邵郅勝,張 薇,孫 聰,郭金麗

(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝與植物保護學(xué)院,呼和浩特 010018)

歐李(Cerasushumilis)屬薔薇科櫻桃屬極矮生灌木,為我國特有野生果樹資源[1],主要分布于內(nèi)蒙古、山西、遼寧、河北等北方地區(qū)。歐李果實香氣濃郁、風(fēng)味獨特,同時富含酚類物質(zhì)、氨基酸、維生素和Ca、Fe、Se等,備受人們關(guān)注[2]。歐李資源豐富,具有抗旱、抗寒、耐瘠薄,綜合適應(yīng)性強的特點,適用于寒旱地區(qū)經(jīng)濟林建設(shè)及生態(tài)修復(fù)治理[3-4]。歐李果實鮮食加工俱佳,可深加工成果酒、果汁、果醬、紅色素等系列產(chǎn)品[5]。此外,歐李仁可入藥[6],葉可制茶[7]。歐李集果、種子、葉等綜合開發(fā)利用于一身,具有極高的營養(yǎng)價值、藥用價值和生態(tài)價值,開發(fā)前景廣闊[8]。酚類物質(zhì)是一類重要的果蔬次生代謝物質(zhì),廣泛存在于植物組織中,可有效抑制細菌、真菌等病原體的侵染,在抵抗病原菌方面發(fā)揮重要作用[9-10]。酚類物質(zhì)對果實色澤、口感風(fēng)味、產(chǎn)品褐變等方面[11-12]具有重要影響;在人類健康方面具有抗氧化、清除自由基、預(yù)防心血管疾病、延緩機體衰老等多種生理活性和功能[13-18]。

本課題組[19]初步研究表明,歐李果實中酚類物質(zhì)含量豐富,酚類物質(zhì)及其抗氧化特性是歐李果實品質(zhì)的重要特征之一,研究了解歐李果實酚類物質(zhì)及抗氧化的特性特征,可為歐李果實品質(zhì)提升、品種選育等進一步研究應(yīng)用打下基礎(chǔ)。內(nèi)蒙古高原作為中國歐李集中分布區(qū)域之一,具有豐富多樣的歐李種質(zhì)資源。本課題組多年來進行內(nèi)蒙古地區(qū)歐李種質(zhì)資源收集與研究,從豐富多樣的內(nèi)蒙古歐李種質(zhì)資源中初步篩選出部分優(yōu)系資源開展進一步深入研究。在前期工作的基礎(chǔ)上,本試驗以內(nèi)蒙古36種歐李優(yōu)系資源為材料,對果實酚類物質(zhì)、抗氧化活性、酸度、果肉色4個品質(zhì)性狀的9個指標,利用主成分分析、相關(guān)性分析、綜合聚類分析等相結(jié)合的方法,進行種質(zhì)評價,探討歐李果實品質(zhì)性狀之間的聯(lián)系,同時為內(nèi)蒙古歐李優(yōu)異資源篩選及進一步研究和應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

36種歐李優(yōu)系資源來源于內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)歐李科研基地(40°56′19.48″N,111°57′34.95″E)資源圃,通過實生選種方式于2019年于資源圃內(nèi)選出優(yōu)良單株,之后通過綠枝扦插無性擴繁形成36份內(nèi)蒙古歐李優(yōu)系資源(以MY1-52表示)。每份資源各選取30株進行標記, 10株為 1 次重復(fù),重復(fù) 3 次。2021年7月下旬至9月下旬于36種歐李優(yōu)系資源果實完熟期分別于結(jié)果枝的上、中、下部選擇果個均勻一致、無病蟲害、無機械傷的果實組成樣本,洗凈晾干后液氮速凍,于-80 ℃冰箱中保存待測。

1.2 提取液制備

取適量歐李果實去核后切碎,稱取3.0 g放入研缽,以0.1%鹽酸的40%乙醇水溶液做提取液,加50 mL提取液磨碎,超聲波清洗儀25 ℃提取1 h,反復(fù)提取 3 次,過濾定容至50 mL量瓶,提取液5 000 r/min離心10 min,上清液即為果實提取液,-20 ℃儲存待測。3次重復(fù)。

