王卓怡，陸筱波

張家港市中醫(yī)醫(yī)院 藥學(xué)部，江蘇 張家港 215600

糖尿病腎病是糖尿病患者最為常見的并發(fā)癥之一，也是介導(dǎo)慢性腎病和終末期腎衰竭的主要原因[1]。流行病學(xué)調(diào)查顯示，全球有30%～40%的糖尿病患者會因為病情的遷延而進(jìn)展至糖尿病腎病，其中伴有終末期腎臟病患者的5 年生存率＜20%[2]。因此，延緩糖尿病腎病進(jìn)展對于改善糖尿病患者生存質(zhì)量具有重大意義。糖尿病腎病發(fā)病機(jī)制復(fù)雜可能與慢性炎癥、氧化應(yīng)激、糖脂代謝紊亂及血流動力學(xué)異常相關(guān)[3-4]。研究表明，持續(xù)性的炎癥反應(yīng)是導(dǎo)致糖尿病腎病病情進(jìn)展的關(guān)鍵因素[5-6]。細(xì)胞焦亡是近年來發(fā)現(xiàn)的一種與炎癥反應(yīng)密切相關(guān)的新型程序性細(xì)胞死亡方式，可由Caspase-1 依賴性經(jīng)典細(xì)胞焦亡途徑和Caspase-4/5/11 依賴性非經(jīng)典細(xì)胞焦亡途徑觸發(fā)，導(dǎo)致細(xì)胞腫脹及內(nèi)容物釋放，從而誘發(fā)炎癥級聯(lián)反應(yīng)[7]。研究已證實，以Caspase-1 介導(dǎo)經(jīng)典細(xì)胞焦亡途徑在糖尿病腎病中被廣泛性研究，NOD 樣受體蛋白3（NLRP3）炎癥小體、Caspase-1 及其下游靶標(biāo)分子消皮素D（GSDMD）是介導(dǎo)經(jīng)典細(xì)胞焦亡發(fā)生的關(guān)鍵[8]?；钚匝醮兀≧OS）除了是介導(dǎo)氧化應(yīng)激反應(yīng)的關(guān)鍵調(diào)控因子外，也是NLRP3炎癥小體活化的上游啟動因子，能夠誘導(dǎo)NLRP3 炎癥小體活化，促進(jìn)炎癥因子成熟及分泌，從而誘導(dǎo)細(xì)胞焦亡[9]。因此，以Caspase-1 介導(dǎo)的細(xì)胞焦亡為靶標(biāo)，通過干預(yù)ROS-NLRP3 炎癥小體途徑將為糖尿病腎病防治提供新的治療策略和干預(yù)靶點。

利拉魯肽是一種長效的胰高血糖素樣肽-1（GLP-1）受體激動劑[10]。研究發(fā)現(xiàn)，利拉魯肽除具有良好的降血糖作用外，還具有抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)和減輕機(jī)體炎癥等作用[11-12]。馬秀琦等[13]研究發(fā)現(xiàn)，利拉魯肽能夠通過抑制NLRP3 炎癥小體活化，降低炎癥因子釋放，改善糖尿病腎病大鼠損傷。但目前有關(guān)利拉魯肽對糖尿病腎病細(xì)胞焦亡的作用尚未見相關(guān)報道。本研究擬通過構(gòu)建糖尿病腎病大鼠模型，從ROS-NLRP3 炎癥小體途徑，闡明利拉魯肽對糖尿病腎病細(xì)胞焦亡的作用，旨在為利拉魯肽臨床治療糖尿病腎病提供新的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 雄性，SPF 級，SD 大鼠，周齡6 周，體質(zhì)量（200±10）g，購自于北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司[SCXK（京）2019-0017]。所有大鼠均放置于清潔級實驗動物房內(nèi)飼養(yǎng)，動物房內(nèi)溫度（25±2）℃，環(huán)境相對濕度55%～65%，12 h/12 h晝夜交替光照，適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周。本動物實驗符合替代、減少、優(yōu)化基本原則，且經(jīng)過本院實驗動物倫理委員會審批（批號LLSC2020-10-002）。

