楊慶敏,尹飛飛,龔 清,楊 洋,桑子陽,劉 文*

(1 三峽區(qū)域植物遺傳與種質(zhì)創(chuàng)新重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室[三峽大學(xué)]/三峽大學(xué) 生物技術(shù)研究中心,生物與制藥學(xué)院,湖北宜昌 443002;2 五峰博翎種業(yè)有限公司,湖北五峰 443413)

鹽膚木是漆樹科(Anacardiaceae)鹽膚木屬(Rhus)落葉小喬木,因其種子表面會(huì)泌鹽而得名。鹽膚木葉翅受五倍子蚜蟲取食誘導(dǎo)可形成中藥五倍子,故又稱五倍子樹,我國(guó)除新疆、青海外,各地區(qū)均有分布[1]。鹽膚木果實(shí)、木上之鹽可食用,周身可入藥,研究表明,其具有抗菌、抗病毒、降壓、降血糖,抗炎等藥用功效[2],臨床上已用于冠心病[3]、結(jié)腸癌[4]、糖尿病[5]等的治療研究。鹽膚木及五倍子經(jīng)濟(jì)價(jià)值高,除在醫(yī)藥方面的應(yīng)用,在農(nóng)業(yè)、化工等方面也運(yùn)用廣泛,市場(chǎng)需求大[6]。鹽膚木花是良好的蜜源,鹽膚木還可作為觀葉、觀果的景觀樹種,運(yùn)用于園林綠化中;此外,鹽膚木還是植被恢復(fù)的先鋒物種和重金屬吸附植物,可用于環(huán)境保護(hù)[7]。目前,鹽膚木相關(guān)研究集中的化學(xué)成分[8]、藥用價(jià)值[9]、抗逆性[10]、人工栽培[11]等方面,其中鹽膚木的人工栽培多是通過播種育苗來繁育種苗。隨著五倍子產(chǎn)業(yè)的發(fā)展,生產(chǎn)上需要大量的優(yōu)質(zhì)鹽膚木種苗,然而鹽膚木選育歷史短,品種缺乏,市場(chǎng)上種苗質(zhì)量參差不齊,加之種子育苗方法難以保存親本的優(yōu)良性狀,且繁殖周期長(zhǎng),生產(chǎn)所需的大量?jī)?yōu)質(zhì)鹽膚木種苗已成為制約五倍子產(chǎn)業(yè)發(fā)展的瓶頸[12]。當(dāng)前,組織培養(yǎng)技術(shù),尤其是體細(xì)胞胚胎發(fā)生技術(shù)在林木良種繁育中的應(yīng)用越來越受到重視。鹽膚木組織培養(yǎng)研究中已有器官發(fā)生途徑的報(bào)道,吳麗芳等[13]通過鹽膚木子葉、子葉節(jié)、下胚軸節(jié)段成功誘導(dǎo)出不定芽并實(shí)現(xiàn)其再生。但是,鹽膚木體細(xì)胞胚胎發(fā)生及植株再生體系尚未見報(bào)道。

體細(xì)胞胚胎發(fā)生(somatic embryogenesis,SE)是指植物體細(xì)胞在沒有經(jīng)過生殖細(xì)胞融合的情況下,模擬有性的合子胚胎發(fā)生過程,經(jīng)歷原胚期、球形胚、心形胚、魚雷胚、子葉胚而發(fā)育形成完整植株的過程,其原理是植物細(xì)胞全能性[14]。已報(bào)道楸樹[15]、杉樹[16]、松樹[17]、油茶[18]等多種木本植物通過體細(xì)胞胚胎發(fā)生途徑獲得再生植株。體細(xì)胞胚胎發(fā)生具有數(shù)量多、速度快、結(jié)構(gòu)完整、再生率高等特點(diǎn)[19]。體細(xì)胞胚比受精卵更容易獲得和批量生產(chǎn),因此體細(xì)胞胚胎發(fā)生體系的建立和研究,不僅有利于植物規(guī)?；庇?也有利于了解合子胚發(fā)生的相關(guān)機(jī)制。此外,體細(xì)胞胚胎還可以用于制作人工種子,不僅可節(jié)約大量種子,也可固定雜種優(yōu)勢(shì)[20]。因此,建立鹽膚木體細(xì)胞胚胎發(fā)生及植株再生體系可以為鹽膚木種苗繁育問題提供有效的技術(shù)手段,并可為鹽膚木遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立奠定重要基礎(chǔ)。

