吳爽，王寅 綜述，孫濤 審校

國(guó)家藥品監(jiān)督管理局藥品審評(píng)中心，北京100022

COVID-19 暴發(fā)以來(lái)，全球積極開展疫苗研發(fā)。動(dòng)物攻毒試驗(yàn)作為評(píng)價(jià)疫苗保護(hù)效力的有力依據(jù)，選取敏感、穩(wěn)定的動(dòng)物模型開展攻毒試驗(yàn)對(duì)評(píng)價(jià)疫苗非臨床有效性具有重要作用。目前常用的動(dòng)物模型有人血管緊張素酶2（human angiotensin converting enzyme 2，h-ACE2）轉(zhuǎn)基因小鼠、恒河猴，部分疫苗也在雪貂或倉(cāng)鼠中開展攻毒試驗(yàn)。本文對(duì)常用動(dòng)物模型的特點(diǎn)及其在攻毒試驗(yàn)中存在的問題進(jìn)行分析、總結(jié)，為嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒2（severe acute respiratory symptom coronavirus 2，SARS-CoV-2）疫苗的研發(fā)提供參考。

1 動(dòng)物模型

1.1h-ACE2 轉(zhuǎn)基因小鼠 引起COVID-19 的病原體為SARS-CoV-2，ACE2 是SARS-CoV-2 的受體，SARSCoV-2 刺突蛋白（spike protein，S）可與ACE2 結(jié)合進(jìn)入細(xì)胞［1-3］。h-ACE2轉(zhuǎn)基因小鼠將人ACE2基因置于選擇的啟動(dòng)子控制下，誘導(dǎo)小鼠在特定組織或細(xì)胞中表達(dá)。早在2003 年SARS 期間，即發(fā)現(xiàn)人與小鼠ACE2 蛋白之間存在結(jié)構(gòu)差異，導(dǎo)致小鼠感染SARS病毒概率降低，因此，國(guó)內(nèi)外建立了多種h-ACE2 轉(zhuǎn)基因小鼠模型用于藥物或疫苗研發(fā)，不同轉(zhuǎn)基因小鼠可能存在整合位點(diǎn)、背景品系差異［4-7］。

HFH4-h-ACE2 轉(zhuǎn)基因小鼠選擇了C3B6 品系小鼠，在肺纖毛上皮細(xì)胞啟動(dòng)子HFH4 啟動(dòng)人源ACE2在小鼠肺部表達(dá)，HFH4-h-ACE2 轉(zhuǎn)基因小鼠在肺中表達(dá)高水平的h-ACE2，但在其他組織，包括大腦、肝臟、腎臟和胃腸道中也可見表達(dá)。K18-h-ACE2 轉(zhuǎn)基因小鼠是在細(xì)胞角蛋白18（cytokeratin 18，CK18）編碼基因的啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)下表達(dá)h-ACE2 的轉(zhuǎn)基因小鼠模型，將目的基因顯微注射導(dǎo)入至受精過(guò)的（C57BL／6J x SJL／J）F2 卵母細(xì)胞中，獲得轉(zhuǎn)基因胚胎。上述轉(zhuǎn)基因小鼠感染SARS-CoV-2 后出現(xiàn)病毒性肺炎，部分小鼠可表現(xiàn)為腦部感染，有一部分小鼠會(huì)因出現(xiàn)腦部感染而死亡。此外，K18-h-ACE2 小鼠感染早期可能出現(xiàn)嗅覺喪失，采用臨床患者恢復(fù)期血漿可預(yù)防感染小鼠多數(shù)臨床癥狀，但不能預(yù)防嗅覺喪失［8-10］。CMV-h-ACE2轉(zhuǎn)基因小鼠是由巨細(xì)胞病毒（the cytomegalovirus，CMV）早期增強(qiáng)子（early enhancer element）和雞β-肌動(dòng)蛋白（chicken beta-actin）啟動(dòng)子組合成復(fù)合啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)表達(dá)h-ACE2，以（C57BL／6J x XC3H／HeJ）為F1親本，在C57BL／6或BALB／c背景小鼠上傳代2~3次獲得的轉(zhuǎn)基因小鼠［11］。

