陳冬湄

福建省泉州市兒童醫(yī)院 362000

癲癇是一種以反復抽搐為表現(xiàn)形式的慢性腦部疾病,在兒童神經(jīng)系統(tǒng)疾病中非常常見,其原因多樣復雜,發(fā)病機制復雜,目前大部分國內(nèi)外學者較認可的說法是癲癇發(fā)作的過程出現(xiàn)了腦神經(jīng)元過度的同步化放電,反復發(fā)作,從而引起慢性的腦功能損傷。在可能導致癲癇的各種機制中,自由基的產(chǎn)生起著至關重要的作用,近年來多個研究表明[1],癲癇的發(fā)作伴發(fā)著自由基的產(chǎn)生,氧化應激被認為是癲癇腦損傷的發(fā)病機制之一。本研究采用了PTZ點燃的慢性癲癇幼鼠作為實驗模型,分別給予LPS-RS與mNGF對PTZ點燃的慢性癲癇幼鼠進行干預,通過與正常對照組比較血清及海馬TRX、NSE的表達差異,從而探討LPS-RS、mNGF對其表達產(chǎn)生的影響及作用機制,并比較mNGF與LPS-RS對癲癇相關腦神經(jīng)損傷保護作用的差異。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物。清潔級Wistar雄性幼鼠[購自Shanghai SLAC Laboratory Animal Co.,Ltd,許可證號:SCXK(滬)2017-0005],共130只,日齡21d,體質(zhì)量50～65g。

1.1.2 實驗藥品。PTZ:美國Sigma公司,生產(chǎn)批號:MKCC1690;LPS-RS:美國invivogen公司,生產(chǎn)批號:RLP-39-02;mNGF:恩經(jīng)復,廈門未名生物醫(yī)藥有限公司,生產(chǎn)批號:20160311;顯影定影試劑:中國江蘇凱基生物科技發(fā)展有限公司,生產(chǎn)批號:KGP116;rabbit anti-GAPDH(10B8):中國江蘇凱基生物科技發(fā)展有限公司生產(chǎn)批號:KGAA002;羊抗兔IgG-HRP:中國江蘇凱基生物科技發(fā)展有限公司,生產(chǎn)批號:KGAA35;大鼠TRX酶聯(lián)免疫試劑盒、大鼠NSE酶聯(lián)免疫試劑盒:包括封板膜,密封袋,酶標包被板1x96長期-20℃,標準品(凍干粉),標準品/樣品稀釋液,生物素抗原凍干粉,親和素-HRP濃縮液,顯色劑A,顯色劑B,終止液,濃縮洗滌液等:上海朗頓生物科技有限公司,生產(chǎn)批號:S20180318MY。

1.1.3 儀器及設備。高速冷凍離心機:美國Thermo Sorvall ST 16R;37℃恒溫培養(yǎng)箱:上海一恒THZ-100;ELISA酶標儀:美國MD CMAXPLUS;洗板機:拜爾PR510;pH計:美國OHAUS STARTER 2C;分析天平:中國精密分析天平JA3003。

1.2 建立動物模型

1.2.1 分組前準備。實驗所使用的130只清潔級Wistar雄性大鼠幼鼠置于實驗動物中心隔離檢疫室中檢疫1周。在檢疫期間,檢疫室的室內(nèi)溫度維持在22～26℃,相對濕度40%～60%,12/12h晝夜照明變化,幼鼠均可自由進食飼料和水。經(jīng)1周檢疫后無幼鼠死亡,將Wistar雄性大鼠幼鼠轉(zhuǎn)移至屏障環(huán)境中。

1.2.2 實驗分組。 使用隨機數(shù)表法將Wistar雄性大鼠幼鼠隨機分為4組:A組(空白對照組,n=31只)、B組(EP癲癇組,n=33只)、C組(mNGF組,n=33只)、D組(LPS-RS組,n=33只)