本研究以鹽膚木幼胚為外植體,通過探討不同種類和不同濃度的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)鹽膚木愈傷組織誘導(dǎo)及體細(xì)胞胚胎發(fā)生的影響,建立了鹽膚木體細(xì)胞胚胎發(fā)生及植株再生體系。該體系的建立將為鹽膚木種質(zhì)資源保存和優(yōu)良品種快速繁殖提供重要途徑,也將為其遺傳轉(zhuǎn)化和生物技術(shù)育種奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

研究所用的鹽膚木材料取自湖北省五峰土家族自治縣內(nèi)野生植株。于2020年9月上旬采集未成熟的鹽膚木種子,置于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 外植體消毒

未成熟種子用洗潔精洗去表面的油脂后流水沖洗30 min;隨后,在超凈工作臺(tái)中用75%酒精浸泡種子30 s,無菌水沖洗5遍;之后設(shè)置不同滅菌時(shí)間(8,9,10,11,12,13 min)用0.1%升汞進(jìn)一步滅菌;最后用無菌水清洗5次,無菌濾紙吸干表面水分。剝?nèi)シN皮后,將幼胚接種到愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基中,黑暗培養(yǎng)[培養(yǎng)溫度為(25±2) ℃]1周后統(tǒng)計(jì)污染率,污染率=污染外植體個(gè)數(shù)/接種外種植總數(shù)×100%。

1.3 鹽膚木幼胚愈傷組織誘導(dǎo)

將消毒滅菌好的幼胚接種在添加2,4-D(0,0.5,1.0,2.0,3.0 mg/L)和6-BA(0,0.1,0.2,1.0 mg/L)的MS培養(yǎng)基中,以不加任何激素的MS基本培養(yǎng)基為對(duì)照。每皿接種16個(gè)外植體,每種培養(yǎng)基接種10個(gè)皿,每個(gè)處理總共160個(gè)外植體,暗培養(yǎng)15 d后統(tǒng)計(jì)愈傷誘導(dǎo)率,愈傷誘導(dǎo)率=產(chǎn)生愈傷的外植體個(gè)數(shù)/接種外種植總數(shù)×100%。

1.4 胚性愈傷組織誘導(dǎo)及增殖培養(yǎng)

胚性愈傷組織誘導(dǎo)的培養(yǎng)基為1/2 MS中添加6-BA(0.1,0.5,1.0,2.0 mg/L)和NAA(0.01,0.10,0.50,1.00 mg/L),以不加任何激素的1/2 MS培養(yǎng)基為對(duì)照。每個(gè)培養(yǎng)皿中轉(zhuǎn)接16個(gè)大小均一的初代愈傷,每組試驗(yàn)10個(gè)培養(yǎng)皿,光照培養(yǎng)[光照強(qiáng)度2 000 lx,光周期為12 h光照/12 h黑暗,培養(yǎng)溫度為(25±2) ℃]30 d后觀察胚性愈傷誘導(dǎo)情況。篩選胚性愈傷最適增殖培養(yǎng)基時(shí),在超凈工作臺(tái)中稱取約1 g的胚性愈傷組織接種在胚性愈傷組織增殖培養(yǎng)基中,光照培養(yǎng)30 d后再次稱重,統(tǒng)計(jì)不同培養(yǎng)基胚性愈傷增殖倍數(shù)(愈傷增殖倍數(shù)=增殖培養(yǎng)后愈傷組織質(zhì)量/增殖培養(yǎng)前愈傷組織質(zhì)量×100%),篩選出最佳愈傷組織增殖培養(yǎng)基。

1.5 體細(xì)胞胚胎誘導(dǎo)

選取生理狀態(tài)一致的胚性愈傷進(jìn)行體細(xì)胞胚胎誘導(dǎo),包括:基本培養(yǎng)基1/2 MS,植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑為6-BA(2,4,6 mg/L)、NAA(0.05,0.10,0.50 mg/L)和蔗糖(3%,4%,5%,6%,7%,8%)。每個(gè)培養(yǎng)瓶中轉(zhuǎn)接8個(gè)大小均一的胚性愈傷組織,每種培養(yǎng)基10瓶,光照培養(yǎng)30 d后統(tǒng)計(jì)體細(xì)胞胚胎誘導(dǎo)率,體細(xì)胞胚胎誘導(dǎo)率=體細(xì)胞胚胎發(fā)生的愈傷個(gè)數(shù)/接種胚性愈傷總數(shù)×100%。

