李婧怡 駢永茹 嚴廷良 楊陽 李勤奮 李玉

關鍵詞：巨大側耳；不同溫型；營養(yǎng)需求；生長條件；生物量

巨大側耳[Pleurotusgiganteus（Berk.）Karun.&K.D.Hyde]，又名大杯蕈、巨大香菇、豬肚菇，是國內(nèi)新開發(fā)的一種珍稀食藥用菌[1-2]。其營養(yǎng)豐富、口味獨特，具有抗腫瘤、抗氧化、降低肝損傷等多種藥用功能，備受消費者青睞，具有較高的潛在市場價值[3]。巨大側耳的纖維素降解能力強、環(huán)境適應性高、栽培技術相對簡單，逐步引起食用菌生產(chǎn)者的重視，其栽培規(guī)模不斷擴大，目前已涵蓋浙江、山東、北京、上海、云南、廣東、福建、海南等多個?。ㄊ校4]。熱帶地區(qū)年平均氣溫較高，對食用菌出菇溫度要求嚴格，但多數(shù)食藥用菌屬于中低溫型，如雙孢菇（16～18℃）[5]、金針菇（10～15℃）[6]、黑木耳（20～25℃）[7]等，適合熱區(qū)規(guī)?；耘嗟氖秤镁N類相對較少。研究發(fā)現(xiàn)，野生巨大側耳多于夏末秋初的炎熱季節(jié)出現(xiàn)，主要分布于我國華中、華南地區(qū)，以及東南亞和大洋洲等熱帶及亞熱帶地區(qū)，人工栽培時也適宜在氣溫較高的夏季出菇，對于解決食用菌生產(chǎn)淡季和調(diào)節(jié)市場供應具有一定意義，特別是為熱區(qū)食用菌產(chǎn)業(yè)發(fā)展提供新機遇[8]。

種質(zhì)資源是食用菌研究的基礎，高質(zhì)量的菌種在食用菌產(chǎn)業(yè)中至關重要[9]。近年來，隨著溫室效應的不斷加劇，高溫已成為限制食用菌在熱區(qū)栽培的主要因素，耐高溫菌株的選育十分迫切。課題組通過前期在熱區(qū)進行巨大側耳的規(guī)模化栽培，篩選到2株具有不同出菇溫型的巨大側耳菌株，中溫型菌株PG79的適宜出菇溫度為22～24℃，適合熱區(qū)的涼季（干季）栽培；高溫型菌株PG46可耐受25℃以上高溫，適宜出菇溫度為26～30℃，適合熱區(qū)的熱季（濕季）栽培。不同溫型巨大側耳菌株的獲得，為我國熱區(qū)全年栽培巨大側耳提供了寶貴材料。

菌絲階段是食用菌生長發(fā)育的重要階段，菌絲體培養(yǎng)質(zhì)量的優(yōu)劣直接影響食用菌出菇產(chǎn)量的高低[10]。因此，探究2株不同溫型巨大側耳菌絲體生長的營養(yǎng)需求和環(huán)境條件，對巨大側耳的擴大化培養(yǎng)和穩(wěn)定栽培至關重要。本研究采用單因素和正交試驗的方法，對不同溫型巨大側耳菌株進行生物學特性分析和液體發(fā)酵條件優(yōu)化，并對液體發(fā)酵中菌絲體生長的動態(tài)變化規(guī)律進行研究，旨在獲得巨大側耳菌絲體生長的最佳培養(yǎng)基配方和培養(yǎng)條件，以及不同溫型菌株間的營養(yǎng)需求和生長條件差異。研究結果可為巨大側耳的規(guī)模化栽培奠定基礎，進而推動熱區(qū)食用菌產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1供試菌株實驗室通過前期在熱區(qū)進行規(guī)模化栽培，篩選到2株不同溫型的巨大側耳菌株，分別為高溫型菌株PG46，中溫型菌株PG79，菌種現(xiàn)保存于中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院環(huán)境與植物保護研究所菌種保藏中心。

