著鄰苯二甲酸濃度升高，橡膠樹自身調(diào)節(jié)機(jī)制減弱，保護(hù)系統(tǒng)失調(diào)，導(dǎo)致葉綠素和類胡蘿卜素酶合成緩慢或快速分解，光合作用下降。這與鄰苯二甲酸對(duì)辣椒葉片葉綠素含量影響的結(jié)果相似[13]。

MDA是細(xì)胞中發(fā)生膜脂過氧化的最終分解產(chǎn)物，其含量水平可作為逆境條件下細(xì)胞內(nèi)發(fā)生膜脂過氧化損傷的指標(biāo)[25]。鄰苯二甲酸脅迫下，橡膠樹幼苗MDA含量顯著增加，表明膜質(zhì)過氧化傷害加劇，這與BAI等[26]在海棠幼苗結(jié)果一致，說明鄰苯二甲酸對(duì)光合膜和細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)形成傷害。此外，前人研究顯示MDA含量的增加與非生物脅迫后O2?和H2O2含量的增加有關(guān)[27]，鄰苯二甲酸脅迫導(dǎo)致MDA的增加可能觸發(fā)橡膠樹產(chǎn)生活性氧自由基（ROS）并誘導(dǎo)氧化應(yīng)激，破壞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致細(xì)胞完整性喪失。滲透調(diào)節(jié)是植物抵御逆境脅迫的一種適應(yīng)性反應(yīng)，是一種重要的耐脅迫機(jī)制。植物通過積累滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)來(lái)調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)滲透勢(shì)、維持平衡水勢(shì)，以維持正常的細(xì)胞功能和新陳代謝[14，28]。脯氨酸與可溶性糖是植物的2種重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)。本研究觀察到，0.05mmol/L鄰苯二甲酸脅迫時(shí)脯氨酸增加，當(dāng)鄰苯二甲酸達(dá)到0.50mmol/L后，脯氨酸與可溶性糖含量均顯著增加，表明橡膠樹通過積累游離脯氨酸與可溶性糖來(lái)調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)滲透勢(shì)，維持水分平衡及細(xì)胞膜的穩(wěn)定性，而脯氨酸受鄰苯二甲酸脅迫啟動(dòng)濃度低于可溶性糖。

正常生長(zhǎng)條件下，細(xì)胞內(nèi)氧自由基的產(chǎn)生和消除存在動(dòng)態(tài)平衡。生物與非生物脅迫會(huì)導(dǎo)致活性氧的形成，活性氧增多會(huì)影響膜的通透性，損壞DNA和蛋白質(zhì)，誘導(dǎo)膜脂過氧化，并最終導(dǎo)致程序性細(xì)胞死亡。SOD、CAT、POD是植物重要的抗氧化保護(hù)酶系統(tǒng)，通過提高抗氧化酶活性來(lái)清除過量活性氧，從而抵御逆境脅迫[29-30]。本研究觀察到，0.05、0.50mmol/L鄰苯二甲酸脅迫顯著抑制SOD、POD活性，促進(jìn)CAT活性，膜脂過氧化，幼苗體內(nèi)活性未能及時(shí)得到清除，膜結(jié)構(gòu)受損，MDA含量增加；當(dāng)鄰苯二甲酸處理濃度達(dá)到1.00mmol/L后，抗氧化酶系統(tǒng)被破壞，SOD、POD、CAT活性均降低，體內(nèi)活性氧含量增加，膜質(zhì)過氧化程度加劇。這與耿廣東等[12]、郭偉等[15]在辣椒和燕麥的研究結(jié)果一致。

總之，鄰苯二甲酸抑制橡膠樹幼苗生長(zhǎng)發(fā)育機(jī)制可能是鄰苯二甲酸脅迫導(dǎo)致橡膠樹產(chǎn)生活性氧，影響了細(xì)胞代謝活動(dòng)和生理功能，使幼苗生長(zhǎng)受到抑制；盡管幼苗在低濃度鄰苯二甲酸脅迫下通過增加CAT活性來(lái)清除活性氧，并提高光合色素含量進(jìn)行光合補(bǔ)償生長(zhǎng)以及增加滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)平衡滲透勢(shì)，但這只能緩解鄰苯二甲酸脅迫的影響，卻不能夠消除鄰苯二甲酸引起的所有傷害；高濃度鄰苯二甲酸脅迫下，幼苗色素含量降低，光合作用補(bǔ)償生長(zhǎng)消失，抗氧化酶系統(tǒng)遭到破壞，酶活性下降，細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)遭到破壞，活性氧急劇增加，幼苗生長(zhǎng)進(jìn)一步受到抑制。

綜上所述，鄰苯二甲酸積累推遲了橡膠樹RRIM600種子初始萌發(fā)時(shí)間，降低種子萌發(fā)率和萌發(fā)速率，導(dǎo)致橡膠樹幼苗物質(zhì)代謝和生理功能紊亂，并抑制生長(zhǎng)發(fā)育，具有化感自毒作用。本試驗(yàn)僅研究橡膠樹種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)發(fā)育的影響，關(guān)于其對(duì)橡膠樹膠乳產(chǎn)量的影響還有待于進(jìn)一步研究。