1.6 植株再生

選取處于子葉胚時(shí)期生長(zhǎng)狀況良好的成熟體細(xì)胞胚胎,轉(zhuǎn)移到不添加任何激素的1/2 MS培養(yǎng)基中,光照培養(yǎng),觀察并記錄其生長(zhǎng)狀況,待其生長(zhǎng)形成完整植株后,進(jìn)行煉苗移栽。

1.7 細(xì)胞學(xué)鑒定

取各時(shí)期的愈傷組織用70%的FAA固定液固定48 h后抽氣;然后以80%、85%、90%、95%、100%乙醇分別脫水2 h;隨后將材料放入二甲苯中透明3 h;之后將材料用60℃純石蠟浸泡3次,時(shí)間分別為1 h、1 h、2 h;浸蠟后對(duì)其包埋和切片,切片厚度為8 μm。染色時(shí)在通風(fēng)櫥中先將切片浸入二甲苯5 min,重復(fù)3次進(jìn)行脫蠟;隨后逐步放入100%、95%、85%、70%乙醇中復(fù)水15 min、5 min、3 min、5 min;最后用蒸餾水浸泡2 min。用高碘酸鉀—錫夫試劑—萘酚黃染色法染色,具體步驟為:0.5%高碘酸鉀20 min、自來水5 min、蒸餾水2 min、schiff試劑30 min、漂洗液漂洗3次,分別2 min、自來水5 min、蒸餾水2 min、萘酚黃S 10 min、蒸餾水2 min、70%乙醇2 min、95%乙醇2 min、100%乙醇4 min、二甲苯5 min,最后用加拿大中性樹脂封片。利用顯微鏡(Nikon ECLIP80i)對(duì)石蠟組織切片進(jìn)行觀察并拍照。

1.8 數(shù)據(jù)處理與分析

用SPSS 22.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,并用Origin軟件制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 滅菌方式對(duì)外植體污染率的影響

為了篩選得到鹽膚木未成熟種子最適的表面消毒條件,設(shè)置不同的升汞滅菌時(shí)間梯度。結(jié)果如表1所示,鹽膚木未成熟種子通過75%酒精消毒30 s,無菌水清洗5次,0.1%升汞滅菌10 min,無菌水清洗5次后,即可達(dá)到零污染率,且外植體不會(huì)褐化影響后續(xù)愈傷組織的誘導(dǎo)。

表1 滅菌時(shí)間對(duì)外植體的影響

2.2 6-BA與2,4-D對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)的影響

鹽膚木愈傷組織誘導(dǎo)情況如圖1所示,鹽膚木幼胚在愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基中5～8 d即可誘導(dǎo)出初代愈傷組織(圖1,a),為淡黃色疏松水漬狀的非胚性愈傷。

a.非胚性愈傷組織;b. 1 g胚性愈傷組織;c.增殖后的8.55 g胚性愈傷組織;GE.球形胚;HE.心形胚;TE.魚雷胚;CE.子葉胚;d～g.各時(shí)期體胚;h.再生植株;i.移栽入基質(zhì)的再生苗。標(biāo)尺為0.2 cm。

其中誘導(dǎo)率和愈傷組織生長(zhǎng)狀況如表2所示,當(dāng)6-BA濃度為0.2 mg/L時(shí),愈傷誘導(dǎo)率普遍較高,其中當(dāng)2,4-D為1 mg/L時(shí)愈傷誘導(dǎo)率最高,為(84.57±2.66)%;在只含2,4-D的培養(yǎng)基中,愈傷組織表面產(chǎn)生少量不定芽;未添加任何激素的對(duì)照未誘導(dǎo)出愈傷組織,而是直接萌發(fā)成苗?？傮w來說,培養(yǎng)基A5、A6、A7與A8誘導(dǎo)率較高,而A6顯著高于其他組合。結(jié)合愈傷誘導(dǎo)率和愈傷組織的形態(tài)及后續(xù)的生長(zhǎng)狀況看,A6:MS+2,4-D 1 mg/L+6-BA 0.2 mg/L是最適合鹽膚木幼胚誘導(dǎo)愈傷組織的培養(yǎng)基。

