劉 莉,董洪燕,朱善元*,張 燕,鄭東宇

(1.江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院,江蘇泰州 225300;2.揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院,江蘇揚(yáng)州 225009;3.江蘇省疾病預(yù)防控制中心,江蘇南京 210009)

沙門氏菌(Salmonella)是重要的食源性致病菌之一[1],可污染食品和引起食物中毒[2],其血清型超過2 500種,具有重要的公共衛(wèi)生學(xué)意義。鴨源沙門氏菌病是由一種或者幾種沙門氏菌(主要包括鼠傷寒沙門氏菌、腸炎沙門氏菌、鴨沙門氏菌等)引起的急性或慢性疾病的總稱[3]。經(jīng)研究表明,鴨源沙門氏菌感染在鴨的原發(fā)性,繼發(fā)性或者混合感染中也較為嚴(yán)重,給養(yǎng)鴨業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失[3]?？咕幬镌邙喖?xì)菌病防治中起重要作用,但因臨床的不規(guī)范使用,造成鴨源沙門氏菌多重耐藥現(xiàn)象的頻繁發(fā)生[4],這也給鴨源細(xì)菌病的防控帶來挑戰(zhàn),因此加強(qiáng)鴨源沙門氏菌耐藥性監(jiān)測(cè),對(duì)臨床治療以及控制該病的流行提供依據(jù)。細(xì)菌分子分型可用于追溯不同來源或不同地區(qū)細(xì)菌分離株之間的流行病學(xué)關(guān)系,為細(xì)菌病的防控奠定基礎(chǔ),目前脈沖場(chǎng)凝膠電泳分子分型法(pulsed field gel electrophoresis,PFGE)仍是國(guó)際上細(xì)菌分子分型的金標(biāo)準(zhǔn)[5]。本研究采自徐州不同養(yǎng)鴨場(chǎng)患病鴨的病料,進(jìn)行細(xì)菌分離鑒定、藥敏試驗(yàn)。旨在分析6種鴨源沙門菌的血清型、耐藥性以及基因分型情況,同時(shí)建立徐州市鴨源沙門氏菌基因數(shù)據(jù)庫(kù),從而為該市的沙門氏菌病的溯源和預(yù)警提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料 病料為2020年不同養(yǎng)鴨場(chǎng)的發(fā)病鴨的心臟、肝臟、腎臟等。

1.1.2 主要試劑 LB培養(yǎng)基、麥康凱培養(yǎng)基、MH培養(yǎng)基,陸橋公司產(chǎn)品;GN生化鑒定卡,法國(guó)梅里埃公司產(chǎn)品;2×ESTaqMaster Mix,北京康為世紀(jì)公司產(chǎn)品;DNA Marker、XbaⅠ,TaKaRa公司產(chǎn)品;沙門氏菌診斷血清,泰國(guó)S&A公司產(chǎn)品;藥敏紙片,杭州微生物試劑有限公司產(chǎn)品;Sodium Lauroyl Sarcosine、SDS、蛋白酶K,Amresco公司產(chǎn)品;SeaKem Gold Agarose瓊脂糖,Lonza公司產(chǎn)品;5×TBE、Tris-cl、EDTA,索萊寶公司產(chǎn)品;GelRed染劑,Biotium公司產(chǎn)品。

1.1.3 主要儀器設(shè)備 PCR儀、瓊脂糖水平電泳儀、CHEF Mapper電泳儀以及凝膠成像系統(tǒng),美國(guó)Bio-Rad公司產(chǎn)品;比濁儀、VITEK 2 COMPACT全自動(dòng)微生物鑒定系統(tǒng),法國(guó)梅里埃公司產(chǎn)品;高速冷凍離心機(jī),德國(guó)Eppendorf公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)菌的分離鑒定 用接種環(huán)無菌采取患病鴨心臟、肝臟、腎臟等病料劃線接種于麥康凱鑒別培養(yǎng)基中,37℃培養(yǎng)24 h觀察菌落形態(tài),再挑取疑似菌株分別轉(zhuǎn)接于TSB培養(yǎng)基,37℃、180 r/min培養(yǎng)18 h,其鑒定的方法按吳曉君等方法進(jìn)行[6],其PCR結(jié)果送擎科生物科技有限公司測(cè)序后進(jìn)行序列的比對(duì)分析。

