張陽 ，李軍祥 ，胡俊聰 ，張黎明 ，王佳麗 ，韓嘯 ，姜慧 ，章曉思 ，王木源 ，石磊

1.北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 100029； 2.北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院，北京 100078

潰瘍性結(jié)腸炎（ulcerative colitis，UC）是發(fā)生在結(jié)直腸的原因不明的非特異性炎癥性疾病[1]。UC多發(fā)于中青年，腹瀉、黏液膿血便及腹痛等癥狀嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量。UC難治愈、易復(fù)發(fā)，緩解癥狀和減少?gòu)?fù)發(fā)是目前治療關(guān)鍵[2]。

UC發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，目前主要認(rèn)為是在遺傳、環(huán)境或腸道微生物等因素作用下，腸屏障遭到破壞，從而發(fā)生過激的免疫炎癥反應(yīng)[3]，腸屏障損傷是此過程的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[4]。黏液屏障結(jié)構(gòu)性減弱是UC發(fā)病的更早期事件，修復(fù)黏液屏障可能是治療UC的新方向[5]。結(jié)腸組織杯狀細(xì)胞分泌的黏蛋白2（MUC2）是黏液屏障的功能基礎(chǔ)[6]，白細(xì)胞介素（IL）-18高表達(dá)會(huì)加劇黏液屏障損傷[7]，表達(dá)于腸上皮的核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白（NLRP）6能夠通過調(diào)節(jié)IL-18產(chǎn)生維持腸道內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)[8-9]。因此，NLRP6/IL-18/MUC2軸可能是影響UC腸道黏液屏障的關(guān)鍵。

中醫(yī)藥在緩解UC癥狀、促進(jìn)黏膜愈合等方面具有較明顯的優(yōu)勢(shì)[10]。課題組李軍祥教授總結(jié)多年臨床經(jīng)驗(yàn)創(chuàng)立清腸溫中方。前期臨床研究發(fā)現(xiàn)，該方能有效改善UC患者癥狀，降低改良梅奧（Mayo）評(píng)分[11]，還能增加UC患者結(jié)腸杯狀細(xì)胞數(shù)量及MUC2表達(dá)，修復(fù)腸屏障損傷[12]。本研究觀察清腸溫中方對(duì)UC小鼠NLRP6/IL-18/MUC2軸及腸道黏液屏障的影響，深入探索其治療UC的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物

SPF級(jí)雄性C57BL/6小鼠24只，體質(zhì)量（20±2）g，斯貝福（北京）生物技術(shù)有限公司提供，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK（京）2019-0010。飼養(yǎng)于北京中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物房，溫度23～27 ℃，濕度40%～60%，12 h/12 h光暗循環(huán)，自由攝食飲水。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)審批（BUCM-2021-01124）。

1.2 藥物及制備

清腸溫中方由黃連6 g、炮姜10 g、青黛3 g、苦參9 g、三七6 g、木香6 g、地榆炭15 g、炙甘草6 g組成，飲片顆粒購(gòu)于北京康仁堂藥業(yè)有限公司，由北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院配方顆粒藥房制成配方顆粒，2袋配方顆粒相當(dāng)于1劑原方。美沙拉嗪片，德國(guó)?？酥扑幱邢薰?，0.5 g/片，批號(hào)17K09615L。將2袋配方顆粒溶于66 mL去離子水，0.5 g美沙拉嗪溶于13 mL去離子水，超聲震蕩1 h，過濾，取上清液，即得相應(yīng)灌胃溶液，置于4 ℃冰箱保存。

