唐姣連，張曉琳，張志磊，南巍巍，薛麗，蔣海燕，張楨，孫強(qiáng)明，蔣鴻超

1.昆明市兒童醫(yī)院（昆明醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院），云南昆明650228；2.大理大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，云南大理671000；3.昆明市兒童醫(yī)院兒科研究所／云南省兒童重大疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南昆明650228；4.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所云南省重大傳染病疫苗研發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南昆明650118

手足口病（hand，foot and mouth disease，HFMD）和皰疹性咽峽炎（herpangina，HA）均是臨床常見的小兒病毒感染性疾病。HFMD 與HA 的易感人群相似，均好發(fā)于6歲以下兒童，且男性多于女性［1-5］。YAO等［6］和劉丹等［7］發(fā)現(xiàn)，HFMD 與HA 在一些臨床癥狀上表現(xiàn)相似，但HA患者中發(fā)熱、咽痛、嘔吐及頭痛癥狀的發(fā)生率均高于HFMD患者。也有研究指出，HFMD與HA 在臨床上存在相互轉(zhuǎn)化的情況［8-10］，劉牧等［11］研究發(fā)現(xiàn)，若HA患兒熱度高、熱程長(zhǎng)，心率、血壓、呼吸變化明顯，且伴有食欲減退、嘔吐、腹瀉和／或伴有易驚、嗜睡的癥狀，則發(fā)展為HFMD 的可能性更大。HFMD 與HA 均可由多種腸道病毒感染引起，病原菌譜高度重合［12］。劉丹等［7］、PENG 等［12］和周艷玲等［13］的研究結(jié)果表明，國(guó)內(nèi)外近幾年引起HFMD 的病原體主要是柯薩奇病毒A6 型（Coxsackievirus A6，CVA6）、腸道病毒71型（enterovirus 71，EV71）及柯薩奇病毒A16型（Coxsackievirus A16，CVA16），引起HA的病原體主要是CVA6、柯薩奇病毒A2 型（Coxsackievirus A2，CVA2）、柯薩奇病毒A8型（Coxsackievirus A8，CVA8）。OGI等［14］研究發(fā)現(xiàn)，日本兵庫(kù)縣引起HFMD與HA的主要病原體為CVA6。

CVA6 的基因組由5'非編碼區(qū)（5'UTR）、開放閱讀框（open reading frame，ORF）、3'非編碼區(qū)（3'UTR）組成，其中的編碼區(qū)主要包括P1、P2、P3 區(qū)［15-16］。檢索文獻(xiàn)庫(kù)發(fā)現(xiàn)，以往有關(guān)HFMA 與HA的研究主要集中在臨床特征、病原學(xué)特征以及流行病學(xué)特征的區(qū)別，而對(duì)HFMD 與HA 的主要病原體CVA6 開展全基因遺傳特征差異研究的報(bào)道較少。本研究對(duì)2018年云南省17 株引起HFMD 與HA 的CVA6 全基因組特征進(jìn)行分析，了解不同致病CVA6 之間的基因差異，以期為進(jìn)一步探討引起HFMD 與HA 的CVA6 毒力變異情況奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1樣本 收集昆明市兒童醫(yī)院（昆明醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院）2018 年經(jīng)臨床實(shí)驗(yàn)室采用RT-qPCR 法確認(rèn)腸道病毒陽(yáng)性的3 541份糞便樣本，隨機(jī)抽取臨床診斷為HFMD 及HA 的患兒糞便樣本1 909 份［17］，送實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行初步處理及病毒核酸的提取。本研究已獲得昆明市兒童醫(yī)院倫理委員會(huì)的審批，并取得研究對(duì)象監(jiān)護(hù)人的知情同意。

1.2主要試劑及儀器 OMEGA Viral RNA Kit購(gòu)自美國(guó)Omega生物技術(shù)有限公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和TaKaRa Mix購(gòu)自寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司；PCR 儀購(gòu)自新加坡ABI藝思高科技有限公司。

