何 冉,石 磊,楊光友

(四川農(nóng)業(yè)大學,四川成都 611130)

貓耳癢螨病是由癢螨科耳螨屬(Otodectes)的螨蟲寄生在貓耳道內(nèi)而引起的寄生性耳病,寄生于宿主的皮膚表面,以宿主脫落的上皮細胞和組織液為生,是貓的主要體外寄生蟲之一。該病主要通過直接接觸和間接接觸感染,也是引起外耳炎的主要原因[1]。耳癢螨在耳道內(nèi)的活動會引起嚴重的機械刺激,最常見的臨床癥狀是明顯的瘙癢,患病貓會有經(jīng)常搔耳朵和搖頭的動作。耳道內(nèi)耳癢螨活動到體表的話,患病貓會表現(xiàn)輕度至重度皮炎,而強烈的瘙癢可能導致自殘、出血和耳血腫等現(xiàn)象[2]。耳癢螨感染偶爾造成強烈的刺激和繼發(fā)性細菌感染,從而導致患病動物發(fā)生化膿性外耳炎,嚴重影響貓的健康。目前對于耳癢螨病流行病學的調(diào)查較少[3],國內(nèi)尚無針對貓耳癢螨病感染情況的相關報道,本文對四川成都某貓舍耳癢螨病的感染情況進行了調(diào)查分析,同時對采集的耳癢螨樣品的細胞色素C氧化酶亞基Ⅰ基因(COX1)和核糖體基因第2間隔區(qū)(ITS2)基因進行擴增和測序。最后采用大寵愛和海樂妙對該貓舍中患貓進行治療效果觀察。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗用動物 四川成都某貓舍的145只不同品種和不同年齡的貓。

1.1.2 蟲體樣品 收集形態(tài)學鑒定為耳癢螨的螨蟲于1.5 mL離心管中,置于-80℃保存。

1.1.3 主要試劑與儀器 DNA提取試劑盒和PCR相關試劑,北京索萊寶科技有限公司產(chǎn)品;高速冷凍離心機、PCR儀,德國Eppendorf公司產(chǎn)品;核酸凝膠電泳儀、凝膠成像系統(tǒng),美國Bio-Rad公司產(chǎn)品;體視顯微鏡,日本Nikon公司產(chǎn)品;恒溫培養(yǎng)箱,美國Thermo公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 臨床診斷和病原檢查 寵物貓表現(xiàn)搖頭抓耳,外耳道有大量黑褐色分泌物以及耳道內(nèi)常散發(fā)出異味可初步判定為耳螨病疑似病例。刮取疑似病例耳道中黑褐色分泌物,放置于培養(yǎng)皿中,在36℃恒溫培養(yǎng)箱中孵育30 min后在顯微鏡下觀察,挑取單個螨蟲進行形態(tài)學鑒定,同時逐一記錄病例的性別、品種和年齡等相關的信息。

1.2.2 形態(tài)學特征鑒定 參考相關文獻進行形態(tài)學鑒定[4]。

1.2.3 樣品DNA提取 研磨收集到的螨蟲,按照基因組DNA提取試劑盒說明書提取DNA,并置于-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 PCR擴增 擴增COX1目的引物序列為:上游引物5′-GGTATTTGAAGAGGAATGTTGG-3′和下游引物5′-GATGACCAAAAAACCAAA ATAAATG-3′,擴增ITS2目的引物序列為:上游引物5′-CTCCGATCACTCGACATTC-3′和下游引物5′-ATCTCGCTTGATCTGAGGTCG-3′。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。PCR 擴增體系(總體積為 25 μL):2×TaqMaster Mix(Dye Plus)12.5 μL,上、下游引物各0.5 μL,模板DNA 1 μL,ddH2O 10.5 μL。PCR擴增程序:94℃預變性3 min;94℃ 1 min,54.4℃或57.5℃(COX1或ITS2) 1 min,72℃ 1 min,共35個循環(huán);72℃再延伸7 min。PCR產(chǎn)物由10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.5 COX1和ITS2序列測定及分析 將PCR陽性產(chǎn)物送至生工生物工程(上海)股份有限公司測序,利用DNAMan軟件對測序結果和NCBI上傳的耳癢螨COX1和ITS2序列進行比對分析。

1.2.6 藥物治療 從患病貓中篩選出30只確診病例隨機平均分成3組,分別為海樂妙(米爾貝肟16 mg和吡喹酮40 mg)試驗組,以3 mg/kg為劑量口服1次進行治療;大寵愛(塞拉菌素45 mg)試驗組,以6 mg/kg為劑量滴于貓咪兩肩胛骨之間的皮膚1次進行治療;空白對照組,不采取任何治療措施。