1.3 試劑與儀器

葡聚糖硫酸鈉（DSS），美國(guó)MP Biomedical，貨號(hào)0216011080；便潛血試紙，珠海貝索生物有限公司，貨號(hào)v277201；HE染液，北京高嘉生物技術(shù)有限公司，貨號(hào)RY0456；AB-PAS染色試劑盒，武漢塞維爾，貨號(hào)G1049；NLRP6抗體，美國(guó)Affinity Biosciences公司，貨號(hào)DF15449；IL-18抗體，美國(guó)Affinity Biosciences公司，貨號(hào)DF6252；MUC2抗體，英國(guó)Abcam，貨號(hào)ab272692。LS-100病理石蠟包埋機(jī)（沈陽龍首電子儀器有限公司），F(xiàn)inesse 325石蠟切片機(jī)（北京弘泰嘉業(yè)科技發(fā)展有限公司），BX60顯微鏡（奧林巴斯株式會(huì)社），Power Pac Basic型垂直電泳儀、Trans-blot Turbo型轉(zhuǎn)膜儀、Chemi Doc MP型凝膠成像系統(tǒng)（美國(guó)Bio-Rad公司）。

1.4 分組、造模及給藥

小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后，采用隨機(jī)數(shù)字表法分為空白組、模型組、清腸溫中方組和美沙拉嗪組，每組6只?？瞻捉M飲用去離子水，其他組飲用3%DSS溶液制備UC模型，連續(xù)7 d。第8日開始，美沙拉嗪組和清腸溫中方組分別予相應(yīng)藥物灌胃，給藥劑量按人與小鼠體表面積換算，清腸溫中方組為原藥材9.25 g/kg[13-14]，美沙拉嗪組為0.38 g/kg，空白組和模型組灌胃去離子水，體積0.1 mL/10 g，連續(xù)7 d。

1.5 取材

給藥結(jié)束后1%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉小鼠，剖腹，剪取結(jié)腸，PBS清洗，測(cè)量結(jié)腸長(zhǎng)度。取肛門端結(jié)腸組織1 cm，放入4%多聚甲醛固定。剩余結(jié)腸組織置于凍存管，液氮速凍后轉(zhuǎn)移至-80 ℃冰箱保存。

1.6 疾病活動(dòng)指數(shù)評(píng)分

實(shí)驗(yàn)期間每日稱量小鼠體質(zhì)量，觀察大便性狀，檢測(cè)便潛血，計(jì)算疾病活動(dòng)指數(shù)（DAI）評(píng)分（見表1）。DAI評(píng)分=（體質(zhì)量下降評(píng)分+大便性狀評(píng)分+便潛血評(píng)分）÷3。

表1 DAI評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)

1.7 HE染色

將多聚甲醛固定的結(jié)腸組織取出，常規(guī)石蠟包埋，切片（厚度5 μm），切片脫蠟后，蘇木素染液染色3～5 min，水洗，分化液分化，水洗，返藍(lán)液返藍(lán)，流水沖洗。切片依次入85%、95%乙醇脫水5 min，伊紅染液染色5 min，脫水封片。顯微鏡下觀察結(jié)腸組織病理形態(tài)。

1.8 AB-PAS染色

石蠟切片脫蠟至水，入AB-PAS染液C中染色15 min，自來水洗至無色，入AB-PAS染液B中酸化15 min，自來水洗后，蒸餾水復(fù)洗2遍，入AB-PAS染液A（恢復(fù)室溫）避光染色30 min，流水沖洗5 min，脫水封片。顯微鏡下觀察結(jié)腸黏膜杯狀細(xì)胞數(shù)量和形態(tài)。

1.9 Western blot檢測(cè)

取結(jié)腸組織30 mg，加入RIPA裂解液300 μL，充分勻漿，冰上裂解30 min，4 ℃、12000 r/min離心20 min，取上清液，BCA法檢測(cè)蛋白濃度。調(diào)整蛋白濃度后，上樣，凝膠電泳分離，轉(zhuǎn)膜，脫脂牛奶封閉，分別加入NLRP6、IL-18一抗（1∶1000），4 ℃孵育過夜，加二抗室溫孵育1 h，ELC發(fā)光液顯影，凝膠成像系統(tǒng)掃描，以β-actin為內(nèi)參，采用Image J軟件計(jì)算蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.10 免疫熒光染色

