葉鋒，杜秋麗，劉麗婭，馬曉菁，謝彩云，谷文喜，馬俊杰，易新萍

1.新疆畜牧科學(xué)院獸醫(yī)研究所新疆畜牧科學(xué)院動(dòng)物臨床醫(yī)學(xué)研究中心，新疆烏魯木齊830011；2.濟(jì)寧學(xué)院生命科學(xué)與生物工程學(xué)院，山東曲阜273155

萊姆病是一種由伯氏疏螺旋體（Borrelia burgdorferi）感染引起的人獸共患傳染病，主要經(jīng)蜱蟲(chóng)叮咬進(jìn)行傳播，可造成人皮膚、神經(jīng)、關(guān)節(jié)等多器官損傷。萊姆病在歐洲、亞洲及北美洲的溫帶地區(qū)均有流行，其宿主涉及多種野生及家養(yǎng)動(dòng)物［1］。艾承緒等［2］于1986 年在中國(guó)黑龍江省海林縣林區(qū)發(fā)現(xiàn)并分離出3 株伯氏疏螺旋體。隨后研究表明，我國(guó)30個(gè)省區(qū)均有萊姆病病例，多出現(xiàn)于山林地區(qū)［3］。

5S-23S rRNA 基因間隔區(qū)是伯氏疏螺旋體的保守片段，廣泛應(yīng)用于伯氏疏螺旋體的鑒定及分型研究［4］。目前，全球已發(fā)現(xiàn)的伯氏疏螺旋體基因型已超過(guò)10 個(gè)［5-6］，我國(guó)主要以B.garinii型為主［7］。新疆維吾爾自治區(qū)（簡(jiǎn)稱新疆）是萊姆病自然疫源地，研究顯示，在新疆南北疆地區(qū)的多數(shù)人群中檢測(cè)出萊姆病抗體［8-9］，在鼠和犬血液樣本中也檢測(cè)出伯氏疏螺旋體DNA 及抗體［10-11］，但目前關(guān)于其他飼養(yǎng)動(dòng)物的萊姆病感染情況的研究較少。因此，本研究對(duì)新疆4 個(gè)地區(qū)5 種蜱蟲(chóng)宿主動(dòng)物的萊姆病流行情況進(jìn)行血清學(xué)調(diào)查，以期為新疆地區(qū)萊姆病的防控提供參考。

1 材料與方法

1.1血清 由新疆烏魯木齊、伊犁、昌吉及喀什4個(gè)地區(qū)33 個(gè)采樣點(diǎn)采集相應(yīng)地區(qū)的牛、綿羊、山羊、馬和犬血清樣本共814 份，其中牛、綿羊、山羊、馬血清各182份，犬血清86份，見(jiàn)表1。

表1 動(dòng)物血清樣本數(shù)量統(tǒng)計(jì)表Tab.1 Counts of animal serum samples

1.2菌株及蟲(chóng)株 伯氏疏螺旋體（ATCC35210）標(biāo)準(zhǔn)株B31 和鉤端螺旋體標(biāo)準(zhǔn)株（DSM21537）由新疆畜牧科學(xué)院動(dòng)物臨床醫(yī)學(xué)研究中心保存；于新疆烏魯木齊、伊犁、昌吉及喀什4個(gè)地區(qū)共收集蜱蟲(chóng)135只。

1.3主要試劑 血清萊姆病IgG抗體檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)Trust Specialty Zeal公司；DL2000 DNA marker購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒和微量DNA 提取試劑盒均購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司。

1.4血清樣本中萊姆病IgG 抗體水平的檢測(cè) 取5種動(dòng)物血清樣本，按照萊姆病抗體IgG血清檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行檢測(cè)。

1.5蜱蟲(chóng)體內(nèi)伯氏疏螺旋體5S-23S rRNA基因間隔區(qū)序列的擴(kuò)增 采用微量DNA 提取試劑盒和細(xì)菌基因組DNA 提取試劑盒提取蜱蟲(chóng)、伯氏疏螺旋體標(biāo)準(zhǔn)株B31（陽(yáng)性對(duì)照）和鉤端螺旋體標(biāo)準(zhǔn)株（陰性對(duì)照）DNA，以其為模板，按文獻(xiàn)［12］的巢式PCR 法擴(kuò)增伯氏疏螺旋體5S-23S rRNA 基因間隔區(qū)序列。獲得的PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳分析，取陽(yáng)性蜱蟲(chóng)DNA樣本送生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序。