國(guó)內(nèi)常用轉(zhuǎn)基因小鼠以C57BL／6為背景小鼠，將鼠ACE2全長(zhǎng)序列或胞外區(qū)原位替換為相應(yīng)的人源序列。h-ACE2-KI／NIFDC人源化小鼠模型于2018 年由中國(guó)食品藥品檢定研究院研發(fā)成功，采用CRISPR／Cas9技術(shù)構(gòu)建，將h-ACE2基因插入小鼠mACE2基因啟動(dòng)子之下，并共表達(dá)特定熒光標(biāo)記基因，外源基因單拷貝插入小鼠X染色體GRC.m38.p6位點(diǎn)。該模型對(duì)SARS-CoV-2易感，小鼠鼻內(nèi)感染SARS-CoV-2后，肺、氣管和腦中維持高病毒載量，表現(xiàn)為間質(zhì)性肺炎和細(xì)胞因子升高［12］。既往使用h-ACE2-KI／NIFDC人源化小鼠開展攻毒試驗(yàn)的結(jié)果顯示，小鼠肺部病毒載量為3~7 log，肺部病理表現(xiàn)為輕至重度間質(zhì)性肺炎，死亡率低。江蘇集萃藥康生物科技有限公司構(gòu)建的B6／JGpt-Ace2em1Cin（h-ACE2）［h-ACE2（全人源化）］也以C57BL／6為背景小鼠，表達(dá)全人源化ACE2。根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，該模型小鼠經(jīng)SARS-COV-2 攻擊后，肺部病毒載量可達(dá)5 log，肺部組織病理表現(xiàn)為中度的肺泡間隔增厚和炎細(xì)胞浸潤(rùn)［13］。H11-K18-h-ACE2小鼠是通過(guò)人類CK18啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)，在安全島H11位點(diǎn)過(guò)表達(dá)h-ACE2，用于模擬人類重度COVID-19表型。根據(jù)現(xiàn)有對(duì)申報(bào)資料的審評(píng)及溝通交流，采用H11-K18-h-ACE2 轉(zhuǎn)基因小鼠開展攻毒試驗(yàn)可見動(dòng)物死亡增加，原始株、Beta、Delta 及Omi-cron 變異株攻毒后小鼠表現(xiàn)相似，一般在攻毒后3~7 d動(dòng)物死亡，肺部病毒載量在9 log以上，腦組織中病毒載量較高，肺部病理表現(xiàn)為中重度間質(zhì)性肺炎。

1.2腺病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)小鼠 除穩(wěn)定表達(dá)人ACE2 的小鼠模型外，還有使用腺病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)的人ACE2 小鼠模型。有研究者利用腺病毒載體制備了Ad5-h-ACE2 SARSCOV-2 小鼠模型，通過(guò)復(fù)制缺陷型腺病毒（Ad5-h-ACE2）將外源h-ACE2 通過(guò)鼻內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)的方式遞送入C57BL／6或BALB／c兩種品系的小鼠中，對(duì)小鼠進(jìn)行攻毒試驗(yàn)，通過(guò)免疫印跡和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)h-ACE2的表達(dá)。但由于現(xiàn)有文獻(xiàn)對(duì)Ad5-h-ACE2 轉(zhuǎn)導(dǎo)小鼠模型中h-ACE2在小鼠體內(nèi)可靠性、穩(wěn)定性尚未充分驗(yàn)證，保護(hù)力評(píng)價(jià)指標(biāo)設(shè)計(jì)尚不完善，且研究顯示，Ad5-h-ACE2 轉(zhuǎn)基因小鼠不會(huì)發(fā)展成嚴(yán)重的疾病，也不會(huì)出現(xiàn)肺外疾病表現(xiàn)［14-15］。對(duì)于急性呼吸窘迫綜合征的研究需建立輕度和重度COVID-19 的感染模型，可能需要“敲入”基因表達(dá)h-ACE2 的小鼠模型，以及通過(guò)連續(xù)小鼠肺部細(xì)胞傳代的病毒適應(yīng)小鼠模型。因此，現(xiàn)有階段仍不建議采用Ad5-h-ACE2 轉(zhuǎn)基因小鼠開展動(dòng)物攻毒試驗(yàn)以評(píng)價(jià)疫苗的有效性。另有報(bào)道采用AAV6 腺病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)的h-ACE2 小鼠模型，與Ad5-h-ACE2 轉(zhuǎn)基因小鼠相似，不會(huì)出現(xiàn)呼吸道外疾病表現(xiàn)［16］。