1.3樣本的初步處理及病毒核酸提取 挑取約2 g糞便樣本置于1.5 mL離心管中，加入200μL PBS，混勻，800×g離心10 min，吸取上層液體于新的1.5 mL離心管中，800×g離心10 min，再次吸取上層液體于新的1.5 mL 離心管中，用OMEGA Viral RNA Kit 提取病毒RNA，使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，合成cDNA，反應(yīng)體系如下：5 × gDNA Buffer 2μL，總RNA 8 μL，混勻離心后42 ℃孵育3 min；加入10 × King RT Buffer 2 μL，F(xiàn)astKing RT Enzyme Mix 1 μL，F(xiàn)QRT Primer Mix 2μL，Rnase-Free ddH2O 5μL，于42 ℃孵育15 min，95 ℃孵育3 min。

1.4腸道病毒分型 以合成的cDNA 為模板，使用馬紹輝等［18］設(shè)計(jì)的腸道病毒通用引物［EntAF：5'-TNCARGCNGARACNGG-3'（4 604-4 619）；EntAR0：5'-ANGGRTTNGTNGMWGTYTGCCA-3'（2939-2960）；EntAR1：5'-GGNGGNACRWACATRTAYTG-3'（2 882-2 901），由擎科生物技術(shù)有限公司合成］于25μL反應(yīng)體系中，使用試劑盒TaKaRa Mix進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件：98 ℃2 min；98 ℃10 s，Tm 30 s，72 ℃1 min，38個(gè)循環(huán)；72 ℃10 min，4 ℃保存。PCR產(chǎn)物送至擎科生物技術(shù)有限公司測(cè)序，并將序列上傳至NCBI網(wǎng)站進(jìn)行比對(duì)。不同引物對(duì)應(yīng)的Tm：CVA6-1F／1R 57 ℃；CVA6-2F／2R 57.2 ℃；CVA6-3F／3R 58 ℃；CVA6-4F／4R 59.5 ℃；CVA6-5F／5R 59 ℃；CVA6-6F／6R 56 ℃；CVA6-7F／7R 56 ℃；CVA6-8F／8R 54 ℃；CVA6-9F／9R 56.2 ℃；EntAF／EntAR0 52.1 ℃；EntAF／EntAR1 49.2 ℃。

1.5全基因序列的獲得 以同源性最高的MH536772作為參考株，采用Primer 6 軟件設(shè)計(jì)CVA6 全基因引物（引物序列見表1，由擎科生物技術(shù)有限公司合成）。PCR 擴(kuò)增特異核酸片段，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分析，陽(yáng)性樣本送擎科生物技術(shù)有限公司測(cè)序，利用BioEdit軟件進(jìn)行拼接后得到全基因序列。

表1 引物信息Tab.1 Primer information

1.6全基因序列的比對(duì)分析 使用Heml 1.0 軟件繪制熱圖，比較17 株CVA6 全基因序列的氨基酸及核苷酸相似性。使用MEGA 7.0 軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，從GenBank 下載28 條國(guó)內(nèi)外CVA6 全基因組序列作為參考株，選取CVA16 原型株G-10 作為組外對(duì)照株［19］，方法采用Neighbor Joining 法，Bootstrap 值設(shè)定為1 000。應(yīng)用Simpolt 軟件的Simpolt 及Bootscan 功能對(duì)HFMD、HA代表株與近幾年流行的19條腸道病毒A組進(jìn)行同源重組分析。使用Phyre2（http：／／www.sbg.bio.ic.ac.uk／phyre2）進(jìn)行蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)。最終獲得的17株CVA6全基因序列已上傳GenBank，基因序列登錄號(hào)：OL839934（HA274／YunN）、OL8-39935（HA295／YunN）、OL839936（HA296／YunN）、

2 結(jié)果

2.1樣本分型 采用腸道病毒通用引物檢測(cè)并測(cè)序后確定CVA6陽(yáng)性樣本929份，其中診斷為HFMD的564份，診斷為HA 的365份；最終共獲得CVA6全基因序列17株（9株來自HFMD患兒，8株來自HA患兒）。