1.6系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)的構(gòu)建 將1.5項(xiàng)伯氏疏螺旋體陽(yáng)性樣本的PCR 產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果與GenBank 中已登錄的伯氏疏螺旋體5S-23S rRNA基因間隔區(qū)序列（登錄號(hào)為：JX888456.1、MK333420.1、AY032903.1、GU723-464.1、DQ102456.1、AY032913.1、AB178337.1、Z7-7173.1、AY032917.1）進(jìn)行BLAST 比對(duì)，計(jì)算核苷酸序列同源性。應(yīng)用MEGA X 軟件，將陽(yáng)性樣本測(cè)序結(jié)果與上述GenBank 中已公開(kāi)發(fā)表的9 條序列采用NJ 算法（bootstrap為1 000）構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 25.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，萊姆病IgG 抗體陽(yáng)性率的比較采用χ2檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1血清樣本中萊姆病IgG抗體水平

2.1.14 個(gè)地區(qū)間的比較 4 個(gè)地區(qū)中，烏魯木齊地區(qū)的萊姆病IgG抗體陽(yáng)性率最高，達(dá)23.6%（66／280），95%置信區(qū)間為16.5% ~ 30.7%；其次為伊犁和喀什地區(qū)，抗體陽(yáng)性率分別為2.7%（10／370）和2.4%（2／84），95%置信區(qū)間分別為0.3% ~ 5.1%和0 ~7.2%；昌吉地區(qū)的萊姆病IgG 抗體陽(yáng)性率為0。4個(gè)地區(qū)間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=48.481，P<0.001）。

2.1.25 種動(dòng)物間的比較 在5 種動(dòng)物中，犬血清的萊姆病IgG抗體陽(yáng)性率最高，達(dá)60.5%（52／86），95%置信區(qū)間為45.2%~75.7%；其次依次為山羊血清、綿羊血清和牛血清，抗體陽(yáng)性率分別為18.7%（34／182）、4.4%（8／182）和1.1%（2／182），95%置信區(qū)間分別為10.5%~26.8%、0.1%~8.7%和0~3.3%；馬血清中未檢測(cè)出萊姆病IgG 抗體。5 種宿主動(dòng)物間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=129.03，P<0.001）。

2.2蜱蟲(chóng)體內(nèi)5S-23S rRNA 基因間隔區(qū)序列的擴(kuò)增135 份蜱蟲(chóng)DNA 樣本的巢式PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳分析，其中24份DNA樣本于230 bp處可見(jiàn)5S-23S rRNA 基因間隔區(qū)序列條帶，大小與預(yù)期相符，編號(hào)為2019-1、2019-2、2019-4、2019-5、2019-6、2019-7、2019-9、2019-10、2019-11、2019-12、2019-13、2019-14、2020-2、2020-3、2020-4、2020-5、2020-7、2020-8、2020-9、2020-10、2020-11、2020-12、2020-14、2020-15，部分結(jié)果見(jiàn)圖1。新疆地區(qū)蜱蟲(chóng)的伯氏疏螺旋體帶菌率為17.78%。

圖1 蜱蟲(chóng)DNA樣本的巢式PCR鑒定Fig.1 Identification of tick DNA samples by nested PCR

2.3系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析 24份陽(yáng)性蜱蟲(chóng)DNA樣本中，11份（2019-2、2019-4、2019-6、2019-7、2019-10、2019-12、2019-14、2020-3、2020-9、2020-10、2020-12）與B.garinii分離株序列同源性大于99%，占比75%；9份（2019-1、2019-5、2019-11、2019-13、2020-4、2020-7、2020-8、2020-14、2020-15）與B.burgdorferi分離株序列同源性大于99%，占比8.33%；4份（2019-9、2020-2、2020-5、2020-11）與B.afzelii型分離株序列同源性大于99%，占比16.67%。24 份陽(yáng)性蜱蟲(chóng)DNA 樣本的擴(kuò)增序列分為2 大分支，其中3 份與B.garinii基因型菌株YN28 和NMK6 為同一支，19 份樣本與B.garinii基因型菌株MGDS為同一支，且這19份樣本又可分為3個(gè)進(jìn)化較為接近的分支；2 份樣本與B.burgdorferi基因型菌株N40、WX337及B31為同一支。見(jiàn)圖2。