1.2.3 使用PTZ建立慢性癲癇幼鼠模型。建模期間,A組幼鼠給予等劑量9g/L生理鹽水,B、C、D組幼鼠每日均給予40mg/kg(質(zhì)量濃度10g/L)PTZ。給藥時間:8:00—10:00am;給藥方式:腹腔注射。每次給藥后均觀察幼鼠活動1h,記錄幼鼠的行為學表現(xiàn)。幼鼠癲癇發(fā)作程度的分級參照Racine分級[2]標準判定(Ⅳ級及其以上癲癇發(fā)作即視為大發(fā)作):慢性點燃成功標準:幼鼠出現(xiàn)連續(xù)5次Ⅱ級以上癲癇發(fā)作即提示點燃成功,慢性點燃成功后PTZ的給藥頻率改為2～3d給藥1次以維持點燃14d。

1.2.4 干預方法。A組:每日給予幼鼠相同劑量9g/L鹽水,不給予干預劑;B組:每日給予幼鼠相同劑量9g/L鹽水,不給予干預劑;C組:每日給予幼鼠mNGF 4μg/kg;D組:每日給予幼鼠LPS-RS 0.1mg/kg。干預時間:8:00—10:00am,連續(xù)給藥7d;干預方式:腹腔注射。

1.2.5 取材。在最后一次干預后于A、B、C、D 4個小組每組隨機取27只幼鼠進行標本采集,每組于3h、24h、72h三個時段各隨機采集9個標本。取材流程:麻醉前禁食8～12h,腹腔注射2%戊巴比妥鈉(40mg/kg)。麻醉幼鼠。從幼鼠腹主動脈抽取4ml血液至一次性抗凝血清管,靜置10min后,使用高速冷凍離心機(3 000r/min)離心15min,取標本上清液置于-80℃冰箱保存?zhèn)溆?。獲取血液標本后,立刻予頸椎脫臼法處死幼鼠,將幼鼠腦組織置于冰臺上,使用高溫180℃可滅RNA酶的手術刀及眼科剪沿矢狀裂將腦組織分離,快速游離出海馬體,置于去RNA酶的凍存管中,放入液氮中速凍1min,并儲存于-80℃超低溫冰箱待ELISA檢測使用。

1.3 ELISA檢測(競爭法) 采用ELISA法(按照試劑盒說明書進行)檢測血清及海馬TRX及NSE的濃度。

2 檢測結(jié)果

2.1 各組幼鼠血清不同時間點TRX濃度比較 結(jié)合表1結(jié)果分析:經(jīng)過14d慢性癲癇點燃組(B、C、D)3h血清TRX濃度較A組迅速顯著升高。A組在3個時間點血清TRX濃度最低,與B、C、D組相比均有統(tǒng)計學差異(P均<0.05);B組在3個時間點血清TRX濃度最高,與A、C、D組相比均有統(tǒng)計學差異(P<0.05);在每個時間點C組血清TRX濃度均高于D組,且C、D組血清TRX均介于A、B組之間,差異有統(tǒng)計學意義(P均<0.05)。

表1 各組血清不同時間點TRX濃度比較

2.2 各組幼鼠海馬不同時間點TRX濃度比較 結(jié)合表2結(jié)果分析:經(jīng)過14d慢性癲癇點燃組(B、C、

表2 各組海馬不同時間點TRX濃度比較

D)3h海馬TRX濃度較A組迅速顯著升高。A組在3個時間點海馬TRX濃度最低,與B、C、D組相比均有統(tǒng)計學差異(P均<0.05);B組在3個時間點海馬TRX濃度最高,與A、C、D組相比均有統(tǒng)計學差異(P<0.05);在每個時間點C組海馬TRX濃度均高于D組,且C、D組海馬TRX均介于A、B組之間,差異有統(tǒng)計學意義(P均<0.05)。

2.3 各組幼鼠血清不同時間點NSE濃度比較 結(jié)合表3結(jié)果分析:經(jīng)過14d慢性癲癇點燃組(B、C、D)3h血清NSE濃度較A組迅速顯著升高。A組在3個時間點血清NSE濃度最低,與B、C、D組相比均有統(tǒng)計學差異(P均<0.05);B組在3個時間點血清NSE濃度最高,與A、C、D組相比均有統(tǒng)計學差異(P<0.05);在每個時間點C組血清NSE濃度均高于D組,且C、D組血清NSE濃度均介于A、B組之間,差異有統(tǒng)計學意義(P均<0.05)。