1.2.2 生化和血清學(xué)鑒定 將分離到的6株鴨源沙門氏菌運(yùn)用GN生化鑒定卡經(jīng)VITEK微生物生化鑒定儀進(jìn)行鑒定;血清型按泰國(guó)S&A公司沙門氏菌診斷血清試劑盒相關(guān)步驟以及結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行判定。

1.2.3 藥敏試驗(yàn) 采用世界動(dòng)物衛(wèi)生組織推薦的瓊脂擴(kuò)散法 進(jìn)行,首先選取27種藥敏紙片包括氨芐西林、阿莫西林、頭孢曲松、頭孢拉定、頭孢吡肟、鏈霉素、卡那霉素、丁胺卡那、慶大霉素、新霉素、大觀霉素、四環(huán)素、諾氟沙星、環(huán)丙沙星、洛美沙星、氯霉素、氟苯尼考、紅霉素、阿奇霉素、復(fù)方新諾明、磺胺異噁唑、多黏菌素B、克林霉素、利福平和甲氧芐氨嘧啶,再將分離株新鮮菌液涂布于MH瓊脂平板,用無菌鑷子將藥敏片貼于培養(yǎng)基表面,37℃培養(yǎng)24 h,同時(shí)設(shè)大腸埃希菌ATCC 25922作對(duì)照,根據(jù)判定結(jié)果分為敏感株、中介(中等耐藥株) 、耐藥株。

1.2.4 PFGE分型 參照美國(guó)PulseNet公布的沙門氏菌PFGE標(biāo)準(zhǔn)化方案進(jìn)行[7],將沙門氏菌分離株經(jīng) SeaKemGlod Agarose包埋后,運(yùn)用限制性內(nèi)切酶XbaⅠ酶切后進(jìn)行脈沖場(chǎng)凝膠電泳,最后經(jīng)Gelred染色成像經(jīng)Bionumerics5.1軟件聚類分析。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌的分離鑒定

經(jīng)PCR鑒定結(jié)果(圖1)表明,6株分離株均擴(kuò)增出250 bp的目的條帶,經(jīng)測(cè)序比對(duì)分析結(jié)合生化試驗(yàn)結(jié)果(葡萄糖、麥芽糖、甘露醇產(chǎn)酸產(chǎn)氣,MR和枸櫞酸鹽試驗(yàn)為陽(yáng)性,不發(fā)酵乳糖、蔗糖,吲哚和VP試驗(yàn)為陰性),表明共分離到6株沙門氏菌。

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000; 1～6.鴨源沙門氏菌分離菌株

2.2 血清學(xué)鑒定

6株鴨源沙門氏菌分離株經(jīng)血清型鑒定,結(jié)果表明3株為鼠傷寒沙門氏菌,占50%;剩余3株分別為切徹斯沙門氏菌(16.67%)、圖莫迪沙門氏菌(16.67%)、格洛斯特沙門氏菌(16.67%)。

2.3 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

6株鴨源沙門氏菌運(yùn)用21種常用抗菌藥物藥敏試驗(yàn)結(jié)果(表1)顯示,6株鴨源沙門氏菌對(duì)克林霉素耐藥性最高,為100%,其次是頭孢吡肟、頭孢拉定、慶大霉素、紅霉素、復(fù)方新諾明、多黏菌素B,為66.67%;對(duì)甲氧芐氨嘧啶最敏感,達(dá)100%,其次是氯霉素、四環(huán)素,達(dá)83.33%。

表1 6株鴨源沙門氏菌分離株對(duì)不同藥物的敏感性比例

6株鴨源沙門氏菌分離株都具有多重耐藥性(圖2),最高達(dá)18種抗菌藥物耐藥,多重耐藥性達(dá)5重及以上的,占100%。

圖2 鴨源沙門氏菌多重耐藥性圖

2.4 鴨源沙門氏菌PFGE分型

6株鴨源沙門菌的 PFGE 圖譜經(jīng) Bionumerics5.1 軟件分析表明(圖3),共6種帶型,相似度達(dá) 53.8% 以上。3株鼠傷寒沙門氏菌(2020XZ-1SM、2020XZ-2SM、2020XZ-3SM)共有3種帶型,相似度達(dá)53.8%,其中2020XZ-2SM和2020XZ-3SM相似度達(dá)78.3%;而3種不同血清型的分離株相似度達(dá)62.9%,其中2020XZ-4SM和2020XZ-6SM相似度達(dá)76.9%。