石蠟切片脫蠟至水，微波爐抗原修復(fù)，3%BSA封閉30 min，滴加MUC2一抗（1∶500），4 ℃孵育過夜。加二抗，室溫避光孵育50 min。加DAPI染液，室溫避光染色10 min，加自發(fā)熒光淬滅劑B液孵育5 min，流水沖洗10 min，抗熒光淬滅封片劑封片。顯微鏡下觀察，計(jì)算陽性表達(dá)的熒光強(qiáng)度。

1.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS26.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料以±s表示，符合正態(tài)分布且方差齊組間比較采用方差分析，不符合正態(tài)分布或方差不齊用非參數(shù)檢驗(yàn)。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 清腸溫中方對(duì)模型小鼠一般狀況和疾病活動(dòng)指數(shù)評(píng)分的影響

空白組小鼠體質(zhì)量平穩(wěn)增長(zhǎng)，模型組、清腸溫中方組和美沙拉嗪組小鼠造模第3日開始體質(zhì)量有所下降；第8日停用DSS并予相應(yīng)藥物干預(yù)后，各組小鼠體質(zhì)量逐漸增加，其中清腸溫中方組和美沙拉嗪組體質(zhì)量增加較模型組更多。見圖1。造模開始后，空白組小鼠大便正常，其余各組小鼠大便性狀改變、便隱血或肉眼血便等情況逐漸加重。造模第7日開始，與空白組比較，模型組DAI評(píng)分顯著升高（P＜0.01）；經(jīng)藥物干預(yù)后，與模型組比較，清腸溫中方組和美沙拉嗪組DAI評(píng)分顯著下降（P＜0.01）。見圖2。

圖1 各組小鼠體質(zhì)量變化（±s，每組6只）

圖2 各組小鼠DAI評(píng)分變化（±s，每組6只）

2.2 清腸溫中方對(duì)模型小鼠結(jié)腸長(zhǎng)度的影響

與空白組比較，模型組小鼠結(jié)腸長(zhǎng)度顯著縮短（P＜0.01）；與模型組比較，清腸溫中方組和美沙拉嗪組小鼠結(jié)腸長(zhǎng)度顯著增加（P＜0.05，P＜0.01）。清腸溫中方組和美沙拉嗪組結(jié)腸長(zhǎng)度比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表2。

表2 各組小鼠結(jié)腸長(zhǎng)度比較（±s，cm）

表2 各組小鼠結(jié)腸長(zhǎng)度比較（±s，cm）

注：與空白組比較，##P＜0.01；與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

結(jié)腸長(zhǎng)度8.13±0.296.33±0.84##7.52±0.41**7.43±0.54*組別空白組模型組美沙拉嗪組清腸溫中方組只數(shù)6666

2.3 清腸溫中方對(duì)模型小鼠結(jié)腸組織病理形態(tài)的影響

空白組小鼠結(jié)腸組織結(jié)構(gòu)正常，紋理整齊，結(jié)腸黏膜未見病變；模型組小鼠結(jié)腸組織可見黏膜下隱窩結(jié)構(gòu)改變和炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；與模型組比較，清腸溫中方組和美沙拉嗪組小鼠結(jié)腸組織隱窩結(jié)構(gòu)恢復(fù)，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)減少。見圖3。

圖3 各組小鼠結(jié)腸組織形態(tài)（HE染色，×1200）

2.4 清腸溫中方對(duì)模型小鼠結(jié)腸組織杯狀細(xì)胞的影響

空白組小鼠結(jié)腸組織杯狀細(xì)胞規(guī)則分布于隱窩兩側(cè)，形態(tài)飽滿；與空白組比較，模型組小鼠結(jié)腸組織隱窩結(jié)構(gòu)改變，杯狀細(xì)胞數(shù)量減少、大小不均、黏液減少；清腸溫中方組和美沙拉嗪組小鼠結(jié)腸組織杯狀細(xì)胞沿腺體分布、排列較密集、數(shù)量增多。見圖4。