1.3 測定方法

1.3.1 果肉色

取歐李果實縱切,目測將果肉顏色歸為三大類,淺紅、桔黃、紅,并賦值(淺紅=1,桔黃=2,紅=3)。

1.3.2 酚類物質(zhì)

總酚、總黃酮、原花青素含量參照邵郅勝[20]試驗方法進行測定。

1.3.3 抗氧化活性

抗氧化活性4個指標均參照邵郅勝[20]的試驗方法,略有改動。

總抗氧化:取1 mL提取液、6 mL 鐵離子還原能力(FRAP)工作液、0.6 mL蒸餾水,混合搖勻后于37 ℃水浴20 min。在593 nm 處,用無水乙醇調(diào)零,測吸光度。標準曲線以FeSO4溶液制作,用無水乙醇配制FeSO4溶液(濃度梯度200～6 000 μg/ mL),測定標準系列溶液的吸光值,做標準曲線,以無水乙醇代替樣品做空白,根據(jù)吸光值,求得相應(yīng) Fe2+當(dāng)量定義FRAP值[CVN/1000M,C為樣品減去空白吸光度代入Fe2+當(dāng)量(μmol/L),V為待測液總體積(L),N為樣品稀釋倍數(shù),M為樣品質(zhì)量(g)]。

總還原力:依次加入2.5 ml pH 7.0磷酸鹽緩沖液、100 μL果實提取液、2.5 mL 30.37 mmol/L鐵氰化鉀,混勻,50 ℃恒溫水浴20 min,加入2.5 mL 0.6 mol/L三氯醋酸溶液終止反應(yīng)。反應(yīng)體系中取2.5 mL上清液,加2.5 mL蒸餾水和0.5 mL 3.70 mmol/L FeCl3溶液,反應(yīng)10 min后于700 nm處測定吸光值;以蒸餾水代替提取液作空白。

·OH清除率:依次加入1 mL 9 mmol/L FeSO4、1 mL 9 mmol/L水楊酸乙醇溶液、400 μL果實提取液,混勻,加入2 mL 8 mmol/L H2O2,4.6 mL蒸餾水,混勻, 37 ℃水浴60 min后取出冷卻,于510 nm處測定吸光值;以蒸餾水代替提取液做空白,蒸餾水代替H2O2作為對照。按·OH清除率=[A空白-(A樣品-A對照)]/A空白×100%計算。

DPPH·清除率:依次加入2 mL果實提取液、2 mL 0.1 mg/mL DPPH甲醇溶液,混勻,避光反應(yīng)60 min,于517 nm處測吸光值;以甲醇代替提取液作對照。按DPPH·清除率=(A對照-A樣品)/A對照)×100%計算。

1.3.4 可滴定酸

可滴定酸含量采用滴定法測定。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2010統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析處理,利用SPSS 26.0軟件進行相關(guān)性分析、主成分分析及系統(tǒng)聚類。

2 結(jié)果與分析

2.1 歐李優(yōu)系資源果實品質(zhì)性狀的變異分析

歐李果實酚類物質(zhì)、抗氧化活性、酸度及果肉色的差異和多樣性分析見表1。果實總酚含量變幅為555.33～1 090.89 mg/(100 g),最大值為最小值的1.96倍,均值為774.35 mg/(100 g),變異系數(shù)為16.80%;總黃酮含量變幅為191.56～679.33 mg/(100 g),最大值為最小值的3.55倍,變異系數(shù)為31.03%;原花青素含量變幅為222.73～483.94 mg/(100 g),最大值為最小值的2.17倍,變異系數(shù)為19.25%。果實總抗氧化活性變幅為9.96～22.09 μmol/g,最大值為最小值的2.22倍,均值為14.70 μmol/g,變異系數(shù)為22.12%;總還原力在18.27%～37.70%范圍內(nèi)變化,最大值為最小值的2.06倍,變異系數(shù)為17.33%;·OH清除率變幅為38.52%～50.43%,均值為45.31%,變異系數(shù)為6.66%;DPPH·清除率在28.49%～63.53%范圍內(nèi)變化,最大值為最小值的2.23倍,變異系數(shù)為18.96%。果實可滴定酸含量變幅為1.31%～1.79%,變異系數(shù)小,僅為5.91%;而果肉色變異系數(shù)則高達30.29%。不同歐李資源類型之間果實的酚類物質(zhì)含量、抗氧化活性、酸度及果肉色均有不同程度的差異。3種酚類物質(zhì)中,總黃酮含量的變異程度最高,原花青素含量次之,總酚含量最低;4種抗氧化活性中,變異程度由高到低的順序依次為總抗氧化活性、DPPH·清除率、總還原力及·OH清除率。可滴定酸含量變異系數(shù)最小(5.91%)。果肉色劃分為紅、桔黃、淺紅三大類,變異系數(shù)高達30.29%。由上可見,36份歐李優(yōu)系資源多個品質(zhì)性狀指標均具有豐富的遺傳多樣性,不同優(yōu)系資源間性狀差異較大,適合進行優(yōu)異種質(zhì)分析與評價。

