張成盈，姜璐，王永森，張?jiān)扑?/p>

1.山東中醫(yī)藥大學(xué) 第一臨床醫(yī)學(xué)院，山東 濟(jì)南 250014

2.山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，山東 濟(jì)南 250014

慢性便秘是一種以排便困難、排便次數(shù)減少及排便時(shí)間延長且遷延不愈達(dá)半年以上為主癥的疾病[1]。隨著經(jīng)濟(jì)水平的發(fā)展及人口老齡化時(shí)代的到來，人們飲食結(jié)構(gòu)逐漸豐富的同時(shí)卻忽略了對胃腸道疾病的重視，使慢性便秘這一全球廣泛性疾病的新發(fā)率及患病率逐年上升，且大多數(shù)患者對疾病認(rèn)知不足、濫用藥物及過度就醫(yī)，造成了疾病的慢性遷延，使其生活質(zhì)量無法得到保證[2]。目前臨床對慢性便秘的治療藥物常以西藥為主，其有效性及安全性已得到證實(shí)[3]，然而因其病程較長，需長期輔助用藥，但用藥后藥物依賴，水電解質(zhì)紊亂等不良事件在臨床診療中時(shí)常發(fā)生，甚至因腸神經(jīng)系統(tǒng)損傷而引起結(jié)腸黑變病[1]，因此尚缺乏理想的治療方法與手段。厚樸排氣合劑作為中成藥，其承仲景名方“厚樸三物湯”之義，由厚樸（姜制）、大黃、木香、枳實(shí)（麩炒）組成，立意行氣消脹、寬中除滿。臨床診療中，常用于外科手術(shù)后腸道功能的恢復(fù)，此外，文獻(xiàn)研究發(fā)現(xiàn)，近年來厚樸排氣合劑在慢性便秘治療中的使用率逐步上升，并顯示出一定的臨床療效，但其潛在作用機(jī)制尚未明確。故本研究通過收集、篩選厚樸排氣合劑的所有活性成分，進(jìn)而運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及分子對接的方法，將其治療慢性便秘的潛在活性成分、靶點(diǎn)、通路進(jìn)行可視化，明確其作用機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 厚樸排氣合劑活性成分及靶蛋白篩選

將厚樸、大黃、木香、枳實(shí)4 味中藥輸入TCMSP數(shù)據(jù)庫（https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php）中對其化學(xué)成分進(jìn)行檢索，依據(jù)口服生物利用度（OB）≥30%及類藥性（DL）≥0.18 的標(biāo)準(zhǔn)確定活性成分，同時(shí)查閱《中國藥典》2020 年版[4]及相關(guān)文獻(xiàn)將4味藥中含量較大或活性強(qiáng)的化合物進(jìn)行手動添加，最后將所有活性成分導(dǎo)入U(xiǎn)niport 數(shù)據(jù)庫（https://www.uniprot.org/）尋找對應(yīng)的靶蛋白。

1.2 藥物–活性成分–靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖構(gòu)建及主要活性成分篩選

建立Network及Type 屬性文件，導(dǎo)入Cytoscape 3.7.1 軟件（https://cytoscape.org/）構(gòu)建厚樸排氣合劑-活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖并對提取活性成分。

1.3 慢性便秘靶點(diǎn)篩選及韋恩圖繪制

將 “ chronic constipation ”“ functional constipation”作為關(guān)鍵索引詞，在OMIM 數(shù)據(jù)庫（https://omim.org/）、GeneCards 數(shù)據(jù)庫（https://www.genecards.org/）、TTD 數(shù)據(jù)庫（https://db.idrblab.net/ttd/）、DrugBank 數(shù)據(jù)庫（https://go.drugbank.com/）中進(jìn)行信息檢索，獲得慢性便秘相關(guān)靶點(diǎn)，整合數(shù)據(jù)庫所有相關(guān)靶點(diǎn)，刪除重復(fù)值，建立慢性便秘疾病靶點(diǎn)數(shù)據(jù)庫。在Venny 2.1.0（https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html）中將1.1 項(xiàng)下獲取靶點(diǎn)與便秘疾病靶點(diǎn)取交集，繪制韋恩圖，獲得厚樸排氣合劑治療慢性便秘疾病的潛在作用靶點(diǎn)。