1.1.2 主要試劑 利拉魯肽注射液（諾和諾德公司，批號202106ABV1，規(guī)格3 mL∶18 mg/支）；鏈脲佐菌素（STZ，美國Sigma 公司，批號S1030）；N-乙酰半胱氨酸（NAC，英國Abcam 公司，批號ab143032）；血清肌酐（Scr）、血尿素氮（BUN）檢測試劑盒（美國Sigma 公司，批號MAK080、MAK006）；丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH）（南京建成生物工程研究所，批號A003-1-2、A001-1-3、A005-1-2）；二氫乙錠（DHE）染色液（美國Santa Cruz 公司，批號sc-204724A）；蘇木素-伊紅（HE）染色試劑盒（北京索萊寶科技有限公司，批號G1120）；Masson 染色檢測試劑盒（武漢塞維爾生物科技有限公司，批號G1006）；BCA 蛋白質(zhì)濃度檢測試劑盒、山羊抗兔二抗、山羊抗鼠二抗、ECL 發(fā)光液、β-actin一抗（碧云天生物技術(shù)，批號P0009、A0208、A0216、P0018S、AF5001）；NLRP3 一抗、凋亡相關(guān)斑點樣蛋白（ASC）一抗、Caspase-1 一抗、GSDMD 一抗、白細(xì)胞介素（IL）-1β 一抗、IL-18 一抗（美國Cell Signaling Technology，批號15101、67824、83383、39754、12242、57058）。

1.1.3 主要儀器 Cobas c702 全自動生化分析儀（德國Roch 公司）；BX53 光學(xué)顯微鏡（日本Olympus公司）；BX43 熒光顯微鏡（日本Olympus 公司）；1730R 高速冷凍離心機(jī)（上海貝晶生物技術(shù)公司）；GelDoc XR+凝膠成像儀（美國Bio-Rad 公司）；Rt2100c 多功能酶標(biāo)儀（美國Rayto 公司）。

1.2 方法

1.2.1 糖尿病腎病模型構(gòu)建、分組及給藥 將60 只SD 大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周，隨機(jī)分為對照組10 只和模型組50 只。采用多次小劑量 ip STZ 40 mg/kg，連續(xù)5 d 構(gòu)建糖尿病大鼠模型，注射3 d 后連續(xù)3 d空腹血糖值均≥16.7 mmol/L，則判定糖尿病大鼠模型構(gòu)建成功[14]。定期進(jìn)行血糖檢測，剔除血糖緩解者，飼養(yǎng)4 周后檢測糖尿病大鼠24 h 尿蛋白水平，若尿蛋白定量≥30 mg，且尿糖為陽性者，則判定糖尿病腎病大鼠模型構(gòu)建成功[15]。造模過程中，大鼠死亡2 只，造模失敗2 只，共計46 只大鼠造模成功。從造模成功大鼠中隨機(jī)選取40 只分為模型組、利拉魯肽組、ROS 抑制劑（NAC）組、利拉魯肽＋NAC 組，每組各10 只。利拉魯肽組大鼠sc 200 μg/(kg·d)的利拉魯肽[13]；NAC 組大鼠ip 20 mg/(kg·d)的NAC；利拉魯肽＋NAC 組大鼠sc 200 μg/(kg·d)的利拉魯肽的同時ip 20 mg/(kg·d)的NAC；對照組和模型組大鼠sc 等量的生理鹽水，1 次/d，連續(xù)治療4 周。治療4 周后，收集大鼠24 h 尿液、腎組織及血液進(jìn)行后續(xù)實驗研究。

1.2.2 生化指標(biāo)檢測 收集各組大鼠24 h 尿液，測定尿微量蛋白排泄率（MAER）；空腹尾靜脈采血，血糖儀測定空腹血糖（FBG），檢驗試劑盒測定Scr、BUN 水平。