表1 歐李優(yōu)系資源果實品質(zhì)性狀分析

2.2 歐李優(yōu)系資源品質(zhì)性狀間的相關(guān)性分析

36份歐李優(yōu)系資源果實酚類物質(zhì)含量、抗氧化活性、酸度及果肉色4個品質(zhì)性狀的9項指標相關(guān)性分析表明:果實總酚、總黃酮、原花青素三者間均表現(xiàn)為極顯著正相關(guān),其中總酚與總黃酮相關(guān)程度(0.865)最高。果實4項抗氧化指標中,總還原力、·OH清除率和DPPH·清除率三者間均表現(xiàn)為極顯著正相關(guān),其中還原力與·OH清除率相關(guān)程度(0.539)最高;而總抗氧化活性與其他三項抗氧化指標的相關(guān)性均不顯著。果實總酚和總黃酮含量均與總還原力、·OH清除率和DPPH·清除率存在顯著正相關(guān),相關(guān)程度表現(xiàn)為DPPH·清除率>總還原力>·OH清除率;原花青素含量與總還原力、·OH清除率和DPPH·清除率均表現(xiàn)為極顯著正相關(guān),與總抗氧化表現(xiàn)顯著正相關(guān),相關(guān)程度表現(xiàn)為總還原力>·OH清除率>DPPH·清除率>總抗氧化。果實可滴定酸含量僅與總黃酮含量呈顯著負相關(guān),與其他指標相關(guān)性不顯著。果肉顏色與總酚含量表現(xiàn)極顯著正相關(guān),與總黃酮、原花青素及DPPH·清除率均呈顯著正相關(guān)。從酚類物質(zhì)與抗氧化活性的相關(guān)程度來看,3種酚類物質(zhì)與總抗氧化活性、總還原力、·OH清除率三者的相關(guān)系數(shù)均表現(xiàn)為原花青素>總酚>總黃酮;與DPPH·清除率的相關(guān)系數(shù)表現(xiàn)為總酚>總黃酮>原花青素。綜上可見,歐李果實各酚類物質(zhì)含量之間關(guān)聯(lián)緊密,同時抗氧化活性指標、可滴定酸含量及果肉色三者基本均與歐李果實各酚類物質(zhì)含量存在不同程度的相關(guān)性(表2)。

表2 歐李果實不同品質(zhì)性狀相關(guān)性分析

2.3 歐李優(yōu)系資源品質(zhì)性狀間的主成分分析

基于36份歐李優(yōu)系資源9項指標的主成分分析(表3),由表3可知,共劃分3個主成分(F1～F3),貢獻率分別為46.21%、15.13%和12.20%,累計貢獻率達73.54%;同時3個主成分的特征值均大于1,其中F1的提取特征值為4.159。提取的3個主成分可反映優(yōu)系材料品質(zhì)性狀73.54%的信息,可作為評價歐李優(yōu)系資源品質(zhì)性狀的重要指標。由表4可知,F1主要由載荷因子分別為0.870、0.811、0.843、0.776、0.643、0.781和0.539的總酚、總黃酮、原花青素、總還原力、·OH清除率、DPPH·清除率和果肉色決定,稱為酚類因子;F2主要由載荷因子為0.873的可滴定酸含量決定,稱為酸度因子;F3主要由載荷因子為0.898的總抗氧化活性決定,稱為總抗氧化因子。綜上所述,總酚、總黃酮、原花青素、總抗氧化、總還原力、·OH清除率、DPPH·清除率、酸度和果肉色可作為評價歐李優(yōu)系資源品質(zhì)性狀的重要指標。