表2 不同濃度6-BA、2,4-D對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)的影響

2.3 6-BA與NAA對(duì)胚性愈傷組織誘導(dǎo)及增殖的影響

誘導(dǎo)出的初代愈傷組織轉(zhuǎn)接至胚性愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)3 d后變成黑褐色的愈傷組織,并在15 d后從黑色的愈傷組織上長(zhǎng)出淡黃色緊密的胚性愈傷。

由于各激素濃度下初代愈傷都能轉(zhuǎn)變?yōu)榕咝杂鷤?所以對(duì)胚性愈傷組織的誘導(dǎo)不做最佳條件探究。探索胚性愈傷組織最適增殖培養(yǎng)基結(jié)果如表3所示,接種1 g淡黃色的胚性愈傷(圖1,b)在B14培養(yǎng)基組合中,增殖培養(yǎng)30 d后胚性愈傷組織可達(dá)8.55 g,增殖倍數(shù)最大,為(854.73±14.06)%,愈傷組織呈黃褐色,狀態(tài)好(圖1,c)。結(jié)合胚性愈傷組織生長(zhǎng)狀態(tài)及后續(xù)的分化狀況看,B14(1/2 MS+NAA 0.5 mg/L+6-BA 2 mg/L)是最適合鹽膚木胚性愈傷組織增殖的培養(yǎng)基。

表3 不同濃度6-BA、NAA對(duì)胚性愈傷組織增殖的影響

2.4 激素和蔗糖對(duì)體細(xì)胞胚胎誘導(dǎo)的影響

2.4.1 不同濃度6-BA和NAA對(duì)體胚誘導(dǎo)的影響

探究6-BA與NAA配比對(duì)體胚誘導(dǎo)的影響,結(jié)果如表4所示:當(dāng)6-BA濃度不變時(shí),最適NAA濃度0.5 mg/L,固定NAA濃度0.5 mg/L時(shí),提高6-BA濃度均不能誘導(dǎo)出體細(xì)胞胚胎。推測(cè)出現(xiàn)以上差異的原因可能來源于生長(zhǎng)素與分裂素比例不同:在C1到C5中6-BA與NAA的比例分別為40、20、4、8、12,比例太高不利于體細(xì)胞胚胎誘導(dǎo),只有當(dāng)6-BA與NAA的比例為4時(shí),才能誘導(dǎo)出體細(xì)胞胚胎。

表4 不同濃度6-BA、NAA對(duì)體細(xì)胞胚胎誘導(dǎo)的影響

2.4.2 不同蔗糖濃度對(duì)體細(xì)胞胚胎誘導(dǎo)的影響

蔗糖可以作為培養(yǎng)基中的能源物質(zhì),為細(xì)胞、組織等提供碳源;蔗糖還是一種滲透調(diào)節(jié)物質(zhì),能通過改變培養(yǎng)基中的滲透壓、制造脅迫環(huán)境來誘導(dǎo)體細(xì)胞胚胎的發(fā)生[21]。本研究探究不同蔗糖濃度對(duì)鹽膚木體細(xì)胞胚胎發(fā)生的影響,結(jié)果(表5)表明,將培養(yǎng)基中蔗糖濃度從3%提高到4%時(shí),鹽膚木體細(xì)胞胚胎發(fā)生率從(18.47±1.40)%提高到(32.67±4.75)%,誘導(dǎo)得到的體細(xì)胞胚胎如圖1,d～g所示;而如果進(jìn)一步提升蔗糖濃度,則胚性愈傷組織生長(zhǎng)狀態(tài)越來越差,直至死亡。

表5 蔗糖對(duì)體細(xì)胞胚胎誘導(dǎo)影響

2.5 植株再生

培養(yǎng)基1/2 MS+6-BA 2 mg/L+NAA 0.5 mg/L+蔗糖4%中培養(yǎng)30 d后形成的成熟體細(xì)胞胚放置到不含任何激素的1/2 MS培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng),1個(gè)月后可觀察到再生苗生根(圖1,h),待再生苗生長(zhǎng)至3～5 cm時(shí),轉(zhuǎn)入泥炭土∶蛭石∶珍珠巖為2∶1∶1的基質(zhì)中能穩(wěn)定成活(圖1,i)。

