謝秀梅,莫延新,周 倩

(青海省畜禽遺傳資源保護(hù)利用中心,青海 西寧 810003)

歐拉羊主要分布在青海省黃南州河南縣和甘肅省瑪曲地區(qū),青海省澤庫縣和久治縣也少有分布。歐拉羊頭稍長,呈銳三角形,鼻梁隆起,公、母羊絕大多數(shù)都有角,角形呈微螺旋狀向左右平伸或略向前,尖端向外。四肢高而端正,背平直,胸、臀部發(fā)育良好,尾呈扁錐形。成年公羊體重75.85kg,成年母羊58.51kg。歐拉羊適應(yīng)性強(qiáng)、抗病力強(qiáng)、耐粗飼而且肉質(zhì)優(yōu)良,素以個體高大、肌肉豐滿、產(chǎn)肉量高而著稱,也是藏系綿羊中產(chǎn)肉性能最好的羊種,是進(jìn)行肉用雜交改良的優(yōu)秀種質(zhì)資源。通過超數(shù)排卵措施收集并冷凍保存胚胎,可以保存該品種的全部基因,避免了由各種原因造成的優(yōu)良基因流失問題,在保護(hù)動物遺傳資源方面發(fā)揮了重要的作用[1]。

1 材料與方法

1.1供體羊

本項目供體羊從河南縣引進(jìn),供體母羊等級為一級以上,供體公羊為特級,均符合品種標(biāo)準(zhǔn),3代以內(nèi)無血緣關(guān)系,系譜清楚,健康、無傳染性疾病和遺傳疾病,有檢疫證明。母羊均為2歲以上,自然繁殖產(chǎn)過1胎。

1.2主要藥品與器械

1.2.1藥品 加拿大產(chǎn)促卵泡素Follitropin FSH,400 mg/支;促黃體素釋放激素A3(促排3號),寧波三生藥業(yè)有限公司生產(chǎn),20 μg/支;氯前列烯醇(PG),上海市計劃生育科學(xué)研究所生產(chǎn),0.2 mg/2 mL·支;黃體酮陰道緩釋劑(CIDR),新西蘭DEC國際有限公司生產(chǎn),1.9 g/支;普魯卡因,北京市永康藥業(yè)有限公司生產(chǎn),40 mg/2 mL·支。

1.2.2器械 體視顯微鏡;羊用二通式?jīng)_卵管;滯留針;集卵杯;恒溫水浴鍋;手術(shù)器械;手術(shù)架等。

1.3超數(shù)排卵方案

用陰道栓CIDR對母羊進(jìn)行同期發(fā)情處理,于第0 d放置陰道栓CIDR并注射維生素ADE 3 mL/只。加拿大產(chǎn)FSH每支為400 mg,將其稀釋為20 mL溶液(20 mg/mL),從第9 d開始,每天上、下午間隔12 h采用逐漸減量的方法進(jìn)行肌肉注射,連續(xù)注射4 d,具體劑量見表1。在注射第6針時同時注射PG 0.2 mg,注射第7針后取出陰道栓。

表1 超數(shù)排卵處理方案

1.4重復(fù)超數(shù)排卵

用陰道栓CIDR對母羊進(jìn)行同期發(fā)情處理,采用逐漸減量的方法肌注FSH進(jìn)行超數(shù)排卵,每次胚胎采集結(jié)束后間隔2個月進(jìn)行重復(fù)超排處理。

1.5輸精或配種

在第12 d注射完成后即對供體母羊進(jìn)行發(fā)情鑒定,待觀察到第1次站立發(fā)情后12 h配種,間隔10～12 h再配一次,連續(xù)配種2～3次。配種時注射促排3號15 μg、維生素ADE 3 mL/只。

1.6胚胎的采集與質(zhì)量鑒定

以發(fā)情之日為第0 d計算,于第7 d采用手術(shù)法回收胚胎。用含1%血清的杜氏磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗母羊兩側(cè)子宮角,每側(cè)用液20～30 mL。子宮回流液靜置3～5 min后在體視顯微鏡下檢出并收集胚胎,置于保存液中。根據(jù)農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《牛、羊胚胎質(zhì)量檢測技術(shù)規(guī)程》對取出的胚胎進(jìn)行分級,為了保證種用需求,凍存B級以上胚胎。

1.7數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 17.0軟件對試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析,結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示,采用單因素方差分析對各組數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性分析。超數(shù)排卵有效而沖卵失敗的個體不計入個體數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1FSH不同劑量效果比較