1.4 蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建（PPI）及可視化分析

利用String 數(shù)據(jù)庫（https://cn.string-db.org/），將1.3 項(xiàng)下潛在作用靶點(diǎn)導(dǎo)入列表，以置信度≥0.4得到PPI 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建圖，下載tsv 文件，在Cytoscape 3.7.1 中利用CytoNCA 插件，計(jì)算度中心性（DC）、介度中心性（BC）、緊密度中心性（CC）根據(jù)以上3 者的值對PPI 網(wǎng)絡(luò)圖進(jìn)行可視化分析，最終得出厚樸排氣合劑治療慢性便秘關(guān)鍵靶點(diǎn)。

1.5 基因本體（GO）功能及京都基因和基因組百科全書（KEGG）富集通路分析

將厚樸排氣合劑治療慢性便秘潛在作用靶點(diǎn)輸入Metascape 數(shù)據(jù)庫（https://metascape.org/），以P＜0.05 為篩選條件，根據(jù)GO 及KEGG 分別進(jìn)行個性化分析，通過微生信（http://www.Bioin formatics.com.cn/）對數(shù)據(jù)進(jìn)行直觀化體現(xiàn)。

1.6 分子對接

首先依據(jù)TCMSP 數(shù)據(jù)庫獲取關(guān)鍵活性成分的InChIKey，在PubChem 數(shù)據(jù)庫（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）中查找化合物2D 結(jié)構(gòu)，導(dǎo)入Chem3D 軟件中進(jìn)行結(jié)構(gòu)優(yōu)化，輸出mol2 格式。檢索PPI 網(wǎng)絡(luò)中關(guān)鍵靶點(diǎn)在PDB 數(shù)據(jù)庫（https://www.rcsb.org/）中的ID 并下載其晶體結(jié)構(gòu)，通過PyMOL軟件“remove solvent”“remove organic”指令去水分子及殘基結(jié)構(gòu)，導(dǎo)出pdb 格式，其后在Autodock軟件中對大分子蛋白進(jìn)行加氫及尋找活性口袋，對小分子配體導(dǎo)出pdbqt 格式，通過vina 進(jìn)行對接分析，在PyMOL 軟件中將分子對接進(jìn)行可視化展示。根據(jù)結(jié)果進(jìn)行對接分析，結(jié)合能為負(fù)值則說明配體可自發(fā)的與受體進(jìn)行結(jié)合，當(dāng)結(jié)合能小于-6 kJ/mol則說明結(jié)合較好。

2 結(jié)果

2.1 厚樸排氣合劑活性成分及靶點(diǎn)

共獲得56 種活性成分，其中大黃16 種，木香6 種，厚樸2 種，枳實(shí)22 種，通過文獻(xiàn)檢索[5-8]及中國藥典[4]補(bǔ)充10 種，其中木香補(bǔ)充2 種，分別為木香烴內(nèi)酯、異中美菊素C；厚樸補(bǔ)充6 種，分別為亞油酸甲酯、甲基反亞油酸甲酯、厚樸酚、和厚樸酚、10,13-十八二烯酸甲酯、和厚樸新酚；枳實(shí)補(bǔ)充2 種，分別為橙皮素、柚皮苷，見表1。藥物成分靶點(diǎn)去重后共獲得304 個相關(guān)靶點(diǎn)。

表1 厚樸排氣合劑成分Table 1 Composition of Houpo Paiqi Mixture

2.2 藥物–活性成分–靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖

網(wǎng)絡(luò)圖中共355 個節(jié)點(diǎn)，840 條邊，通過Network Analysis 插件計(jì)算degree 值，排名前10 位的活性成分為黃柏酮、木犀草素、大黃酸、β-谷甾醇、柚皮素、枸橘苷、木香烴內(nèi)酯、和厚樸酚、豆甾醇、川陳皮素，這些成分可能為厚樸排氣合劑治療慢性便秘的主要活性成分，見圖1。

圖1 厚樸排氣合劑–活性成分–靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖Fig.1 Network of Houpo Paiqi Mixture -active ingredient -target

2.3 慢性便秘靶點(diǎn)

檢索4 個數(shù)據(jù)庫合并去重后共獲得5 367 個慢性便秘相關(guān)靶點(diǎn)。通過Venny 2.1.0 取得厚樸排氣合劑及慢性便秘交集靶點(diǎn)216 個，為厚樸排氣合劑治療慢性便秘的潛在靶點(diǎn)，見圖2。