2.6 鹽膚木體細(xì)胞胚胎發(fā)生的細(xì)胞學(xué)觀察分析

對(duì)鹽膚木體細(xì)胞胚胎的不同發(fā)育時(shí)期材料,利用體視顯微鏡進(jìn)行組織學(xué)觀察,并利用石蠟切片進(jìn)行細(xì)胞學(xué)觀察,以進(jìn)一步明確其胚胎發(fā)生過程。體式顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)鹽膚木非胚性愈傷組織呈白色透明、水漬狀偏軟(圖1,a),組織切片觀察發(fā)現(xiàn)其細(xì)胞大小無規(guī)則、排列疏松、不易被染色、幾乎不存在淀粉粒(圖2,a)。胚性愈傷組織呈淺黃色或黃褐色、疏松狀、分裂旺盛(圖1,b和圖1,c),組織切片觀察發(fā)現(xiàn)其細(xì)胞整齊緊密排列、細(xì)胞內(nèi)含有大量的淀粉粒,且淀粉粒小而分散(圖2,b)。觀察到鹽膚木體細(xì)胞胚胎發(fā)生的整個(gè)過程,包括球形胚(圖2,c)、心形胚(圖2,d)、魚雷胚(圖2,e)、子葉胚(圖2,f)等不同發(fā)育時(shí)期。

a.非胚性愈傷;b.胚性愈傷;c.球形胚;d.心形胚;e.魚雷胚;f.子葉胚。圖中標(biāo)尺為100 μm。

3 討 論

植物激素是誘導(dǎo)植物愈傷組織形成的關(guān)鍵因素[22]。本研究發(fā)現(xiàn),植物激素與鹽膚木幼胚的發(fā)育命運(yùn)息息相關(guān),只有添加一定濃度的6-BA和2,4-D時(shí)鹽膚木幼胚才能誘導(dǎo)形成愈傷組織(圖1,a);不添加時(shí),鹽膚木幼胚會(huì)直接萌發(fā)。姜治國(guó)等[23]以三葉木通幼胚為外植體,也出現(xiàn)類似情形。許多物種體細(xì)胞胚胎發(fā)生的研究表明,細(xì)胞分裂素在體細(xì)胞胚胎誘導(dǎo)中主要是在細(xì)胞分化、體細(xì)胞胚胎發(fā)育方面起作用,生長(zhǎng)素主要是在細(xì)胞分裂方面起作用[24]。培養(yǎng)基中添加6-BA 0.2 mg/L和NAA 0.05 mg/L時(shí),楸樹體細(xì)胞胚胎誘導(dǎo)率最高可達(dá)59.8%[25]。在本研究中,培養(yǎng)基中添加6-BA 2 mg/L和NAA 0.5 mg/L時(shí),鹽膚木體細(xì)胞胚胎誘導(dǎo)率為18.47%。雖然6-BA和NAA的組合處理能誘導(dǎo)多種植物體胚的形成,但是不同植物所需的最適濃度并不相同,這或許是存在基因型差異及取樣時(shí)間差異造成的。有研究發(fā)現(xiàn),內(nèi)源IAA含量上升或保持在較高的濃度是胚性細(xì)胞出現(xiàn)的一個(gè)共同標(biāo)志[26],內(nèi)源ABA含量升高有利于植物體胚發(fā)生與成熟[27]。后續(xù)可以對(duì)鹽膚木體胚發(fā)生過程中各時(shí)期愈傷組織的內(nèi)源激素含量進(jìn)行測(cè)定,為鹽膚木體細(xì)胞胚發(fā)生的激素調(diào)控提供理論依據(jù),也可進(jìn)一步從分子水平揭示鹽膚木體胚發(fā)生機(jī)制。