圖2 5S-23S rRNA基因間隔區(qū)序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析Fig.2 Phylogenetic tree based on 5S-23S rRNA gene spacer sequence

3 討論

目前，我國(guó)臨床中常采用間接免疫熒光試驗(yàn)（indirect immunofluorescence assay，IFA）和ELISA法進(jìn)行萊姆病初步篩查，再通過(guò)Western blot 進(jìn)行確診［13-15］。本實(shí)驗(yàn)采用ELISA 法對(duì)在新疆4 個(gè)地區(qū)33 個(gè)采樣點(diǎn)采集的814份血清樣本進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果表明，其中3個(gè)地區(qū)均存在萊姆病感染的情況，這與武軍元等［9］的流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果一致。5 種動(dòng)物中，4 種動(dòng)物血清含有萊姆病抗體，其中犬血清的抗體陽(yáng)性率最高，達(dá)60.5%，其原因可能是流浪犬在日常環(huán)境中接觸蜱蟲(chóng)的機(jī)會(huì)較大，本研究中犬血清均采集自烏魯木齊地區(qū)，因此導(dǎo)致該地區(qū)的萊姆病IgG抗體整體陽(yáng)性率較高（達(dá)23.6%）。本實(shí)驗(yàn)中182 份山羊血清均采集自烏魯木齊和伊犁地區(qū)，其抗體陽(yáng)性率達(dá)18.7%，這可能與山羊喜愛(ài)在山林間活動(dòng)的生活習(xí)性及山羊毛較長(zhǎng)易于蜱蟲(chóng)附著叮咬有關(guān)。采集的182 份馬血清來(lái)自于伊犁地區(qū)2 個(gè)不同的馬場(chǎng)，并未發(fā)現(xiàn)萊姆病感染，可能是與馬匹在集中飼養(yǎng)環(huán)境中不易接觸到蜱蟲(chóng)有關(guān)。另外，本實(shí)驗(yàn)中檢測(cè)的動(dòng)物萊姆病IgG抗體陽(yáng)性，并不代表該動(dòng)物體內(nèi)一定存在伯氏疏螺旋體病原，僅表明該動(dòng)物曾經(jīng)感染或正在感染萊姆病。

本研究對(duì)135 份蜱蟲(chóng)DNA 樣本進(jìn)行了5S-23S rRNA 基因間隔區(qū)序列的巢式PCR 擴(kuò)增，有24 份樣本為陽(yáng)性，新疆地區(qū)蜱蟲(chóng)的伯氏疏螺旋體帶菌率為17.78%。系統(tǒng)進(jìn)化分析比對(duì)結(jié)果顯示，蜱蟲(chóng)中的伯氏疏螺旋體優(yōu)勢(shì)基因型主要為B.garinii型，該結(jié)論也與文獻(xiàn)［16-17］的研究結(jié)果一致。與B.garinii基因型菌株MGDS 為同一支的19 份蜱蟲(chóng)DNA 陽(yáng)性樣本中，4 份樣本（2019-9、2020-2、2020-5、2020-11）序列與B.afzelii型同源性較高，7份樣本（2019-11、2019-13、2020-4、2020-7、2020-8、2020-14、2020-15）與B.burgdorferi型同源性較高，且與另外8份B.garinii樣本具有較近的進(jìn)化關(guān)系，表明這19 份樣本可能由同一祖先分化而來(lái)［18］。上述結(jié)果表明，新疆地區(qū)主要流行的伯氏疏螺旋體為B.afzelii、B.garinii和B.burgdorferi型，以上基因型主要引起神經(jīng)損傷和慢性皮膚病變，提示當(dāng)?shù)赜邢鄳?yīng)癥狀的人員應(yīng)將萊姆病列入排查范圍。

本研究結(jié)果僅限于樣本的采集地，數(shù)據(jù)不能精準(zhǔn)反映各地區(qū)動(dòng)物間的萊姆病流行情況，僅在一定程度上表明了新疆地區(qū)動(dòng)物萊姆病的整體流行情況，并判定流行毒株。本研究結(jié)果也提示，在上述地區(qū)工作的林區(qū)工人、農(nóng)民及放牧人員應(yīng)提高個(gè)人防護(hù)意識(shí)，做好動(dòng)物體外驅(qū)蟲(chóng)工作，減少皮膚暴露，預(yù)防經(jīng)蜱蟲(chóng)叮咬感染萊姆病。