2.2同源性及相似性分析 17株云南CVA6全基因長(zhǎng)度均為7 434 bp，同源性分析顯示，17 株CVA6 全基因組序列的核苷酸和氨基酸同源性分別為80.5%~80.9%和94.5%~95.6%。其中，8株引起HA的CVA6核苷酸和氨基酸序列同源性分別為80.5%~80.9%和94.9%~95.6%；9株引起HFMD的CVA6核苷酸和氨基酸序列同源性分別為80.5%~80.8%和94.5%~95.1%。17 株CVA6 全基因各片段的核苷酸及氨基酸相似性比較分析顯示，5'UTR、P1、P2、3'UTR 區(qū)均具有較高的核苷酸及氨基酸相似性，P3 區(qū)亦有較高的氨基酸相似性，但其核苷酸相似性較5'UTR、P1、P2、3'UTR區(qū)略低，見圖1。

圖1 17 株CVA6 全基因與CVA6 原型株核苷酸、氨基酸相似性比較熱圖Fig.1 Heat map of nucleotide and amino acid similarity between CVA6 gene of 17 strains and CVA6 prototype strain

2.3系統(tǒng)進(jìn)化樹分析 全基因進(jìn)化樹顯示，17 株云南CVA6與28條參考株在進(jìn)化樹中形成了Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ等4 個(gè)分支，17 株CVA6 均處于Ⅳ分支；HA321／Yunnan 株與2014 年的湖南株（MN845769）、2014 年的北京株（MF285648）以及2016 年的北京株（MF28-5672）3 株親緣關(guān)系較近；HA330／Yunnan、HF275／Yunnan 及HF288／Yunnan 3 株與2014 年的深圳株（KX595285）、湖南株（MN845770）的親緣關(guān)系較近；另外7株引起HFMD的CVA6及6株引起HA的CVA6均與2018年的黑龍江株（MN845848、MN845847）、北京株（MN845811、MN845809）、2017 年山東株（MN8-45872）、河南株（MN845842、MN845841）以及天津株（MN845875）親緣關(guān)系較近。見圖2。全基因組遺傳進(jìn)化分析表明，引起HFMD 與HA 的17 株云南CVA6病毒株之間具有較近的親緣關(guān)系。

圖2 云南省17株CVA6全基因組系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.2 Phylogenetic tree of 17 CVA6 strains in Yunnan Province

從GenBank中選取19株近幾年流行的腸道病毒A 組病毒，并將其全基因序列與本研究涉及的17 株CVA6 在5'UTR、P1、P2 及P3 區(qū)進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析，結(jié)果顯示，在5'UTR 區(qū)進(jìn)化樹中，17 株云南CVA6 病毒株聚集在一起，且與1株2018年的法國(guó)CVA6流行株（MT814616）親緣關(guān)系最近，提示云南CVA6 在5'UTR 區(qū)發(fā)生重組的可能性較小，且序列相對(duì)保守，見圖3A；在P1、P2 區(qū)進(jìn)化樹中，17 株云南CVA6 病毒株形成集簇，仍與法國(guó)CVA6 流行株親緣關(guān)系最近，但HA321單獨(dú)與法國(guó)CVA6流行株形成1個(gè)小分支，提示HA321 在進(jìn)化過程中發(fā)生了一定程度的變異，見圖3B 和3C；在P3 區(qū)進(jìn)化樹中，有16 株云南CVA6病毒株與法國(guó)CVA6流行株形成集簇，HA321單獨(dú)形成1 個(gè)分支，提示HA321 在P3 區(qū)發(fā)生的變異程度較大，見圖3D。

圖3 云南省17株CVA6的5'UTR（A）、P1（B）、P2（C）、P3（D）區(qū)進(jìn)化樹分析Fig.3 Phylogenetic tree analysis of 5'UTR（A），P1（B），P2（C）and P3（D）of 17 CVA6 strains in Yunnan Province

2.4重組分析 根據(jù)上述結(jié)果，挑選在P1、P2、P3 區(qū)單獨(dú)形成分支的HA321（HA 代表株），其他分支中挑選HF275（HFMD 代表株），與19 株腸道病毒A 組流行株進(jìn)行重組分析。Simplot 相似性分析結(jié)果顯示，HA321 與HF275 在5'UTR、P1、P2、P3 區(qū)均與CVA6流行株有較高的相似性，但在P3 區(qū)的3D 區(qū)與CVA6流行株的相似性降低，見圖4A、4B，與上述分區(qū)系統(tǒng)進(jìn)化樹中的結(jié)果一致。Bootscan重組分析結(jié)果顯示，HA321、HF275 與CVA6 流行株均未發(fā)生明顯重組，但在3D區(qū)發(fā)生了較大程度的變異，見圖4C、4D。