圖4 各組小鼠結(jié)腸組織形態(tài)（AB-PAS染色，×1200）

2.5 清腸溫中方對(duì)模型小鼠結(jié)腸組織核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白6、白細(xì)胞介素-18蛋白表達(dá)的影響

與空白組比較，模型組小鼠結(jié)腸組織NLRP6蛋白表達(dá)顯著降低，IL-18蛋白表達(dá)顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；與模型組比較，清腸溫中方組和美沙拉嗪組小鼠結(jié)腸組織NLRP6蛋白表達(dá)顯著升高，IL-18蛋白表達(dá)顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.01）。見圖5、圖6。

圖5 各組小鼠結(jié)腸組織NLRP6、IL-18蛋白免疫印跡

圖6 各組小鼠結(jié)腸組織NLRP6、IL-18蛋白表達(dá)比較（±s，每組6只）

2.6 清腸溫中方對(duì)模型小鼠結(jié)腸組織黏蛋白2表達(dá)的影響

與空白組比較，模型組小鼠結(jié)腸組織MUC2蛋白表達(dá)顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；與模型組比較，清腸溫中方組MUC2蛋白表達(dá)顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。見圖7、圖8。

圖7 各組小鼠結(jié)腸組織MUC2蛋白表達(dá)（免疫熒光染色，×1200）

圖8 各組小鼠結(jié)腸組織MUC2蛋白表達(dá)比較（±s，每組6只）

3 討論

目前臨床治療UC以5-氨基水楊酸制劑、糖皮質(zhì)激素、免疫抑制劑為主，雖然在改善臨床癥狀方面具有一定療效，但在促進(jìn)腸黏膜愈合及維持長(zhǎng)期療效方面仍不盡如意。中醫(yī)藥具有多成分、多靶點(diǎn)的特點(diǎn)，在UC治療方面有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，能有效改善患者臨床癥狀，并促進(jìn)腸黏膜愈合[15]。