1.2.3 腎組織病理形態(tài)學(xué)觀察 取適量腎組織，除去被膜，4%多聚甲醛固定48 h，經(jīng)脫水、石蠟包埋、切片后，分別進(jìn)行HE 染色和Masson 染色，通過光學(xué)顯微鏡下觀察腎組織病理學(xué)變化并采集圖像。

1.2.4 腎組織氧化應(yīng)激指標(biāo)檢測 取出液氮中凍存的腎組織，稱取1 g 腎組織采用預(yù)冷的生理鹽水將其充分碾磨制備成10%的組織勻漿，化學(xué)比色法檢測腎組織MDA 含量及SOD 和GSH 活性。

1.2.5 腎組織ROS 含量檢測 取出固定好的腎組織，常規(guī)方式制備成石蠟切片，于避光條件下將組織切片置于DHE（10 μmol/L）溶液中孵育20 min，PBS 溶液清洗切片3 次，熒光顯微鏡下觀察各組大鼠腎組織細(xì)胞紅色熒光情況，并通過Image Pro Plus 6.0 軟件進(jìn)行ROS 熒光強(qiáng)度半定量檢測。

1.2.6 Western blotting 檢測腎組織NLRP3 炎癥小體和焦亡相關(guān)蛋白表達(dá) 取適量的腎組織加入蛋白裂解液進(jìn)行組織勻漿，4 ℃、12 000 r/min 離心10 min，吸取上清液即為總蛋白，BCA 法測定蛋白質(zhì)濃度，蛋白質(zhì)變性后進(jìn)行凝膠電泳，每個泳道上樣蛋白為30 μg，SDS-PAGE 凝膠電泳后，行濕轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)膜只PVDF 膜上，5%脫脂牛奶封閉60 min，TBST洗膜，加入一抗NLRP3（1∶1 000）、ASC（1∶500）、Caspase-1（1∶500）、GSDMD（1∶1000）、IL-1β（1∶500）、IL-18（1∶500）、β-actin（1∶5 000），4℃，孵育過夜；TBST 洗膜，加入山羊抗兔或山羊抗鼠二抗（1∶5 000），室溫下，孵育60 min，TBST 洗膜，滴加顯影液對目的蛋白進(jìn)行可視化處理，并采用Image Pro Plus 6.0 軟件進(jìn)行蛋白質(zhì)條帶灰度值半定量分析。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

Graphpad prism 6.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)數(shù)據(jù)處理。數(shù)據(jù)以表示，數(shù)據(jù)滿足正態(tài)分布且方差齊性，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。

2 結(jié)果

2.1 利拉魯肽對糖尿病腎病大鼠空腹血糖及腎功能生化指標(biāo)的影響

與對照組大鼠相比，模型組大鼠FBG、24 h 尿液MAER、血清Scr、BUN 水平均顯著升高（P＜0.05）。與模型組相比，利拉魯肽組和NAC 組大鼠的24 h 尿液MAER、血清Scr、BUN 水平均顯著降低（P＜0.05）。與利拉魯肽組相比，利拉魯肽＋NAC組大鼠的24 h 尿液MAER、血清Scr、BUN 水平均顯著降低（P＜0.05），而FBG 水平無顯著性變化，見表1。

表1 各組大鼠空腹血糖及腎功能生化指標(biāo)比較（，n=10）Table 1 Comparison of FBG and biochemical indicators of renal function in each group of rats (,n=10)

表1 各組大鼠空腹血糖及腎功能生化指標(biāo)比較（，n=10）Table 1 Comparison of FBG and biochemical indicators of renal function in each group of rats (,n=10)

與對照組比較：*P＜0.05；與模型組比較：#P＜0.05；與利拉魯肽組比較：&P＜0.05*P ＜ 0.05 vs control group;#P ＜ 0.05 vs model group;&P ＜ 0.05 vs liraglutide group