圖2 厚樸排氣合劑治療慢性便秘的共同靶點(diǎn)Fig.2 Common targets of Houpo Paiqi Mixture in treating chronic constipation

2.4 PPI 網(wǎng)絡(luò)

厚樸排氣合劑治療慢性便秘的PPI 網(wǎng)絡(luò)（圖3A）導(dǎo)入Cytoscape 3.7.1 進(jìn)行可視化（圖3B）。共有217 個節(jié)點(diǎn)，3 445 條邊。利用CytoNCA 插件計(jì)算BC、CC、DC，依據(jù)degree 值得出前10 位關(guān)鍵靶點(diǎn)，包括蛋白激酶B1（Akt1）、腫瘤蛋白p53（TP53）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）、半胱氨酸蛋白水解酶3（CASP3）、血管內(nèi)皮生長因子A（VEGFA）、轉(zhuǎn)錄因子AP-1（JUN）、白細(xì)胞介素-1B（IL-1B）、MYC、表皮生長因子受體（EGFR）、絲裂原激活的蛋白激酶3（MAPK3），見表2。

圖3 PPI 網(wǎng)絡(luò)（A）及靶點(diǎn)可視化圖（B）Fig.3 PPI network (A) and target visualization (B)

表2 厚樸排氣合劑治療慢性便秘關(guān)鍵靶點(diǎn)及拓?fù)鋮?shù)Table 2 Key targets and topological parameters of Houpo Paiqi Mixture in treating chronic constipation

2.5 GO 功能及KEGG 富集通路分析

通過Metascape 數(shù)據(jù)庫對217 個潛在靶點(diǎn)進(jìn)行GO 分析（圖4），按照P＜0.05 進(jìn)行篩選，結(jié)果顯示生物過程（BP）有5 880 條富集結(jié)果，涉及對激素、氮化合物、異生刺激、無機(jī)物、多肽、脂質(zhì)等反應(yīng)；分子功能（MF）分析共得到1 083 條富集顯著結(jié)果；細(xì)胞組成（CC）有540 條富集結(jié)果，涉及樹突、突觸前、膜筏、膜微域、神經(jīng)元細(xì)胞體等。

圖4 GO 功能富集分析Fig.4 GO functional enrichment analysis

通過上述數(shù)據(jù)庫進(jìn)行分析，獲得286 條通路，前20 條通路可視化見圖5。圖中靶點(diǎn)通路主要涉及癌癥相關(guān)通路、磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/Akt 信號通路、細(xì)胞衰老、巨細(xì)胞病毒感染、結(jié)直腸癌等。

圖5 KEGG 富集通路分析Fig.5 KEGG functional enrichment analysis

2.6 分子對接

選擇厚樸排氣合劑中degree 值排名前3 位的活性成分黃柏酮、木犀草素、大黃酸與關(guān)鍵靶點(diǎn)Akt1、TP53、IL-6、CASP3、VEGFA 進(jìn)行分子對接，對接參數(shù)見表3。一般認(rèn)為，結(jié)合受體能為負(fù)值時(shí)認(rèn)為體系更加穩(wěn)定，以結(jié)合能＜-5 kcal/mol（1 cal＝4.4 J）為篩選標(biāo)準(zhǔn)[9]，結(jié)合能＜-7 kcal/mol 結(jié)合活性較好，＜-8 kcal/mol 則結(jié)合活性較強(qiáng)[10]。對接結(jié)果顯示，獲得的對接結(jié)合能大部分＜-7 kcal/mol，均有較好的結(jié)合活性，其中大黃酸與CASP3（-8.3 kcal/mol）、TP53（-8.0 kcal/mol）對接最緊密，選擇結(jié)合能力排名前6 位的組合進(jìn)行可視化，見圖6。

圖6 有效活性成分與關(guān)鍵靶點(diǎn)對接模式圖Fig.6 Model diagram of docking between active ingredients and key targets

表3 關(guān)鍵靶點(diǎn)與有效活性成分對接參數(shù)及結(jié)合能分?jǐn)?shù)Table 3 Docking parameters and binding energy fraction of key targets and active ingredients