表3 主成分特征值、貢獻率及累計貢獻率

表4 因子載荷矩陣

2.4 品質(zhì)性狀的主成分得分和綜合評價

根據(jù)主成分分析中提取的3個主成分進行得分綜合評價,先建立歐李種質(zhì)綜合評價數(shù)學(xué)模型:F=[10×(46.213×F1+15.132×F2+12.197×F3)/73.542]+60,通過公式計算歐李種質(zhì)品質(zhì)性狀的綜合得分,由高到低進行優(yōu)良排序,綜合得分越高,歐李優(yōu)系種質(zhì)綜合性狀越好,結(jié)果見表5。排名在前10的歐李優(yōu)系由高到底分別為MY37、MY36、MY50、MY47、MY5、MY38、MY17、MY41、MY16和MY1,綜合得分范圍是66.45～84.53。上述10個優(yōu)系中有6個總酚含量均在900 mg/(100 g)以上;8個優(yōu)系總黃酮含量在500 mg/(100 g)以上;6個優(yōu)系原花青素含量在400 mg/(100 g)以上;抗氧化力突出,同時果肉色基本均為紅色。排名前10的歐李優(yōu)系綜合表現(xiàn)優(yōu)異(表6)。排名在后10的優(yōu)系資源綜合得分范圍是29.61～52.46,由低到高分別為MY9、MY10、MY19、MY20、MY6、MY51、MY30、MY12、MY18、MY2。此部分資源酚類物質(zhì)含量較低,抗氧化能力較差,果肉色大多為淺紅和桔黃,綜合表現(xiàn)差。

表6 排名前10的歐李優(yōu)系資源各指標信息

2.5 歐李優(yōu)系資源的聚類分析及評價

采用歐氏距離法對標準化后的9個指標進行系統(tǒng)聚類分析,最終將36份歐李優(yōu)系資源劃分為4大類(圖1)。

圖1 36種歐李優(yōu)系資源系統(tǒng)聚類譜系圖

由表7和表8可知,第Ⅰ類群中的優(yōu)系共7個,分別為MY5、MY36、MY37、MY38、MY41、MY47、MY 50,占比19.44%,均在綜合得分排名的前10位之列;第Ⅱ類群中的優(yōu)系最少,僅1個,為MY40。

表7 3類歐李優(yōu)系資源各指標均值差異性分析

表8 36種歐李優(yōu)系資源聚類結(jié)果

第Ⅰ、Ⅱ類群均具有各酚類物質(zhì)含量高及綜合抗氧化能力強的特點,果肉色多為紅色,主要區(qū)別在于第Ⅱ類群的MY40,可滴定酸含量更低,為1.31%。第Ⅲ類群中的優(yōu)系資源共25個,占比最高,為69.44%,此類群具有各酚類物質(zhì)含量及綜合抗氧化能力適中,可滴定酸含量偏高的特點。第Ⅳ類群中的優(yōu)系資源共3個,分別為MY6、MY9、MY10,占比8.33%,此類群具有各酚類物質(zhì)含量偏低、綜合抗氧化能力較弱及可滴定酸含量高的特點,果肉色為淺紅和桔黃。