2.2 利拉魯肽對糖尿病腎病大鼠腎組織病理形態(tài)學(xué)的影響

對照組大鼠腎組織腎小球無明顯的肥大增生等病理改變。與對照組相比，模型組大鼠腎組織腎小球肥大、增生、腎小管基底膜增厚及系膜基質(zhì)增多明顯。與模型組相比，利拉魯肽組、NAC 組、利拉魯肽＋NAC 組大鼠腎組織腎小球肥大、增生，系膜擴(kuò)張和系膜基質(zhì)增多等病理改變均得到明顯改善。與利拉魯肽組相比，利拉魯肽＋NAC 組大鼠腎組織形態(tài)和結(jié)構(gòu)病理改變更為顯著，見圖1。

圖1 各組大鼠腎組織形態(tài)和結(jié)構(gòu)變化（×400）Fig.1 Changes of renal tissue morphology and structure of rats in each group (× 400)

2.3 利拉魯肽對糖尿病腎病大鼠腎組織氧化應(yīng)激水平的影響

與對照組相比，模型組大鼠腎組織MDA 含量顯著升高，SOD、GSH 含量均顯著降低（P＜0.05）。與模型組大鼠相比，利拉魯肽組和NAC 組大鼠腎組織MDA 均含量顯著降低，SOD、GSH 含量均顯著升高（P＜0.05）。與利拉魯肽組大鼠相比，利拉魯肽＋NAC 組大鼠的腎組織MDA 含量均顯著降低，而SOD、GSH 含量均顯著升高（P＜0.05），見表2。

表2 各組大鼠腎組織氧化應(yīng)激水平比較（，n=10）Table 2 Comparison of oxidative stress levels in renal tissue of rats in each group (,n=10)

表2 各組大鼠腎組織氧化應(yīng)激水平比較（，n=10）Table 2 Comparison of oxidative stress levels in renal tissue of rats in each group (,n=10)

與對照組比較：*P＜0.05；與模型組比較：#P＜0.05；與利拉魯肽組比較：&P＜0.05*P ＜ 0.05 vs control group;#P ＜ 0.05 vs model group;&P ＜ 0.05 vs liraglutide group

2.4 利拉魯肽對糖尿病腎病大鼠腎組織ROS 和NLRP3 炎癥小體活化的影響

與對照組相比，模型組大鼠腎組織ROS 水平、NLRP3、ASC、Caspase-1 蛋白表達(dá)顯著升高（P＜0.05）。與模型組相比，利拉魯肽組和NAC 組大鼠腎組織ROS 水平、NLRP3、ASC、Caspase-1 蛋白表達(dá)均顯著降低（P＜0.05）。與利拉魯肽組相比，利拉魯肽＋NAC 組大鼠腎組織ROS 水平、NLRP3、ASC、Caspase-1 蛋白表達(dá)均顯著降低（P＜0.05），見圖2、表3。

圖2 各組大鼠腎組ROS 染色（A）及NLRP3 炎癥小體相關(guān)蛋白電泳圖（B）Fig.2 ROS staining (A) and NLRP3 inflammasome associated protein electrophoresis (B) of rat kidney groups in each group

表3 各組大鼠腎組織ROS 水平及NLRP3 炎癥小體相關(guān)蛋白相對表達(dá)（，n=10）Table 3 ROS levels and NLRP3 inflammasome related protein expression in renal tissue of rats in each group (,n=10)

表3 各組大鼠腎組織ROS 水平及NLRP3 炎癥小體相關(guān)蛋白相對表達(dá)（，n=10）Table 3 ROS levels and NLRP3 inflammasome related protein expression in renal tissue of rats in each group (,n=10)

與對照組比較：*P＜0.05；與模型組比較：#P＜0.05；與利拉魯肽組比較：&P＜0.05*P ＜ 0.05 vs control group;#P ＜ 0.05 vs model group;&P ＜ 0.05 vs liraglutide group