1.1.2供試培養(yǎng)基使用的基礎培養(yǎng)基配方為：葡萄糖20g，蛋白胨3g，磷酸二氫鉀0.5g，硫酸鎂0.5g，瓊脂20g，加水混勻后定容至1L。

1.2方法

1.2.1生物學特性分析取4℃試管斜面保存的菌種，接種于基礎培養(yǎng)基平板上進行活化，28℃恒溫暗培養(yǎng)至菌絲長至平板直徑的3/4，用于后續(xù)試驗。

（1）碳源對菌絲體生長的影響。分別以可溶性淀粉、蔗糖、果糖、麥芽糖、葡萄糖為碳源，以不加碳源為對照。用直徑8mm的無菌藍槍頭在已活化菌落邊緣打孔取菌塊，將菌塊接種至碳源培養(yǎng)基正中央，28℃恒溫暗培養(yǎng)至菌絲長滿平板，每個處理設3次重復。采用“十”字交叉法，每隔24h測量記錄菌落直徑，并拍照觀察。

（2）氮源對菌絲體生長的影響。分別以酵母浸粉、蛋白胨、尿素、硫酸銨和氯化銨為氮源，以不加氮源為對照。方法同1.2.1-（1）。

（3）溫度對菌絲體生長的影響。以基礎培養(yǎng)基為供試培養(yǎng)基，按照1.2.1-（1）接種后，分別置于15、20、25、30、35、40℃培養(yǎng)箱恒溫暗培養(yǎng)，分析適宜菌絲體生長的溫度范圍。然后，在適宜溫度范圍內(nèi)劃分為20、23、25、28、30℃，明確菌絲體最適生長溫度。測量方法同1.2.1-（1）。

（4）pH對菌絲體生長的影響。以基礎培養(yǎng)基為供試培養(yǎng)基，用1mol/LHCL和1mol/LNaOH調(diào)節(jié)培養(yǎng)基pH為5、6、7、8、9，自然pH為對照。方法同1.2.1-（1）。

（5）正交試驗?；趩我蛩卦囼灲Y果，分別從各因素中選取3個長勢最好的培養(yǎng)條件，組成4因素3水平的正交試驗，對培養(yǎng)條件進行驗證和優(yōu)化。方法同1.2.1-（1）。

1.2.2液體發(fā)酵條件優(yōu)化基于生物學特性試驗，在PG46和PG79的最適培養(yǎng)條件下，開展巨大側耳液體發(fā)酵的最適裝液量、轉(zhuǎn)速和接種量探究試驗，并探究菌絲動態(tài)生長規(guī)律[11-12]。

（1）裝液量試驗。配制液體培養(yǎng)基時，在250mL三角瓶中，分別加入80、100、120、150、180、200mL培養(yǎng)基。高溫滅菌后，調(diào)節(jié)pH為7，每瓶接入10片直徑5mm的菌塊，置于搖床中恒溫暗培養(yǎng)，設置轉(zhuǎn)速150r/min，溫度28℃。培養(yǎng)10d后，烘干稱菌絲體干重。

（2）轉(zhuǎn)速試驗。在250mL三角瓶中加入120mL培養(yǎng)基，接種后分別置于轉(zhuǎn)速為100、120、150、180、200r/min的搖床中培養(yǎng)10d。方法同1.2.2-（1）。

（3）接種量試驗。在250mL三角瓶中加入120mL的培養(yǎng)基，分別設置6%、8%、10%、12%、15%的接種量，置于150r/min搖床振蕩培養(yǎng)10d。方法同1.2.2-（1）。

（4）生物量動態(tài)檢測。以干重法測生物量。在液體發(fā)酵條件優(yōu)化的基礎上，分別以120mL裝液量（250mL三角瓶）、150r/min轉(zhuǎn)速和12%接種量為最適條件，進行液體發(fā)酵。從發(fā)酵第3天開始，每隔2d取樣進行烘干稱重，直至菌絲體的干重趨于平穩(wěn)為止，菌絲干重即為菌絲生物量。方法同1.2.2-（1）。