1.3倉(cāng)鼠 h-ACE2 受體在與病毒結(jié)合的關(guān)鍵區(qū)域的29個(gè)氨基酸中有3~4個(gè)與倉(cāng)鼠ACE2不同。敘利亞倉(cāng)鼠感染SARS-CoV-2 后體重減輕，接種SARSCoV-2后第2和5天，鼻黏膜、支氣管上皮細(xì)胞和肺中均檢出病毒抗原，感染后7 d 肺部病毒基本清除，此外，十二指腸上皮細(xì)胞中也可見病毒抗原，并在糞便中檢測(cè)到病毒RNA。倉(cāng)鼠在感染后14 d 可恢復(fù)體重，并產(chǎn)生中和抗體。SARS-CoV-2 通過(guò)直接接觸和氣溶膠從接種的倉(cāng)鼠傳播給未接種的倉(cāng)鼠，通過(guò)籠子中的污染物傳播的效率不高［17-18］。現(xiàn)階段采用倉(cāng)鼠開展攻毒試驗(yàn)的研究較少，獲得的數(shù)據(jù)有限，倉(cāng)鼠感染SARS-CoV-2 后表現(xiàn)較輕微，對(duì)于能否達(dá)到中重度間質(zhì)性肺炎損傷仍需探索。

1.4雪貂 雪貂的上下呼吸道解剖比例、支氣管壁黏膜下腺體的密度等均與人呼吸道狀況接近。在病毒感染模型中，如流感病毒、呼吸道合胞病毒等多種呼吸道病毒感染雪貂后，均能有效進(jìn)行復(fù)制并引起與人相似的癥狀，流感病毒感染的雪貂甚至?xí)袢艘粯哟驀娞纾液芤讉魅窘o其他雪貂。因此，有研究者開展雪貂攻毒模型研究，結(jié)果顯示，SARS-CoV-2可感染雪貂，并能在上呼吸道復(fù)制長(zhǎng)達(dá)8 d，但在肺中未檢測(cè)到病毒復(fù)制。感染后的雪貂體溫輕微升高，不會(huì)造成嚴(yán)重疾病或死亡［19-20］?；诂F(xiàn)階段采用雪貂開展攻毒試驗(yàn)的疫苗產(chǎn)品較少，研究樣本量較少，且雪貂在肺內(nèi)很難形成間質(zhì)性肺炎模型，建議如開展雪貂攻毒試驗(yàn)，應(yīng)充分驗(yàn)證病毒在雪貂體內(nèi)的復(fù)制情況，以期獲得可評(píng)價(jià)的數(shù)據(jù)。

1.5非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物 非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物與人類的免疫學(xué)和生理學(xué)具有相似性，使非人類靈長(zhǎng)類動(dòng)物模型在研究病毒發(fā)病機(jī)理、傳播途徑、疫苗保護(hù)力等方面具有重要價(jià)值，對(duì)研究人類病毒感染性疾病的治療和預(yù)防發(fā)揮著重要作用［21］。對(duì)比恒河猴、食蟹猴、狨猴感染SARS-CoV-2 原始株后的表現(xiàn)，模型易感性由高到低分別為恒河猴、食蟹猴、狨猴［22］。目前，恒河猴作為常用的非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物模型，研究顯示，恒河猴在感染SARS-CoV-2 后病情輕微，可見體質(zhì)量稍有減輕，無(wú)發(fā)熱現(xiàn)象，肺部X 射線檢查顯示出與人類似的肺炎癥狀［23-24］。恒河猴可見呼吸道感染和結(jié)膜感染，結(jié)膜感染的猴在鼻咽系統(tǒng)中病毒載量和分布相對(duì)較高；與通過(guò)氣道接種病毒的猴相比，肺部感染相對(duì)較輕微，兩條途徑均可能導(dǎo)致消化道的感染［25］。