1.2.7 效果評估 治療前和治療后7 d,對每只貓的雙耳進行檢查,對每個耳朵中可見的活螨數(shù)量進行計數(shù),判定感染強度。用棉棒采集耳垢放入玻璃平皿中,置于36℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)大約30 min,取出后在體視顯微鏡下對螨蟲進行計數(shù)。

螨蟲數(shù)量統(tǒng)計方法為:在體視顯微鏡下隨機選取5個視野,若每個視野中螨蟲計數(shù)不超過10,則記為“+”。若任意視野中螨蟲數(shù)量大于10,則記為“++”。若均未發(fā)現(xiàn)蟲體,則記為0。耳道內(nèi)耳垢量的判定標準為:無耳垢(0),輕微耳垢(+),中度耳垢(++)和嚴重耳垢(+++)。在藥物治療7 d后,用相同的方法收集耳垢并統(tǒng)計螨蟲數(shù)量和耳垢量。

2 結果

2.1 臨床癥狀觀察

患貓主要表現(xiàn)為瘙癢,搖頭抓耳,外耳道有大量黑褐色分泌物(圖1)。少量患貓因瘙癢用爪部對耳周進行抓撓,導致耳朵后部或基部形成開放性結痂皮膚傷口。該病主要發(fā)病于耳道內(nèi),少數(shù)患病貓會造成全身性的病變。

圖1 患貓外耳道有大量黑褐色分泌物

2.2 蟲體形態(tài)學觀察

犬耳癢螨(Otodectescynotis)形態(tài)學特征主要區(qū)別在于第1對足和第2對足具有短柄的前跗,第3對足和第4對足的末端具有鞭狀剛毛,第4對足相對更短,生殖器為橫切開口。本試驗采集樣品經(jīng)過形態(tài)學鑒定為犬耳癢螨(Otodectescynotis)(圖2)。

圖2 犬耳癢螨形態(tài)

2.3 分子鑒定

瓊脂凝膠電泳檢測結果顯示擴增的7個樣品的COX1序列大小均為600 bp左右(圖3),10個樣品的ITS2序列大小均為300 bp左右(圖4),與預期結果相符。測序結果顯示獲得的COX1和ITS2序列長度分別為655 bp和324 bp。其中7個樣品COX1序列與GenBank公布的犬耳癢螨(Otodectescynotis)COX1中國西安株同源性為99.08%～100%,10個樣品的ITS2序列和犬耳癢螨德國慕尼黑株ITS2 (AF367699)序列相似性為99.69%～100%,從分子水平確定本試驗中擴增的螨蟲是犬耳癢螨(Otodectescynotis)。

M.DNA標準DL 2 000; 1～7.COX1-1～COX1-7M.DNA Marker DL 2 000; 1-7.COX1-1～COX1-7

M.DNA標準DL 2 000;1-10.ITS2-1～ITS2-10M.DNA Marker DL 2 000; 1-10.ITS2-1-ITS2-10

2.4 耳癢螨感染情況

經(jīng)過臨床診斷和病原學鑒定,該貓舍確診耳癢螨感染的貓81例,耳螨病陽性率為55.9%。分別統(tǒng)計了不同性別貓的耳癢螨病感染情況,發(fā)現(xiàn)公貓患耳癢螨病的陽性率為40.0%(18/45),母貓患耳癢螨病的陽性率為60.0%(60/100)。同時,根據(jù)確診結果發(fā)現(xiàn)幼齡的貓更易感染耳癢螨,其中2～4月齡的貓感染率為64.3%(9/14),12～24月齡的貓感染率為54.9%(72/131)。

該貓舍的擁有7個品種的貓,通過臨床診斷和病原學鑒定發(fā)現(xiàn),加菲貓的感染率最高,其次分別為暹羅貓、美國短毛貓、英國短毛貓和豹貓,布偶貓和德國卷毛貓無感染病例(表1)。

表1 不同品種貓的耳癢螨感染情況

2.5 效果評價

大寵愛治療后,該試驗組貓耳道內(nèi)均未發(fā)現(xiàn)耳癢螨(表2)。而海樂妙試驗組及空白對照組貓耳道內(nèi)耳螨數(shù)量無明顯變化。同時,空白對照組貓耳道內(nèi)耳垢出現(xiàn)增多的情況,而大寵愛和海樂妙治療的患貓均有耳垢量均減少(表3)。