表3 各組血清不同時間點NSE濃度比較

2.4 各組幼鼠海馬不同時間點NSE濃度比較 結(jié)合表4結(jié)果分析:經(jīng)過14d慢性癲癇點燃組(B、C、D)3h海馬NSE濃度較A組迅速顯著升高。A組在3個時間點海馬NSE濃度最低,與B、C、D組相比均有統(tǒng)計學差異(P均<0.05);B組在3個時間點海馬NSE濃度最高,與A、C、D組相比均有統(tǒng)計學差異(P<0.05);在每個時間點C組海馬NSE濃度均高于D組,且C、D組海馬NSE濃度均介于A、B組之間,差異有統(tǒng)計學意義(P均<0.05)。

表4 各組海馬不同時間點NSE濃度比較

3 討論

3.1 NSE在癲癇治療監(jiān)測中的作用 烯醇化酶是一種二聚體糖酵解酶,有 3 種已知亞基類型和 5 種同工酶(αα、ββ、γγ、αβ 和 αγ),最初這些同工酶被認為僅存在于神經(jīng)元中[3],然而,隨后被發(fā)現(xiàn)神經(jīng)內(nèi)分泌細胞和一些非神經(jīng)元和非神經(jīng)內(nèi)分泌細胞也含有NSE。膠質(zhì)細胞僅含有 αα-烯醇化酶,而 γγ-烯醇化酶對神經(jīng)元(NSE)具有特異性,它特異性表達于神經(jīng)元與神經(jīng)內(nèi)分泌細胞內(nèi),為糖酵解途徑中的關鍵酶,催化2-磷酸甘油酸轉(zhuǎn)變?yōu)榱姿嵯┐急?正常情況下處于低水平表達。當神經(jīng)元細胞膜受到損傷時,很容易彌散到細胞外介質(zhì)和腦脊液中,其血清的半衰期>20h,神經(jīng)元損傷和血腦屏障完整性受損后,NSE 釋放至腦脊液并最終進入血液,可對其進行檢測,因此,在與中樞或外周神經(jīng)系統(tǒng)細胞損傷相關的各種疾病中,NSE 被視為神經(jīng)元損傷和預后的標志物。近十年來國內(nèi)外已發(fā)表了多篇關于癲癇發(fā)作和癲癇持續(xù)狀態(tài)后 NSE 升高的報道[4-5]。Rituparna Maiti等人[6]也通過實驗證實了卡馬西平及奧卡西平等常見抗癲癇藥物治療后均可以使血清NSE水平下降。因此在臨床癲癇治療過程中,血清NSE既可以作為癲癇輔助診斷的一個標志物,同時,對于抗癲癇藥物治療后的療效判斷也是一個非常好用的工具。

3.2 TRX在癲癇治療監(jiān)測中的作用 國內(nèi)外已有眾多報道及實驗[7]證明,氧化應激被認為是癲癇腦損傷的發(fā)病機制之一。在癲癇發(fā)作時,由于大腦對氧的高利用率反而更容易受到氧化應激損傷,主要表現(xiàn)為自由基的產(chǎn)生增加、細胞內(nèi)線粒體的功能障礙[8]等,其中,TRX是一種氧化還原蛋白,一種小型、多功能蛋白,在活性部位含有氧化還原活性二硫醇的保守活性位點序列,TRX以其調(diào)節(jié)氧化還原和清除活性氧中間體的活性,在細胞內(nèi)和細胞外的胞內(nèi)和胞外具有多種重要的生物學作用。TRX是中樞膽堿能神經(jīng)元的神經(jīng)調(diào)節(jié)因子,在機械性腦損傷中被上調(diào),當癲癇發(fā)作時出現(xiàn)氧化應激損傷,海馬及皮層TRX的蛋白表達水平可上調(diào)2～3倍,TRX蛋白表達水平的上調(diào)可活化半胱氨酸蛋白酶-3,活化的半胱氨酸蛋白酶-3在海馬區(qū)可誘導神經(jīng)元凋亡。相對于皮層,海馬更容易受到氧化損傷,故本實驗除了采集標本易得的血液,同時檢測海馬TRX濃度。