3 討論

由于現(xiàn)代醫(yī)學(xué)在治療慢性便秘上存在一定程度的局限性，越來越多的學(xué)者將治療慢性便秘的目光聚焦于中醫(yī)藥的發(fā)展。多項(xiàng)研究也證實(shí)了中藥（包括中藥湯劑及中成藥）在治療慢性便秘中發(fā)揮了顯著的療效[11-13]。通過對厚樸排氣合劑中大黃、厚樸（姜制）、木香、枳實(shí)（麩炒）4 味藥物進(jìn)行研究，可獲得治療慢性便秘的主要成分，根據(jù)degree值排序的前5 位分別為黃柏酮、木犀草素、大黃酸、β-谷甾醇、柚皮素。上述有效成分可對應(yīng)多個靶點(diǎn)，同一靶點(diǎn)也可對應(yīng)多個有效成分，符合中藥復(fù)方制劑多有效成分及多作用靶點(diǎn)的治療特點(diǎn)。黃柏酮為黃柏中的檸檬苦素類成分[14]，可以興奮腸道平滑肌，促進(jìn)腸道收縮，改善結(jié)腸動力問題。研究表明，慢性便秘患者菌群結(jié)構(gòu)較正常人有所不同，在門水平上，其糞便中擬桿菌門（Bacteroidetes）相對豐度上升，變形菌門（Proteobacteria）相對豐度下降[15]，Luo 等[16]發(fā)現(xiàn)黃柏酮治療后可使小鼠擬桿菌門相對豐度下降，變形菌門相對豐度上升，逆轉(zhuǎn)了腸道菌群的失衡。木犀草素為黃酮類化合物，其對慢性便秘的治療機(jī)制主要體現(xiàn)于平滑肌運(yùn)動的調(diào)控，木犀草素可通過對Ca2＋通道的調(diào)控起到促進(jìn)平滑肌運(yùn)動的作用[17]；同時(shí)，木犀草素可使肌細(xì)胞的中Akt去磷酸化而減少活化，阻止PI3K/Akt 信號通路的激活，從而減少平滑肌細(xì)胞的增殖，避免平滑肌病理狀況的發(fā)生發(fā)展[18]。此外一氧化氮（NO）作為內(nèi)源性防御分子，高NO 可抑制消化道平滑肌的收縮功能，導(dǎo)致患者出現(xiàn)排便困難的癥狀[19]，而木犀草素恰恰在發(fā)揮抗炎作用時(shí)可降低NO 含量，抑制細(xì)胞因子表達(dá)，改善大便性狀[20]，起到緩解便秘的作用。大黃酸作為大黃中游離蒽醌類成分，可有效減少腸道致病菌的產(chǎn)生，并能顯著增加乳酸桿菌數(shù)量，調(diào)節(jié)腸道菌群的相對豐度和比例，保持腸道微生態(tài)的平衡[21-22]。β-谷甾醇具有抗抑郁、抗炎、抗氧化、抗菌等藥理作用，可通過抑制細(xì)胞炎癥因子（IL-1β、IL-8、TNF-α 等）的活性，降低TLR2、p-IκB-α、NFκB p65、IκK-α 蛋白表達(dá)水平，改善胃腸道黏膜損傷，從而減輕便秘的癥狀[23-24]。柚皮素與木犀草素相同，均屬于具有抗炎、抗氧化和抗癌作用的黃酮類化合物，同樣也具有抑制腸道內(nèi)炎癥因子及蛋白過量表達(dá)的作用，減輕腸黏膜損傷，起到治療便秘的作用。