1.6其他感染模型 有團(tuán)隊(duì)研究了SARS-CoV-2 小鼠適應(yīng)株，利用SARS-CoV-2 在小鼠體內(nèi)強(qiáng)制連續(xù)傳代適應(yīng)的方法，以期能夠獲得有效感染標(biāo)準(zhǔn)小鼠的SARS-CoV-2適應(yīng)株，并在標(biāo)準(zhǔn)小鼠上建立感染模型。正常BALB／c小鼠鼻內(nèi)攻毒小鼠適應(yīng)株后，可見明顯呼吸道癥狀，此外表現(xiàn)出皮毛皺褶、駝背、活動(dòng)減少等癥狀，肺部病理檢查可見嚴(yán)重肺損傷，誘發(fā)壞死性肺炎和廣泛彌漫性肺泡損傷［26-27］。但SARS-CoV-2快速鼠適應(yīng)機(jī)制仍未明確，不同鼠適應(yīng)株之間關(guān)鍵鼠適應(yīng)性突變位點(diǎn)也存在差異，有的受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域（receptor binding domain，RBD）上氨基酸位點(diǎn)突變并不能完全決定適應(yīng)株的致病作用［28-30］?；谀壳靶∈筮m應(yīng)株與臨床SARS-CoV-2 流行株間的差異尚不明確，采用該模型評(píng)價(jià)SARS-CoV-2 疫苗的有效性尚未形成共識(shí)，僅能作為參考。

2 常見問題及考慮

2.1試驗(yàn)設(shè)計(jì) 動(dòng)物模型攻毒試驗(yàn)設(shè)計(jì)常見問題主要涉及免疫程序、免疫間隔及免疫途徑。攻毒試驗(yàn)中免疫程序、免疫間隔及免疫途徑應(yīng)與臨床試驗(yàn)擬用方式一致，攻毒試驗(yàn)免疫劑次不應(yīng)多于臨床免疫劑次。如攻毒試驗(yàn)增加免疫劑次或改變免疫間隔獲得有效性信息，不能說(shuō)明臨床免疫劑次的有效性。不同免疫途徑可能導(dǎo)致免疫原性應(yīng)答不同，一般認(rèn)為腹腔注射免疫原性高于肌肉注射，因此選擇一致的免疫途徑對(duì)提示臨床免疫應(yīng)答具有重要作用。

2.2動(dòng)物數(shù)量 部分攻毒試驗(yàn)采用多點(diǎn)剖殺設(shè)計(jì)，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)選取3~4 只動(dòng)物，以期測(cè)定肺部病毒載量及肺部病理的持續(xù)變化。但對(duì)于輕癥感染轉(zhuǎn)基因小鼠模型，隨著時(shí)間延長(zhǎng)，肺部病理變化逐漸恢復(fù)，3~4只動(dòng)物無(wú)法達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)要求。對(duì)于重癥小鼠攻毒后易出現(xiàn)死亡，模型組小鼠過(guò)早死亡，而疫苗組小鼠仍按計(jì)劃分時(shí)間點(diǎn)剖殺采樣，疫苗組小鼠肺部病毒載量的降低及肺部病理恢復(fù)不能明確是疫苗的保護(hù)效力還是由于隨著感染時(shí)間延長(zhǎng)而自愈。恒河猴攻毒試驗(yàn)也常見動(dòng)物數(shù)較少，且每組動(dòng)物分時(shí)段解剖，導(dǎo)致同一時(shí)間點(diǎn)可評(píng)價(jià)動(dòng)物數(shù)少于4 只，低于最低統(tǒng)計(jì)學(xué)要求，而猴鼻咽拭子病毒載量個(gè)體差異較大，且檢測(cè)方法無(wú)法區(qū)分活病毒，因此對(duì)評(píng)價(jià)疫苗有效性的作用有限。