3 討論

沙門氏菌是重要的人畜共患病病原之一。攜帶沙門氏菌的動(dòng)物性食品包括肉、蛋類等也是沙門氏菌傳播的重要傳染源,鴨肉具有低脂肪和高蛋白的特點(diǎn),更有利于沙門氏菌的存在[8];同時(shí)鴨獨(dú)特的生活特性使其更容易成為隱性帶菌者[1],因此,加強(qiáng)鴨源沙門氏菌病的研究具有重要意義。本研究通過PCR鑒定結(jié)合生化試驗(yàn),確定共分離到6株鴨源沙門氏菌。血清學(xué)試驗(yàn)表明6株沙門氏菌分離株的優(yōu)勢(shì)血清型為鼠傷寒沙門氏菌,這與其他地區(qū)不同[9],具有區(qū)域性。

沙門氏菌病在臨床治療時(shí),因使用抗菌藥物的廣泛使用以及濫用導(dǎo)致其耐藥性特別是多重耐藥性在世界范圍內(nèi)暴發(fā)并擴(kuò)散,給全球公共衛(wèi)生帶來了巨大威脅[10]。研究發(fā)現(xiàn)河南與浙江地區(qū)沙門氏菌分離株對(duì)頭孢哌酮、四環(huán)素、諾氟沙星、吡哌酸、甲氧芐氨嘧啶耐藥率高[11];對(duì)四川遂寧某鴨場(chǎng)分離的沙門氏菌進(jìn)行耐藥性試驗(yàn)表明,4 株沙門氏菌分離株對(duì)四環(huán)素、復(fù)方新諾明、阿莫西林耐藥性最高[2];對(duì)云南不同地區(qū)鴨源沙門氏菌分離株研究表明,其對(duì)林可霉素、青霉素、土霉素、強(qiáng)力霉素、紅霉素、羅紅霉素耐藥[12]。本研究6株鴨源沙門氏菌分離株主要對(duì)林可酰胺類(克林霉素)耐藥性最高,其次是對(duì)頭孢類(頭孢吡肟、頭孢拉定)、氨基糖苷類(慶大霉素)、大環(huán)內(nèi)酯類(紅霉素)、磺胺類(復(fù)方新諾明)以及多肽類(多黏菌素B),同時(shí)多重耐藥性嚴(yán)重,達(dá)100%;對(duì)甲氧芐氨嘧啶、氯霉素、四環(huán)素較敏感。因此,各地區(qū)耐藥譜和多重耐藥性情況都存在差異,這跟各地藥物選擇、藥物使用頻率和藥物使用合理度都有關(guān),通過藥敏試驗(yàn)選擇合適的抗菌藥物仍是治療鴨源沙門氏菌的最佳選擇。

PFGE是一種非常有效的細(xì)菌分子分型的方法,可用于分析不同來源或不同地區(qū)菌株之間的遺傳多樣性,從而發(fā)現(xiàn)暴發(fā)、識(shí)別傳染源(污染源)及推測(cè)流行范圍[13]。對(duì)廈門139株不同來源的沙門氏菌進(jìn)行分子分型表明優(yōu)勢(shì)帶型為PT51,包含的菌株均為腸炎沙門氏菌帶型[14];對(duì)90株人源沙門氏菌進(jìn)行PFGE分型發(fā)現(xiàn)以鼠傷寒沙門氏菌以及腸炎沙門氏菌的帶型為主[15]。本研究的6株鴨源沙門氏菌分離株共6種帶型,基因型成多樣性,相似度大于50%,具有流行相關(guān)性,但目前未有暴發(fā)流行株,這可能與本研究分離的菌株較少,未得出該地區(qū)的鴨源沙門氏菌的流行趨勢(shì)有關(guān),試驗(yàn)也將繼續(xù)收集鴨源沙門氏菌,努力豐富該地區(qū)的鴨源沙門氏菌數(shù)據(jù)庫(kù),爭(zhēng)取為鴨源沙門氏菌的防控提供更多依據(jù)。