3.3 mNGF對癲癇的干預作用 神經(jīng)生長因子(NGF)是神經(jīng)營養(yǎng)因子家族的成員之一,在神經(jīng)元的發(fā)育、軸突的生長、神經(jīng)遞質(zhì)的合成、神經(jīng)元細胞的凋亡、炎性痛覺過敏等方面發(fā)揮著至關重要的調(diào)節(jié)作用[9]。NGF 通過結(jié)合細胞表面的特異性受體,包括酪氨酸激酶 A (TrkA) 和 p75 神經(jīng)營養(yǎng)因子受體 (p75NTR) 來發(fā)揮生物學效應[10]。TrkA 對 NGF 具有高親和力,NGF-TrkA 信號通路的激活可促進部分細胞增殖、存活或轉(zhuǎn)移[11-13]。TrkA 的激活對癲癇發(fā)作模型大腦中神經(jīng)元的起保護作用。mNGF是從小鼠頜下腺提取的純化生物蛋白,相對分子質(zhì)量為26500,由于與人 NGF 具有同源性,mNGF作為藥物應用于人類多種中樞神經(jīng)系統(tǒng)和外周系統(tǒng)疾病的治療,是目前研究最多的外源性神經(jīng)生長因子,尤其是周圍神經(jīng)損傷和顱腦外傷的修復效果顯著[14]。本實驗中通過對4個小組血清、海馬TRX及NSE濃度的比較顯示,B組(EP組)即使用PTZ建立慢性癲癇幼鼠未使用任何干預劑,血清及海馬的TRX及NSE濃度在4個時間段監(jiān)測均處于最高水平,比較均有統(tǒng)計學差異(P<0.05),而C組即采用mNGF對慢性癲癇幼鼠進行干預后的幼鼠血清及海馬的TRX、NSE濃度均較B組下降,但高于A組,比較均有統(tǒng)計學差異(P<0.05),由此推測癲癇患兒反復癲癇發(fā)作,大腦損傷持續(xù)存在,而mNGF對癲癇造成的神經(jīng)系統(tǒng)損傷具有明顯保護作用。

3.4 LPS-RS的神經(jīng)保護性作用 Toll樣受體4(TLR4)在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中廣泛存在,神經(jīng)元細胞、小膠質(zhì)細胞、星形膠質(zhì)細胞和少突膠質(zhì)細胞均有表達,其中在小膠質(zhì)細胞中表達最多。TLR4在神經(jīng)系統(tǒng)免疫炎癥中發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用,一旦激活,TLR4 可誘導細胞內(nèi)多條信號轉(zhuǎn)導通路,并最終促進生成許多介導炎癥反應的促炎因子[15]。炎癥是癲癇發(fā)生病理生理機制的重要促進因素,減輕炎癥有助于縮小癲癇的范圍和程度,有報道稱LPS-RS是TLR4的有效抑制劑,是一種來源于紅假單胞菌的脂多糖,可以通過競爭TLR4的受體來阻斷TLR4信號通路引起的炎癥反應。有實驗研究[16]已證實LPS-RS的最佳干預劑量為0.1mg/kg,故本實驗以此為干預劑量進行實驗,通過檢測血清及海馬的TRX濃度和NSE濃度來反映LPS-RS對癲癇的干預作用。結(jié)果顯示D組(LPS-RS組)干預后幼鼠血清及海馬的TRX濃度及NSE濃度均較B組(EP組)下降,且低于C組(mNGF組),說明LPS-RS對慢性癲癇幼鼠癲癇發(fā)作有抑制作用,通過抑制TLR4介導的信號通路抑制中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥級聯(lián)反應,從而減輕神經(jīng)損傷,減少癲癇發(fā)作。同時,相較于mNGF對癲癇幼鼠的干預作用,LPS-RS的作用效果更佳。通過本動物實驗結(jié)果表明,LPS-RS可能嘗試作為一種新型的抗癲癇藥物應用于臨床,但目前仍缺乏大樣本數(shù)據(jù)作為依托,且藥物使用時間、應用于人類的物種差異性等問題皆是下一步我們需要面對的難題,攻克癲癇治療的前路道阻且長。

綜上所述,LPS-RS對癲癇的神經(jīng)損傷起保護作用,可作為癲癇治療研究的靶點。 mNGF能夠修復癲癇反復發(fā)作后的神經(jīng)損傷,對神經(jīng)元起保護作用。血清TRX、NSE可以作為癲癇治療監(jiān)測的指標。