表2 貓治療前后耳癢螨感染強度的變化情況

表3 貓治療前后耳道內(nèi)耳垢量的變化情況

3 討論

犬耳癢螨通過與受感染的動物直接接觸傳染,具有高度傳染性,可以感染多種動物,例如犬、貓、狐貍和雪貂,偶爾還會感染人[5]。我國針對犬和貓耳癢螨病的流行病學調(diào)查報道較少,更多為針對犬螨病的調(diào)查研究。中國寵物行業(yè)白皮書數(shù)據(jù)顯示,2020我國城鎮(zhèn)寵物犬貓數(shù)量突破1億只,其中寵物貓的數(shù)量在逐年上升,僅2020年就增加了10.2%,數(shù)量接近5 000萬只。隨著寵物貓數(shù)量的增多,寵物貓的健康也成為人們關注的重點。耳癢螨是貓的主要體外寄生蟲之一,也是引起外耳炎的主要原因[4],調(diào)查發(fā)現(xiàn)50%～80%的貓外耳炎病例由耳癢螨螨蟲引起[6]。

目前國內(nèi)外對于貓耳螨病的流行病學調(diào)查報道較少,僅限于少數(shù)地區(qū)。例如歐洲南部和中部的7個國家1 519只寵物貓的耳螨病陽性率為17.4%[3],在希臘則有25.5%的寵物貓被診斷為耳螨病陽性[7],另外意大利北部187只流浪貓的調(diào)查中發(fā)現(xiàn)53.3%外耳炎由耳螨病引起[6]。國內(nèi)尚無貓耳癢螨病感染情況的報道,有部分關于分子生物學的研究[14]。國內(nèi)外主要研究是對貓耳螨病藥物治療的研究[8-10]。本文對四川省成都市某貓舍耳螨病進行調(diào)查發(fā)現(xiàn),該貓舍耳螨病陽性率高達55.9%,遠遠超過了國外類似的調(diào)查。國外調(diào)查對象多為家貓,而本文調(diào)查對象為貓舍,在飼養(yǎng)環(huán)境上貓舍的貓更為密集,存在交叉感染的情況,導致調(diào)查結果陽性率偏高。同時,由于貓舍母貓的數(shù)量遠遠超過了公貓的數(shù)量,也為母貓陽性率高于公貓陽性率提供了數(shù)據(jù)基礎。其中加菲貓的陽性率在不同品種的貓中最高,主要是由于該貓舍加菲貓均飼養(yǎng)在相鄰的籠舍,并且共用飲水器和食槽,為加菲貓之間的相互傳染提供了可能。幼貓更容易感染耳螨病則主要原因是幼貓的免疫力較成年貓低。

雖然國外報道伊維菌素、多拉菌素和莫西菌素等藥物在防治貓耳螨病上效果顯著[11-12],但是國內(nèi)貓品種多,數(shù)量大,飼養(yǎng)環(huán)境復雜,寵主依從性差,科學的選擇合適我國治療貓耳螨病的藥物顯得尤為重要。目前我國對于寵物耳螨病的治療,使用的藥物包括注射藥劑,體外驅蟲劑和體內(nèi)驅蟲藥。其中,伊維菌素和多拉菌素為注射劑,使用需要專業(yè)人員操作。美貝霉素為口服或澆潑給藥,對部分體內(nèi)寄生蟲和體外寄生蟲有很好的效果[21]。國外的大寵愛對姬螯螨[13]、疥螨[14]、背肛螨[15]、跳蚤[16]、線蟲[17]等體內(nèi)外寄生蟲都有良好的驅殺效果,國內(nèi)新藥海樂妙對犬蠕形螨[18]、疥螨[19]、姬螯螨[20]、犬惡心絲蟲[21]、鉤蟲[22]、蛔蟲[23]、眼線蟲[24]等體內(nèi)外寄生蟲都有良好的驅殺效果。本文以海樂妙和大寵愛進行對照治療,發(fā)現(xiàn)以6 mg/kg的劑量使用大寵愛滴于貓咪頸后兩肩胛骨之間的皮膚1次進行貓耳癢螨病的治療,7 d后就殺螨成功率能達到100%,而以3 mg/kg的劑量口服1次海樂妙治療貓耳癢螨病,7 d后就殺螨成功率只有10%。大寵愛的主要成分是塞拉菌素,海樂妙主要成分是米爾貝肟,塞拉菌素和米爾貝肟都屬于大環(huán)內(nèi)酯類抗生素,塞拉菌素是由基因重組的阿維鏈霉菌新菌株發(fā)酵而成,米爾貝肟則是米爾貝霉素A3和A4的衍生物[25]。通過結果可以看出在以上試驗條件下,大寵愛的驅殺效果要優(yōu)于海樂妙。本次對比治療觀察時間較短,今后增加海樂妙的用藥劑量或用藥次數(shù),進一步觀察其貓耳螨的驅殺效果。