2.5 利拉魯肽對糖尿病腎病大鼠腎組焦亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

與對照組相比，模型組大鼠腎組織焦亡相關(guān)蛋白 cleaved-Caspase-1/pro-Caspase-1、GSDMDN/GSDMD、IL-1β、IL-18 蛋白表達(dá)顯著升高（P＜0.05）。與模型組相比，利拉魯肽組和NAC 組大鼠腎組織焦亡相關(guān)蛋白 cleaved-Caspase-1/pro-Caspase-1、GSDMD-N/GSDMD、IL-1β、IL-18 蛋白表達(dá)均顯著降低（P＜0.05、0.01）。與利拉魯肽組相比，利拉魯肽＋NAC 組大鼠腎組織焦亡相關(guān)蛋白cleaved-Caspase-1/pro-Caspase-1、GSDMD-N/GSDMD、IL-1β、IL-18 蛋白表達(dá)均顯著降低（P＜0.05、0.01），見圖3、表4。

圖3 各組大鼠腎組織焦亡相關(guān)蛋白電泳圖Fig.3 Electrophoretic maps of pyroptosis related proteins in renal tissue of rats in each group

表4 各組大鼠腎組織焦亡相關(guān)蛋白相對表達(dá)（，n=10）Table 4 Relative expression of pyroptosis related proteins in renal tissue of rats in each group (,n=10)

表4 各組大鼠腎組織焦亡相關(guān)蛋白相對表達(dá)（，n=10）Table 4 Relative expression of pyroptosis related proteins in renal tissue of rats in each group (,n=10)

與對照組比較：*P＜0.05；與模型組比較：#P＜0.05 ##P＜0.01；與利拉魯肽組比較：&P＜0.05 &&P＜0.01*P ＜ 0.05 vs control group;#P ＜ 0.05 ##P ＜ 0.01 vs model group;&P ＜ 0.05 &&P ＜ 0.01 vs liraglutide group

3 討論

糖尿病腎病是糖尿病患者發(fā)病和死亡的主要原因之一，在1 型和2 型糖尿病患者中的發(fā)病率高達(dá)30%和50%，嚴(yán)重危害糖尿病患者生命健康[16]。目前尚無治療糖尿病腎病的特異性藥物，臨床現(xiàn)有的治療方式尚不能得到滿意的效果，大約有50%的糖尿病腎病患者需要腎臟替代治療[3]。1 項薈萃分析顯示，GLP-1 受體激動劑能夠明顯改善2 型糖尿病的腎臟結(jié)局[17]。研究表明，利拉魯肽作為長效GLP-1 受體激動劑能夠通過降低血糖、抑制氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)等途徑改善糖尿病腎病腎損傷[11-12]。但是，目前有關(guān)利拉魯肽對2 型糖尿病腎病腎損傷的保護(hù)作用機(jī)制尚不完全清楚。本研究通過多次小劑量ip STZ 構(gòu)建糖尿病腎病大鼠模型，觀察利拉魯肽對糖尿病腎病大鼠腎損傷的保護(hù)作用。結(jié)果顯示，造模4 周后，大鼠腎功能指標(biāo)24 h MAER、Scr、BUN 水平均顯著升高，腎組織形態(tài)結(jié)構(gòu)出現(xiàn)明顯的病理損傷，表明糖尿病腎病大鼠模型構(gòu)建成功。與模型組相比，利拉魯肽能夠通過降低腎功能指標(biāo)、血糖水平，改善糖尿病腎病腎損傷。