2.3病理?yè)p傷程度 h-ACE2-KI／NIFDC 人源化小鼠模型為非致死性模型，因此在選用該模型開展攻毒試驗(yàn)時(shí)，受攻毒劑量、攻毒時(shí)間、攻毒方式或檢測(cè)時(shí)間選擇等原因的影響，一些試驗(yàn)中小鼠在攻毒后觀察到較輕度的組織病理學(xué)改變，未造成中、重度間質(zhì)性肺炎，且隨著時(shí)間延長(zhǎng)，肺部病理變化呈恢復(fù)趨勢(shì)，部分輕度肺損傷模型接種疫苗后與對(duì)照組相比，未見組織病理變化的明顯改善，無(wú)法充分提示疫苗的保護(hù)效力。動(dòng)物模型建立成功的標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)達(dá)到中度或中度以上間質(zhì)性肺炎和一定程度的肺部病理?yè)p傷。

2.4動(dòng)物死亡 H11-K18-h-ACE2轉(zhuǎn)基因小鼠攻毒后往往形成重度感染模型。小鼠感染SARS-CoV-2后死亡率高，較早者在感染后3 d死亡。在部分研究中，對(duì)模型組死亡動(dòng)物肺部病毒載量及組織病理學(xué)檢查結(jié)果的獲得不及時(shí)、不充分，而疫苗組小鼠在相同時(shí)間點(diǎn)又未獲取肺部病毒載量或組織病理數(shù)據(jù)，無(wú)法提供小鼠肺部病毒載量和肺部組織病理的可評(píng)價(jià)數(shù)據(jù)。

2.5其他考慮 攻毒劑量選擇需考慮不同動(dòng)物模型、擬攻毒病毒株（如原始株、Omicron 變異株等）致病能力等因素，如現(xiàn)階段Omicron變異株攻毒劑量高于原始株或Delta 變異株。應(yīng)探討動(dòng)物模型合理的攻毒時(shí)間、攻毒途徑、攻毒劑量及攻毒后觀察時(shí)間，預(yù)期攻毒劑量應(yīng)使模型動(dòng)物達(dá)到中、重度肺部炎癥。不建議攻毒后多點(diǎn)剖殺動(dòng)物，尤其重癥感染h-ACE2小鼠建議選擇攻毒后3~5 d 剖殺，或根據(jù)模型組小鼠存活情況，選擇合適的時(shí)間點(diǎn)剖殺，盡可能獲取死亡動(dòng)物肺部病毒載量及組織病理結(jié)果。針對(duì)死亡率較高的動(dòng)物模型，可適當(dāng)增加試驗(yàn)動(dòng)物數(shù)量，保證結(jié)果的可評(píng)價(jià)性。

部分疫苗以保護(hù)小鼠死亡作為評(píng)價(jià)疫苗有效性的指標(biāo)，但根據(jù)目前已發(fā)布指導(dǎo)原則《新型冠狀病毒預(yù)防用疫苗非臨床有效性研究及評(píng)價(jià)技術(shù)要點(diǎn)》（試行）的要求，肺組織病毒載量和肺組織病理是評(píng)價(jià)疫苗有效性的關(guān)鍵證據(jù)。雖然Omicron 株致病力較低，但仍適用以上評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)。

3 小結(jié)

動(dòng)物模型攻毒試驗(yàn)作為評(píng)價(jià)SARS-CoV-2 疫苗有效性的主要依據(jù)，選擇合適的動(dòng)物模型并合理設(shè)計(jì)試驗(yàn)對(duì)獲取有效性、安全性信息及支持臨床試驗(yàn)可發(fā)揮重要作用。應(yīng)依據(jù)不同動(dòng)物模型的特點(diǎn)，設(shè)計(jì)合適的動(dòng)物數(shù)量、攻毒劑量、免疫程序、檢測(cè)時(shí)間，盡可能獲得可評(píng)價(jià)的數(shù)據(jù)，以提示疫苗的有效性并獲得抗體依賴性增強(qiáng)（antibody-dependent enhancement，ADE）、疫苗相關(guān)疾病增強(qiáng)（vaccine-associated disease enhancement，VED）相關(guān)指標(biāo)。