圖4 云南省CVA6 HA321、HF275全基因組序列Simplot（A、B）和Bootscan（C、D）分析Fig.4 Simplot（A，B）and Bootscan（C，D）analysis of whole genome sequences of CVA6 strains HA321 and HF275 in Yunnan Province

2.5結(jié)構(gòu)蛋白P1 區(qū)氨基酸位點(diǎn)分析 進(jìn)一步分析CVA6 編碼結(jié)構(gòu)蛋白（VP1、VP2、VP3、VP4）的P1 區(qū)氨基酸突變情況，結(jié)果表明，與CVA6 原型株Gudala相比，8 株引起HA 的CVA6 共有51 個(gè)氨基酸位點(diǎn)發(fā)生了突變，突變位點(diǎn)數(shù)在VP4、VP2、VP3、VP1區(qū)的分布分別為13、15、8、15個(gè)；9株引起HFMD 的CVA6共有44個(gè)氨基酸位點(diǎn)發(fā)生了突變，突變位點(diǎn)數(shù)在VP4、VP2、VP3、VP1 區(qū)的分布分別為10、10、8、16 個(gè)。其中HFMD 與HA 的共同突變位點(diǎn)為37 個(gè)，突變位點(diǎn)數(shù)在VP4、VP2、VP3、VP1 區(qū)的分布分別為10（A7T、Q8E、T12S、I14V、T47A、T51A、S55R、A60T、K62R、A64V）、9（V87G、G109E、V194A、V195A、E227N／S、V230E、I241V、F249Y、A286V）、7（L327F、R373Q、N390S、T467A、S533T、E545R／K、R559Q）、11個(gè)（S570T、I573V、N575S、T579A、G725S、I739V、A741S、S759T、F826L、A844T、F870S）。8 株引起HA 的CVA6 與9 株引起HFMD 的CVA6 均發(fā)生突變且突變位點(diǎn)不一致的共有3 個(gè)，均分布在VP1 區(qū)，具體突變情況：597 位點(diǎn)由S 突變成T（S597T）、705 位點(diǎn)由Q 突變成L（Q705L）、663位點(diǎn)由Q突變成L（Q663L），前2個(gè)突變位點(diǎn)均發(fā)生在8 株引起HA 的CVA6 中，第3 個(gè)突變位點(diǎn)發(fā)生在9株引起HFMD的CVA6中。見圖5。

圖5 結(jié)構(gòu)蛋白P1氨基酸突變分析Fig.5 Amino acid mutation analysis of structural protein P1

2.6VP1 二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè) HA321、HF275 的VP1 蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)與CVA6原型株一致，未發(fā)生改變，見圖6。

圖6 VP1 二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)分析CVA6-Gdula（A）、HA321（B）、HFMD275（C）可能的二級(jí)結(jié)構(gòu)Fig.6 Prediction analysis of VP1 secondary structure，possible secondary structures of CVA6-Gdula（A），HA321（B）and HFMD275（C）

3 討論

HFMD和HA均是由腸道病毒引起的兒童常見感染病。在易感人群及臨床癥狀方面，HFMD 與HA 具有極大的相似性，且二者在臨床上存在相互轉(zhuǎn)化的情況［1-10］。國(guó)內(nèi)外研究數(shù)據(jù)表明，HFMD 與HA 的病原譜高度重合，且CVA6為主要病原體［12-14］。因此，本研究主要進(jìn)行了2018 年云南省昆明市兒童醫(yī)院17株引起HFMD 與HA 的CVA6 全基因組序列分析，以發(fā)現(xiàn)引起HFMD與HA的CVA6之間的基因差異。