研究表明脅迫是誘導(dǎo)體胚發(fā)生的重要因子。PEG、ABA、高濃度蔗糖等被稱為與植物細(xì)胞獲得胚胎發(fā)生能力的脅迫相關(guān)物質(zhì)[28]。Kato等人[29]以鴨兒芹幼苗的莖尖為外植體,用0.7 mol/L蔗糖作為高滲脅迫處理,有效地誘導(dǎo)了體細(xì)胞胚胎的發(fā)生;在萬壽菊體細(xì)胞胚胎發(fā)生研究中,發(fā)現(xiàn)添加4.5%蔗糖促進(jìn)體細(xì)胞胚胎發(fā)育與成熟[30];唐靜儀對(duì)鐵皮石斛進(jìn)行體胚發(fā)生研究時(shí),發(fā)現(xiàn)6%的蔗糖和一定濃度的ABA結(jié)合使用,可使體胚產(chǎn)量高達(dá)59%[31]。但是,添加高濃度蔗糖有可能誘發(fā)畸形胚。張煥玲在栓皮櫟的體胚成熟試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)提高蔗糖濃度時(shí)畸形胚的誘導(dǎo)率也隨之升高[32]。本研究探索蔗糖濃度對(duì)鹽膚木體細(xì)胞胚胎發(fā)生的影響,發(fā)現(xiàn)當(dāng)蔗糖濃度由3%提升到4%時(shí)更有利于其體細(xì)胞胚胎的形成,但是蔗糖濃度繼續(xù)升高則抑制體細(xì)胞胚胎形成(表5),說明適當(dāng)提高蔗糖濃度對(duì)鹽膚木體細(xì)胞胚胎形成有促進(jìn)作用,后續(xù)可以繼續(xù)嘗試用不同濃度PEG或ABA對(duì)胚性愈傷組織進(jìn)行脅迫處理,從而優(yōu)化鹽膚木體胚發(fā)生體系。

Wang等在對(duì)紅掌體胚發(fā)生研究中發(fā)現(xiàn)較低濃度的植物激素、礦物質(zhì)營(yíng)養(yǎng)促進(jìn)紅掌體胚的發(fā)生,甚至營(yíng)養(yǎng)減少用1/8 MS和無激素培養(yǎng)基更適用于體胚萌發(fā)[33]。另有研究發(fā)現(xiàn)液體培養(yǎng)基和半固體培養(yǎng)基培養(yǎng)對(duì)體胚發(fā)生和成熟也有影響,液體培養(yǎng)基的懸浮培養(yǎng)在振蕩作用下有更好的簇解離效果,且液體培養(yǎng)條件下組織更多地暴露于培養(yǎng)環(huán)境以及有更好的通風(fēng),這都有利于椰棗體胚的產(chǎn)生[34]。同樣方法是否適用于鹽膚木的體胚發(fā)生也有待進(jìn)一步研究。

細(xì)胞學(xué)觀察是區(qū)分體細(xì)胞胚胎再生階段的重要手段[14]。本研究通過石蠟切片觀察到鹽膚木體細(xì)胞胚胎發(fā)生的整個(gè)過程與大多數(shù)植物體細(xì)胞胚胎發(fā)生過程一致,經(jīng)歷球形胚、心形胚、魚雷胚和子葉胚等時(shí)期。組織染色結(jié)果顯示,鹽膚木胚性愈傷組織中積累了較多的淀粉粒,這為體細(xì)胞胚胎的后續(xù)發(fā)育及成熟儲(chǔ)存一定的物質(zhì)和能源。植物體細(xì)胞胚胎發(fā)生存在內(nèi)起源、外起源以及內(nèi)起源與外起源同時(shí)發(fā)生的雙起源方式。貓兒屎[35]、洪平杏[36]、花櫚木[37]等是以雙起源方式為主,荔枝[38]、三葉木通[39]等是以外起源方式為主。石蠟切片染色發(fā)現(xiàn)鹽膚木體細(xì)胞胚是在愈傷組織表面發(fā)起的(圖2,c),在愈傷組織內(nèi)并沒有見到體細(xì)胞胚胎的發(fā)生,表明鹽膚木體細(xì)胞胚胎起源方式為外起源方式。從形態(tài)學(xué)和組織細(xì)胞學(xué)的層面,系統(tǒng)地觀察體細(xì)胞胚胎發(fā)生發(fā)育的全過程,不僅有利于揭示細(xì)胞全能性以及體細(xì)胞胚胎的起源,也可為建立體細(xì)胞胚胎再生形式的高效遺傳轉(zhuǎn)化體系提供細(xì)胞學(xué)依據(jù)。

本論文以鹽膚木幼胚為外植體,建立了鹽膚木體細(xì)胞胚胎發(fā)生及植株再生體系,但由于體細(xì)胞胚胎誘導(dǎo)率不高,后續(xù)可進(jìn)一步優(yōu)化條件,提高其體細(xì)胞胚胎發(fā)生率并建立工廠化繁育技術(shù)體系,同時(shí),在此基礎(chǔ)上,可進(jìn)一步建立鹽膚木遺傳轉(zhuǎn)化體系,為鹽膚木種質(zhì)創(chuàng)新提供平臺(tái),這些對(duì)五倍子產(chǎn)業(yè)發(fā)展具有重要意義。