1.3數(shù)據(jù)處理

利用SPSS26軟件對試驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析[13-15]。

2結果與分析

2.1生物學特性分析

2.1.1碳源對菌絲體生長的影響由圖1可知，PG46和PG79在5種供試碳源上均可生長。以麥芽糖為碳源時，2株菌的菌落形態(tài)規(guī)則，菌絲較濃密且生長速度最大，分別為0.41、0.38cm/d；以可溶性淀粉為碳源時，2株菌的菌絲生長速度較快，但菌落形態(tài)不規(guī)則；以果糖和葡萄糖為碳源時，PG46菌絲生長速度較快且菌落規(guī)則，但PG79菌絲的生長速度較慢且菌落不規(guī)則。綜上，2株巨大側耳的最適碳源均為麥芽糖，但以單糖為碳源時，2株菌的利用效果存在差異。

2.1.2氮源對菌絲體生長的影響由圖2可知，PG46和PG79在5種供試氮源上均可生長，但生長速度和長勢存在顯著差異。以酵母浸粉和蛋白胨為氮源時，菌落形態(tài)規(guī)則，菌絲濃密且生長速度最快，分別為0.39cm/d和0.37cm/d（PG46）、0.41cm/d和0.42cm/d（PG79）；以硫酸銨、氯化銨和尿素為氮源時，菌落形態(tài)均不規(guī)則且長勢較差；不添加氮源時，菌絲生長速度雖較快，但均為氣生菌絲且接近透明，不適宜菌絲生長。綜上，2株巨大側耳的最適氮源相同，均為酵母浸粉和蛋白胨。

2.1.3溫度對菌絲體生長的影響前期研究結果顯示，PG46和PG79菌絲生長的適宜溫度范圍均為20～30℃，在該范圍內(nèi)進一步篩選各菌株的最適生長溫度。結果顯示（圖3），隨著溫度的升高，2株菌的生長速度均呈先上升后下降的趨勢。其中，PG46在25℃和28℃時，菌絲生長速度快且濃密，分別為0.50cm/d和0.53cm/d；PG79在28℃時，菌絲生長速度最快且濃密，為0.56cm/d；當溫度高于28℃時，菌絲生長速度均開始下降，并且中溫菌株PG79的生長速度下降較明顯且菌絲形態(tài)發(fā)生改變，菌落形態(tài)變得不規(guī)則（圖4）。綜上，2株巨大側耳菌株的菌絲最適生長溫度大致相同，均為25～28℃，但菌絲體耐受溫度范圍不同，30℃時中溫菌株PG79開始遭受高溫脅迫。

2.1.4pH對菌絲體生長的影響由圖5可知，PG46和PG79在pH為5～9范圍內(nèi)均可生長，且生長速度變化不大。當培養(yǎng)基偏酸性時，菌絲潔白濃密且形態(tài)規(guī)則，但生長速度較慢。隨著pH升高，菌絲生長速度加快，在pH為7時生長速度最快，分別為0.55cm/d和0.54cm/d。當培養(yǎng)基偏堿性時，隨著pH的升高，菌絲變稀疏且呈明顯放射狀，但整體生長速度較快。綜上，2株巨大側耳的菌絲均適宜偏中性（pH7）環(huán)境生長，但適應的酸堿度范圍較廣。