本研究獲得的17 株云南CVA6 基因組核苷酸數(shù)目均為7 434 bp。同源性分析發(fā)現(xiàn)，17 株云南CVA6中，引起HFMD的CVA6核苷酸和氨基酸序列同源性分別為80.5%~80.8%和94.5%~95.1%，引起HA的CVA6 核苷酸和氨基酸序列同源性分別為80.5% ~80.9%和94.9% ~95.6%，同源性基本一致，表明引起HFMDA與HA的CVA6間基因序列差異較小。

本研究選取國(guó)內(nèi)外28 條CVA6 全基因組序列構(gòu)建進(jìn)化樹，全基因系統(tǒng)進(jìn)化樹分析表明，17 株云南CVA6 與28 條參考株在進(jìn)化樹中形成了Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ等4個(gè)分支，17株云南CVA6均處于Ⅳ分支，其中，1 株引起HA 的CVA6（HA321）與湖南株、北京株單獨(dú)形成集簇，表明HA321與湖南株、北京株親緣關(guān)系較近。其余16 株云南CVA6 與深圳株、湖南株、黑龍江株、北京株、山東株、天津株及河南株親緣關(guān)系較近。對(duì)比廣東省CVA6 全基因特征的研究［19］，處于不同進(jìn)化樹分支的病毒間具有明顯的序列差異，而本研究中17株云南CVA6均處于Ⅳ分支，基因差異小且親緣關(guān)系近。5'UTR、P1、P2、P3 區(qū)系統(tǒng)進(jìn)化樹顯示，17 株云南CVA6 在5'UTR、P1、P2 及P3 區(qū)均與法國(guó)CVA6 流行株處于同一集簇，在P1、P2 區(qū)，HA321單獨(dú)與法國(guó)CVA6 流行株形成1 個(gè)分支，在P3 區(qū)則單獨(dú)形成1 個(gè)分支，表明HA321 在P1、P2、P3 區(qū)均發(fā)生了一定程度的變異，其中P3 區(qū)變異程度最高。HAO 等［20］、GAUNT 等［21］及FENG 等［22］的研究結(jié)果顯示，CVA6易在非結(jié)構(gòu)蛋白區(qū)發(fā)生重組，而且EV71的3D 蛋白與病毒復(fù)制過程有關(guān)。本研究重組分析后未發(fā)現(xiàn)HA、HFMD 代表株與腸道病毒A 組流行株發(fā)生重組，但在非結(jié)構(gòu)蛋白3D 區(qū)發(fā)生了變異，提示可能對(duì)CVA6復(fù)制產(chǎn)生影響。

CVA6 基因組中的P1 區(qū)主要編碼病毒結(jié)構(gòu)蛋白，即衣殼蛋白，衣殼蛋白包括VP1、VP2、VP3、VP4，其中VP1 攜帶重要的抗原位點(diǎn)，是刺激機(jī)體產(chǎn)生抗體的主要蛋白［15-16，23］。有研究表明［24-25］，VP1 區(qū)的氨基酸突變與EV71 的適應(yīng)性有關(guān)。本研究分析了P1區(qū)氨基酸突變情況，結(jié)果顯示，與原型株Gudala 相比，引起HA 的CVA6 氨基酸突變數(shù)比引起HFMD 的CVA6氨基酸突變數(shù)多7個(gè)，共有37個(gè)氨基酸突變位點(diǎn)是相同的；引起HA 與HFMD 的CVA6 中均發(fā)生突變且突變位點(diǎn)均不一致的共有3 個(gè)（S597T、Q705L、Q663L），均分布在VP1 區(qū)，可能對(duì)CVA6 的適應(yīng)性產(chǎn)生影響。

綜上所述，本研究在分子水平分析了2018 年17株云南省CVA6 的全基因組特征，發(fā)現(xiàn)2018 年云南省引起HFMD 與HA 的CVA6 之間基因組同源性較高，同時(shí)也存在核苷酸及氨基酸差異，這些變化可能對(duì)CVA6 的復(fù)制及適應(yīng)性產(chǎn)生影響。但能否引起HFMD 與HA 臨床癥狀的差異，還需在蛋白水平及體內(nèi)試驗(yàn)方面進(jìn)行深入研究。本研究為對(duì)CVA6 毒力位點(diǎn)的進(jìn)一步研究提供了參考。