3 討 論

實生選種是對種子實生繁殖后產(chǎn)生的變異進行選擇,從而篩選出性狀優(yōu)異的優(yōu)良種質(zhì)資源,是植物優(yōu)良種質(zhì)資源篩選及新品種培育的主要方式[21]。歐李具有早果特性,實生選種亦作為歐李優(yōu)良種質(zhì)資源篩選及進一步新品種選育的常用途徑[22]。遺傳多樣性是歐李新品種選育的基礎(chǔ),本研究對實生選種選出的36份歐李優(yōu)系資源果實酚類物質(zhì)、抗氧化性、酸度及果肉色4類品質(zhì)性狀的9個指標變異系數(shù)及相關(guān)性進行分析,結(jié)果表明,9個指標變異系數(shù)范圍為5.91%～31.03%,36份優(yōu)系資源品質(zhì)性狀間存在豐富的遺傳多樣性,其中總黃酮和總抗氧化的變異系數(shù)較高。3種酚類物質(zhì)均與總還原力、DPPH·清除率、·OH清除率和果肉色存在正相關(guān)關(guān)系,與酸度的相關(guān)系數(shù)均為負值,三類品質(zhì)性狀與酚類物質(zhì)均存在著緊密的聯(lián)系。牛帥科等[23]在葡萄上,嚴娟等[24]在桃果肉上也發(fā)現(xiàn)果肉色與酚類物質(zhì)有類似的關(guān)系。綜上,研究的9項指標可以作為歐李優(yōu)良種質(zhì)篩選及品種選育的重要參考指標。

通過主成分分析法將9項品質(zhì)性狀指標轉(zhuǎn)化為彼此獨立的3個指標,分別為酚類因子、酸度因子和總抗氧化因子。結(jié)合相關(guān)性分析結(jié)果,總抗氧化活性與酚類物質(zhì)相關(guān)性較其他3個抗氧化指標較差,同時又被劃分為獨自的主成分,可知總抗氧化受果實中其他物質(zhì)影響較大,如維生素C等。基于提取的3個主成分及建立的歐李種質(zhì)綜合評價數(shù)學(xué)模型:F=[10×(46.213×F1+15.132×F2+12.197×F3)/73.542]+60, 對36份歐李優(yōu)系進行綜合得分評價。排名前10的優(yōu)系資源酚類物質(zhì)含量高,抗氧化能力強,果肉多為紅色;后10位的優(yōu)系資源酚類物質(zhì)含量低,抗氧化能力較弱,果肉多為桔黃和淺紅色,不宜作為高酚類歐李種質(zhì)資源。

本試驗以9項品質(zhì)指標為參數(shù)通過系統(tǒng)聚類將36份優(yōu)系資源聚為4大類:第Ⅰ類群包括MY5、MY36、MY37、MY38、MY41、MY47、MY50,為酚類物質(zhì)積累型,多為紅果肉,此類群可作為高酚類歐李種質(zhì)資源及進行后續(xù)研究及應(yīng)用;第Ⅱ類群為MY40,與前一類群主要區(qū)別在于酸度,MY40可滴定酸含量更低,為1.31%,可作為特異的低酸高酚種質(zhì)資源進行后續(xù)研究;第Ⅲ類群中的優(yōu)系資源共25個,此類群具有各酚類物質(zhì)含量及綜合抗氧化能力適中,可滴定酸含量偏高的特點;第Ⅳ類群包括MY6、MY9、MY10,此類群酚類物質(zhì)含量低,抗氧化能力弱,可滴定酸含量高,果肉色多為淺紅和桔黃,此類群不宜作為高酚類歐李種質(zhì)資源,但可作為高酸低酚種質(zhì)資源用于其他研究。

4 結(jié) 論

本研究差異性及相關(guān)性分析表明,36份歐李優(yōu)系資源的4類品質(zhì)性狀聯(lián)系緊密,遺傳多樣性豐富。主成分分析將9個品質(zhì)性狀指標歸為累計貢獻率達73.54%的3個主成分,分別為酚類因子、酸度因子和總抗氧化因子。通過建立的種質(zhì)綜合評價數(shù)學(xué)模型,篩選出酚類品質(zhì)優(yōu)異的優(yōu)系資源10份,分別為MY37、MY36、MY50、MY47、MY5、MY38、MY17、MY41、MY16和MY1。通過系統(tǒng)聚類分析,最終聚為4大類,第Ⅰ類群包括7份優(yōu)系資源,分別為MY5、MY36、MY37、MY38、MY41、MY47、MY50,為酚類物質(zhì)積累型,多為紅果肉,同時這7份優(yōu)系資源綜合得分均在前10位,此類群可作為高酚類品質(zhì)歐李種質(zhì)資源。