2.1.5正交試驗由于單因素試驗不能檢測各因素的交互影響，因此，基于單因素試驗結果，開展正交試驗（表1），以進一步探究2株菌的最適生長條件。由表2和表3可知，PG46和PG79在9種組合下均可生長，且與單因素試驗結果大致相同，即以麥芽糖為碳源、酵母浸粉為氮源、培養(yǎng)溫度為28℃、培養(yǎng)基pH為7（組合1）時，為最適生長條件。但也存在一定差異，除組合1外，PG46在組合7（可溶性淀粉為碳源、酵母浸粉為氮源、培養(yǎng)溫度為25℃、培養(yǎng)基pH為8）中，菌絲生長也可達到最佳狀態(tài)；PG79在組合4（蔗糖為碳源、酵母浸粉為氮源、培養(yǎng)溫度為30℃、培養(yǎng)基pH為6）和組合7中，均可達到最佳生長狀態(tài)。以上結果說明，各因素間的交互作用對菌絲生長影響較大，在統(tǒng)計分析中不可忽略。另外，方差分析結果（表4，表5）還顯示，4個因素對菌絲生長的影響程度依次為：氮源＞pH＞溫度＞碳源。

2.2液體發(fā)酵條件優(yōu)化

2.2.1裝液量對液體發(fā)酵的影響在液體發(fā)酵過程中，250mL三角瓶中裝液量直接影響菌絲體的供氧情況。由圖6可知，在一定范圍內(nèi)，隨著裝液量的增加，PG46和PG79的菌絲體生物量均呈先上升后下降的趨勢。在裝液量為120mL時，菌絲生物量均達到最大，分別為5.58g/L和6.83g/L，且與100mL裝液量無顯著性差異，但菌絲球大小更均勻。綜上，2株巨大側耳液體發(fā)酵的最適裝液量均為120mL。

2.2.2轉(zhuǎn)速對液體發(fā)酵的影響由圖7可知，隨著搖床轉(zhuǎn)速的增加，PG46和PG79的菌絲體生物量呈先增加后趨于平穩(wěn)的趨勢。當轉(zhuǎn)速為150r/min時，PG46和PG79的菌絲生物量達最高，分別為0.62g和0.82g；轉(zhuǎn)速繼續(xù)增大，菌絲體生物量無顯著變化，但菌絲球大小均一度和生長點數(shù)量有所下降。因此，綜合菌絲生物量和菌絲球均一度指標，確定150r/min為2株巨大側耳液體發(fā)酵的最適搖床轉(zhuǎn)速。

2.2.3接種量對液體發(fā)酵的影響由圖8可知，PG46和PG79的菌絲體生物量隨著接種量的增加而增大。當接種量為12%時，菌絲生物量達到最大，分別為0.79g和0.93g；其中，PG79接種量為10%、12%、15%的菌絲體生物量無顯著差異，但接種量為12%的菌絲球大小更均勻；PG46接種量為12%、15%的菌絲體生物量無顯著差異。因此，最終確定2株巨大側耳菌株的最適接種量為12%。

2.2.4菌絲生長動態(tài)變化由圖9可知，PG46和PG79的菌絲體生長均呈“對數(shù)增長”模式，且PG79的菌絲生物量始終高于PG46，與平板上的生長速度差異相符（PG79>PG46）。PG46在發(fā)酵3～9d時生長速度最快，第9天后生長變緩，第15天菌絲生物量最高（0.95g），之后趨于穩(wěn)定；PG79在發(fā)酵3～7天時生長速度最快，第7天后生長變緩，第13天菌絲生物量最高（1.09g），之后趨于平穩(wěn)。

3討論

由于巨大側耳的研究起步較晚，現(xiàn)有研究主要集中在分類地位、營養(yǎng)價值、活性成分、生物學特性、栽培技術等方面[3，8]，但涉及的研究報道較少并且不夠深入。其中，生物學特性研究大多只針對1株菌株開展，由于菌株間的遺傳多樣性，導致試驗結果的通用性較差[16-17]。本研究以2株具有代表性的不同溫型巨大側耳菌株為材料，采用單因素和正交試驗相結合的方法，從碳源、氮源、溫度和pH4個方面開展生物學特性研究，并對液體發(fā)酵條件進行優(yōu)化，分析菌絲生長的動態(tài)變化。