根據(jù)PPI 網(wǎng)絡(luò)分析，發(fā)現(xiàn)Akt1、TP53、IL-6、CASP3、IL-1B、MAPK3 等為厚樸排氣合劑治療慢性便秘的關(guān)鍵核心靶點(diǎn)。Akt1 屬于Akt 家族中的1種亞型，參與細(xì)胞的增殖、生長、凋亡整個過程，在多個腫瘤通路中起到關(guān)鍵作用，然而腫瘤通路對Cajal 間質(zhì)細(xì)胞表達(dá)有一定抑制，從而導(dǎo)致胃腸收縮動力減弱[25-27]。研究表明，Akt 被PI3K/Akt 通路激活后，腸道內(nèi)Akt 磷酸水平顯著上調(diào)，提示PI3K/Akt通路的激活促進(jìn)平滑肌的增殖，參與了便秘的發(fā)生過程[28]。TP53 是一種抑癌基因，負(fù)責(zé)調(diào)控細(xì)胞生長、增殖及損傷修復(fù)，當(dāng)細(xì)胞DNA 受損嚴(yán)重時(shí)，TP53 蛋白則阻止細(xì)胞修復(fù)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，同時(shí)TP53 蛋白通過與PPP1R13B/ASPP1 或TP53BP2/ASPP2[29]的相互作用可增強(qiáng)其凋亡活性。CASP 在細(xì)胞凋亡信號傳導(dǎo)的級聯(lián)反應(yīng)中協(xié)同作用，參與細(xì)胞的生長、分化、增殖和運(yùn)動，于細(xì)胞凋亡最密切相關(guān)，CASP3 是細(xì)胞凋亡的效應(yīng)者，參與細(xì)胞凋亡的執(zhí)行。IL-1β 和IL-6 作為多效性促炎細(xì)胞因子，可調(diào)節(jié)細(xì)胞生長，以及細(xì)胞活化、增殖、存活和分化。IL-1β 較IL-6 有更廣泛的促炎性，可參與IL-6的調(diào)節(jié)過程，范文濤等[30]發(fā)現(xiàn)通過抑制IL-6 的釋放，IL-6/JAK/STAT3 信號通路呈現(xiàn)下調(diào)趨勢，抑制胃腸道炎癥反應(yīng)，實(shí)驗(yàn)組大鼠的腸道局部微環(huán)境可以得到改善。研究顯示，便秘大鼠結(jié)腸內(nèi)MAPK 表達(dá)水平明顯低于對照組[31]，萬葉敏等[32]進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)大鼠結(jié)腸組織內(nèi)水通道蛋白AQP3、AQP4 的表達(dá)量受MAPK 通路的下調(diào)，腸道對水分的重吸收減弱，大便性狀發(fā)生變化，從而便秘得到緩解。

GO 富集分析結(jié)果顯示，厚樸排氣合劑可能通過激素反應(yīng)、氮化合物反應(yīng)、異生刺激反應(yīng)等增加大便次數(shù)，使糞質(zhì)變軟，從而改善便秘的不適。KEGG 富集分析結(jié)果顯示，厚樸排氣合劑治療慢性便秘的主要通路有PI3K/Akt 信號通路、癌癥相關(guān)通路、細(xì)胞衰老等。有研究已證實(shí)衰老的大鼠具有明顯的便秘行為，便秘的大鼠也出現(xiàn)明顯的衰老狀態(tài)，這一變化與癌癥通路直接相關(guān)[33]。隨著我國老齡化社會的發(fā)展，老年人慢性便秘疾病的問題越來越嚴(yán)峻，通過細(xì)胞衰老這一思路或可為防治慢性便秘提供一條新的探索道路。分子對接結(jié)果顯示，厚樸排氣合劑主要活性成分（黃柏酮、木犀草素、大黃酸）與核心靶點(diǎn)（Akt1、TP53、IL-6、CASP3、VEGFA）具有良好的對接活性，證實(shí)了以上網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測結(jié)論的可靠性，其中大黃酸與CASP3、TP53、IL-6 結(jié)合較緊密，木犀草素與CASP3、IL-6結(jié)合較緊密，黃柏酮與CASP3 結(jié)合較緊密，進(jìn)一步表明這些成分及靶點(diǎn)與厚樸排氣合劑治療慢性便秘密切相關(guān)，為后期進(jìn)行分子細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)提供重要的研究方向。

綜上所述，通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)與對子對接結(jié)合的方式，驗(yàn)證了厚樸排氣合劑治療慢性便秘多途徑、多靶點(diǎn)、多通路的機(jī)制，總結(jié)出厚樸排氣合劑可能通過作用于Akt1、TP53、IL-6、CASP3、IL-1B、MAPK3 等多個靶點(diǎn)，調(diào)節(jié)PI3K/Akt 信號通路、細(xì)胞衰老通路、癌癥相關(guān)通路、巨細(xì)胞病毒感染通路等多條通路，通過抑制炎癥反應(yīng)、抗衰老、調(diào)節(jié)平滑肌運(yùn)動等方式治療慢性便秘疾病。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突