炎癥反應(yīng)作為糖尿病腎病進(jìn)展的重要病理機(jī)制，在糖尿病腎病腎功能損傷中發(fā)揮關(guān)鍵作用。多項研究表明，通過抑制炎癥反應(yīng)過程中的炎癥因子、信號通路及其下游產(chǎn)物能夠明顯改善糖尿病腎病腎損傷[18-20]。細(xì)胞焦亡是新近發(fā)現(xiàn)的一種促炎性程序性細(xì)胞死亡方式，主要由NLRP3 炎癥小體、Caspase-1 和GSDMD 共同介導(dǎo)[21]。研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)細(xì)胞受到病原相關(guān)分子模式和損傷相關(guān)分子模式分子刺激后，誘導(dǎo)炎性Caspase-1 活化，導(dǎo)致細(xì)胞焦亡執(zhí)行者GSDMD 發(fā)生剪切形成具有GSDMD-C和細(xì)胞毒性GSDMD-N，后者募集至細(xì)胞上形成細(xì)胞焦亡小孔，促進(jìn)成熟IL-1β 和IL-18 釋放至細(xì)胞外，誘導(dǎo)炎癥級聯(lián)反應(yīng)[22]。研究證實，適度的炎癥反應(yīng)能夠?qū)C(jī)體產(chǎn)生保護(hù)性免疫作用，過度的炎癥如炎癥風(fēng)暴、級聯(lián)反應(yīng)會導(dǎo)致機(jī)體免疫功能的破壞進(jìn)而加重糖尿病腎病腎損傷[23]。多項研究發(fā)現(xiàn)，在糖尿病腎病大鼠模型中腎組織焦亡相關(guān)蛋白表達(dá)均顯著升高，而抑制Caspase-1 表達(dá)能夠降低高糖誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞和足細(xì)胞焦亡，改善糖尿病腎病腎損傷[24-25]。以上研究表明，以炎癥反應(yīng)為特點的細(xì)胞焦亡可能是糖尿病腎病新型的治療策略和靶點。本研究結(jié)果顯示，利拉魯肽能夠降低細(xì)胞焦亡相關(guān)蛋白表達(dá)，改善糖尿病腎病腎損傷。NLRP3 炎癥小體是由NLRP3、ASC 和pro-Caspase-1 三者共同組成的蛋白復(fù)合物，是啟動細(xì)胞焦亡的上游反應(yīng)原件。當(dāng)機(jī)體在多種治病因素的作用下，激活NLRP3 炎癥小體，從而誘導(dǎo)Caspase-1 依賴性細(xì)胞焦亡[26]。ROS 是介導(dǎo)氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)的重要調(diào)控因子，ROS 能夠通過激活NLRP3 炎癥小體，誘導(dǎo)Caspase-1 介導(dǎo)的細(xì)胞焦亡[27]。本研究結(jié)果顯示，利拉魯肽能夠降低ROS 水平，抑制氧化應(yīng)激和NLRP3 炎癥小體活化，提示利拉魯肽抑制糖尿病腎病細(xì)胞焦亡可能與調(diào)控ROS-NLRP3 炎癥小體途徑相關(guān)。Shen 等[28]研究發(fā)現(xiàn)，石榴皮鞣素能夠通過抑制ROS/NLRP3 途徑，減輕脂多糖/ATP 誘導(dǎo)的小鼠J774A.1 細(xì)胞焦亡，ROS 清除劑NAC 能夠發(fā)揮與石榴皮鞣素同向作用抑制脂多糖/ATP 誘導(dǎo)的小鼠J774A.1 細(xì)胞焦亡。為進(jìn)一步明確ROS/NLRP3 炎癥小體途徑在利拉魯肽抑制糖尿病腎病細(xì)胞焦亡中的作用，本實驗通過大鼠ip NAC 觀察糖尿病腎病大鼠細(xì)胞焦亡情況。結(jié)果顯示，NAC 能夠通過抑制ROS/NLRP3 炎癥小體介導(dǎo)的細(xì)胞焦亡，進(jìn)而發(fā)揮與利拉魯肽同向糖尿病腎病腎損傷保護(hù)作用。與利拉魯肽組相比，利拉魯肽＋NAC 組大鼠上述相關(guān)指標(biāo)減輕各更為顯著，糖尿病腎病腎損傷得到進(jìn)一步改善，表明利拉魯肽能夠通過ROS-NLRP3 炎癥小體途徑，抑制細(xì)胞焦亡，進(jìn)而改善糖尿病腎病大鼠腎損傷。

綜上所述，本利拉魯肽能夠通過ROS-NLRP3炎癥小體途徑，抑制腎組織氧化應(yīng)激介導(dǎo)的NLRP3炎癥小體活化，從而抑制細(xì)胞焦亡，并最終發(fā)揮抗糖尿病腎病腎損傷作用。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突