UC發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，腸屏障損傷是腸黏膜潰瘍形成和炎癥發(fā)生的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。正常腸黏膜屏障是由機(jī)械屏障、黏液屏障、免疫屏障和生物屏障組成的復(fù)雜系統(tǒng)，具有促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)吸收和防止病原體入侵作用[16]。腸黏膜屏障完整性在維持機(jī)體健康方面至關(guān)重要。研究認(rèn)為，易感人群受環(huán)境、微生物和遺傳因素等相互作用，導(dǎo)致免疫系統(tǒng)誘發(fā)異常炎癥反應(yīng)，是炎癥性腸病的主要環(huán)節(jié)[17]。黏液屏障是腸屏障中直接與腸腔內(nèi)容物接觸的部分，在維持腸道穩(wěn)態(tài)方面扮演重要角色。黏液屏障作為機(jī)械屏障的“前哨”，能在腸黏膜抵御外源細(xì)菌和腸道固有微生物侵襲時(shí)發(fā)揮作用，尤其是將腸上皮與腸道菌群隔離，避免過度免疫反應(yīng)的發(fā)生[18]。黏液、免疫球蛋白、抗菌肽等物質(zhì)是黏液屏障的主要組成成分。黏液屏障分內(nèi)外2層：內(nèi)層由復(fù)層黏液組成，附著在腸上皮細(xì)胞表面，阻止腸道菌群入侵；外層可為共生菌新陳代謝提供能量，是細(xì)菌定植的部位[19]。黏液作為黏液屏障的主要物質(zhì)基礎(chǔ)，由腸道杯狀細(xì)胞分泌產(chǎn)生。杯狀細(xì)胞不僅分泌MUC2、MUC3、MUC12和MUC17等黏蛋白，還分泌多種典型的黏液成分，如CLCA1、FCGBP、AGR2、ZG16和TFF3等，杯狀細(xì)胞與其分泌的黏液成分組成腸道第一道免疫防線[20]。MUC2在UC進(jìn)展中的作用尤為突出。研究發(fā)現(xiàn)，MUC2蛋白缺乏更易發(fā)生結(jié)腸炎癥；此外，MUC2還能維持腸道微生物群，促進(jìn)腸道穩(wěn)態(tài)[21]。研究表明，MUC2分泌可能受NLRP6對(duì)杯狀細(xì)胞功能調(diào)節(jié)的影響[22]，提示NLRP6與黏液屏障關(guān)系密切。NLRP6是NOD樣受體家族成員，作為細(xì)胞膜先天免疫傳感器識(shí)別微生物相關(guān)分子模式。NLRP6激活后招募凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白和炎癥性Caspase-1或Caspase-11，形成炎癥體，介導(dǎo)促炎因子IL-18、IL-1β的成熟和分泌[23]。NLRP6在腸上皮細(xì)胞高表達(dá)，主要功能是識(shí)別不同病原體，通過Toll樣受體抑制NF-κB和MAPK信號(hào)通路，從而抑制炎癥，調(diào)節(jié)IL-18產(chǎn)生；通過影響自噬體形成調(diào)節(jié)腸道黏液分泌，發(fā)揮維持腸上皮完整性、保護(hù)腸道黏液屏障、促進(jìn)腸黏膜傷口愈合的作用[24]。研究發(fā)現(xiàn)，在DSS誘導(dǎo)的腸道損傷中，NLRP6表達(dá)上調(diào)降低了腸道對(duì)結(jié)腸炎的易感性[8]，而缺乏NLRP6小鼠在DSS誘導(dǎo)下表現(xiàn)出更嚴(yán)重的病情，這可能與NLRP6調(diào)控隱窩中細(xì)菌生長(zhǎng)，從而影響IL-18分泌有關(guān)[25]。

李軍祥教授認(rèn)為，UC活動(dòng)期至緩解期存在動(dòng)態(tài)病機(jī)演變規(guī)律，即由脾氣虛逐漸發(fā)展為脾陽虛，終致脾腎陽虛，由濕邪偏盛，漸至熱邪偏盛，熱毒熾盛，瘀血內(nèi)阻[26-27]。清腸溫中方由黃連、炮姜、青黛、苦參、三七、木香、地榆炭、炙甘草組成，具有清熱燥濕、涼血化瘀、溫中健脾功效。前期研究顯示，清腸溫中方能調(diào)節(jié)UC腸道菌群、促進(jìn)腸上皮細(xì)胞增殖[28]，有效促進(jìn)患者腸道黏膜愈合[12]。

本研究中，模型組小鼠DAI評(píng)分升高，結(jié)腸黏膜杯狀細(xì)胞數(shù)量較空白組減少，黏液分泌減少，結(jié)腸組織NLRP6和MUC2表達(dá)降低，IL-18表達(dá)升高，表明NLRP6/IL-18/MUC2軸對(duì)UC腸道黏液屏障功能具有一定影響。清腸溫中方能夠改善DSS誘導(dǎo)的UC小鼠疾病程度，降低DAI評(píng)分，促進(jìn)結(jié)腸組織損傷修復(fù)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，清腸溫中方干預(yù)后，模型小鼠結(jié)腸組織杯狀細(xì)胞數(shù)量增加，NLRP6和MUC2表達(dá)升高，IL-18表達(dá)降低，提示清腸溫中方可能通過激活NLRP6調(diào)節(jié)IL-18產(chǎn)生，進(jìn)而影響杯狀細(xì)胞分泌MUC2，減輕結(jié)腸黏膜病理損傷，促進(jìn)腸道黏液屏障修復(fù)。本研究基于NLRP6/IL-18/MUC2軸探討清腸溫中方治療UC腸屏障損傷的作用機(jī)制，可為其臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。