在生物學特性試驗中，PG46和PG79的最適碳源均為麥芽糖，麥芽糖為二糖，與多數(shù)食用菌優(yōu)先利用單糖或雙糖的結果一致[18]。以酵母浸粉和蛋白胨為氮源時，2株菌株菌絲濃密且長速較快，但以硫酸銨和氯化銨為氮源時，菌絲長勢較差且菌落形態(tài)不規(guī)則，說明有機氮比無機氮更適宜巨大側耳菌絲生長，可能與有機氮中提供的維生素、微量元素等營養(yǎng)物質(zhì)相關[13，19]。PG46和PG79菌絲的最適生長溫度均為25～28℃，但菌絲體耐受溫度范圍不同，30℃時PG46菌絲可正常生長，但PG79菌落形態(tài)變得不規(guī)則，這一現(xiàn)象與出菇溫型相符。2株菌株均適宜偏中性（pH7）環(huán)境生長，與孟靈思等[20]的研究結果一致。在試驗范圍內(nèi)（pH為5～9），菌絲均長勢較好，說明巨大側耳適應的酸堿度范圍較廣，適合進行規(guī)?；茝V。正交試驗論證了單因素試驗結果，但也存在部分差異，進一步說明在多因素試驗中正交試驗的必要性[21]。

液體發(fā)酵具有周期短、成本低、產(chǎn)量高的特點，是目前食用菌進行規(guī)?；耘嗟闹饕l(fā)酵方式，同時也是生理活性物質(zhì)提取的重要工藝[22-23]。三角瓶中的裝液量直接影響菌絲體的供氧情況。隨著裝液量的增加，營養(yǎng)物質(zhì)含量增加但氧氣含量不斷降低[24]。本研究中，當裝液量達到120mL時，菌絲生物量最大且菌絲球大小更均勻，說明此時營養(yǎng)物質(zhì)含量和供氧水平達到平衡，過高或過低均不利于菌絲生長。同樣，搖床轉(zhuǎn)速也直接影響到發(fā)酵液中的溶氧水平[25]。搖床轉(zhuǎn)速過低時菌球過大，當轉(zhuǎn)速為150r/min時，菌絲生物量最高，且菌絲球大小均勻，但轉(zhuǎn)速過高形成的菌球過小甚至無法形成完整菌球，影響下一步研究。在工業(yè)化生產(chǎn)中，接種量高低直接影響生產(chǎn)成本。當接種量為12%時，菌絲生物量最高，但與15%接種量無顯著差異，考慮成本，最終確定12%為最適接種量。在液體發(fā)酵中，發(fā)酵終點也是必須考慮的重要環(huán)節(jié)。由于培養(yǎng)過程中，菌球處于封閉狀態(tài)，營養(yǎng)物質(zhì)的消耗、氧氣的耗損、菌球生長過程中生存空間的縮小及其所產(chǎn)生的次級產(chǎn)物，均會影響菌球的生長[26]。本研究中，2株菌株的菌絲體生長呈“對數(shù)增長”模式。在發(fā)酵前7d（PG79）或前9d（PG46）時，菌絲處于對數(shù)生長期，菌絲活力旺盛，長速最快，可用于酶活性測定、原生質(zhì)體制備等菌絲活力相關的研究[27-28]；在發(fā)酵至15d或13d時，菌絲生物量最高，可用于生理活性成分提取和菌袋接種等菌絲生物量相關研究[22-23]；繼續(xù)發(fā)酵，菌絲生物量降低，不利于巨大側耳的菌絲體生長。

綜上，PG46和PG79菌絲體的生物學特性基本一致，最適碳源為麥芽糖，最適氮源為酵母浸粉和蛋白胨，最適pH為7，最適溫度為25～28℃。在生物學特性研究的基礎上，當搖床轉(zhuǎn)速為150r/min，裝液量為120mL，接種量為12%時，更適宜巨大側耳菌絲體的液體發(fā)酵，且PG46和PG79的菌絲體生物量均呈“對數(shù)增長”的模式。研究結果可為不同溫型巨大側耳的規(guī)?；耘嗟於ɑA，以進一步推動熱區(qū)食用菌產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。