本次試驗采用加拿大產(chǎn)FSH,設(shè)計216 mg(Ⅰ組)、256 mg(Ⅱ組)、276 mg(Ⅲ組)3個劑量組,分別處理26、24、25只歐拉羊。利用同期發(fā)情和超數(shù)排卵,手術(shù)收集卵子數(shù)和胚胎數(shù)進(jìn)行對比研究。

由表2可知,加拿大產(chǎn)FSH的適宜注射量為256 mg,此劑量下只均黃體數(shù)、只均回收卵數(shù)、卵子回收率、只均有效胚數(shù)和有效胚率分別為7.87個、6.40個、81%、4.87枚和76%,與其他組相比較,綜合效果最佳。

表2 加拿大產(chǎn)FSH不同劑量超數(shù)排卵效果的比較

2.2重復(fù)超數(shù)排卵效果的比較

從試驗羊只中挑選出17只做好標(biāo)記,進(jìn)行重復(fù)超排,每只羊超排3次,每次超排間隔2個月,對不同次數(shù)的超排結(jié)果進(jìn)行對比研究。

由表3可知,對歐拉羊進(jìn)行3次重復(fù)超排后,第2、3次的只均黃體數(shù)極顯著高于第1次(P<0.01);第2次的只均回收卵數(shù)極顯著高于第1次(P<0.01),顯著高于第3次(P<0.05),只均有效胚數(shù)、有效胚率顯著高于第1次和第3次(P<0.05);第1、2次胚胎受精率高于第3次(P>0.05);第3次時子宮粘連率顯著高于第1、2次(P<0.05),說明重復(fù)實施超數(shù)排卵會增加供體母羊子宮粘連的風(fēng)險。

表3 重復(fù)超數(shù)排卵效果的比較

3 小結(jié)

3.1超數(shù)排卵對于機(jī)體來說是一個復(fù)雜的生理過程,超數(shù)排卵處理方法要根據(jù)供體母羊本身激素水平的變化而設(shè)計,品種、個體水平、生長環(huán)境以及選擇的藥物和處理方法均會影響超數(shù)排卵效果,適宜的FSH劑量是超數(shù)排卵取得良好效果的關(guān)鍵因素之一。朱芳賢等[2]報道,蘭州大尾羊獲得A級胚胎平均為5.0枚/次。本試驗只均黃體數(shù)為7.87個,只均有效胚數(shù)為4.87枚,可能與歐拉羊的生長環(huán)境以及飼養(yǎng)管理方式有關(guān),建議在進(jìn)行胚胎冷凍工作前,強(qiáng)化供體羊飼養(yǎng)管理,按照個體水平分組飼養(yǎng)、組群。

3.2劉廣振[3]認(rèn)為較強(qiáng)的激素應(yīng)答反應(yīng)使部分個體優(yōu)勢卵泡排卵過早,黃體功能不全,分泌孕酮水平較低,從而造成胚胎退化。譚景和等[4]、范必勤等[5]也認(rèn)為較強(qiáng)的激素應(yīng)答反應(yīng)使卵巢過度增大、卵泡過度增多,可能造成卵母細(xì)胞質(zhì)量下降,排卵后卵子未能進(jìn)入輸卵管中而是直接掉入腹腔,最終導(dǎo)致卵子回收率低,未受精卵多,可用胚率也很低,A、B級胚胎更少。本試驗中加拿大FSH 276 mg組卵泡發(fā)育多,但回收到的卵子少,尤其

是有效胚胎少,可能是卵子質(zhì)量差,造成受精率低和退化胚胎多。建議實施大規(guī)模超數(shù)排卵前進(jìn)行必要的預(yù)試驗,確定最佳的FSH劑量,避免增加生產(chǎn)成本。

3.3本次試驗超數(shù)排卵間隔時間短,使得供體母羊產(chǎn)生了抗外來促性腺激素的抗體,對激素應(yīng)答反應(yīng)不敏感,同時重復(fù)多次的技術(shù)操作也會增加生殖道受損傷和感染的機(jī)會。此次試驗表明,隨著重復(fù)超排次數(shù)增加,供體母羊的子宮粘連率升高,子宮粘連也可能是造成獲卵數(shù)、有效胚數(shù)、有效胚率及胚胎受精率降低的主要原因之一。此外,技術(shù)人員要加強(qiáng)業(yè)務(wù)訓(xùn)練、提高操作能力,減少對母羊子宮的刺激,避免操作過程中的出血,盡可能做到無菌操作, 可大大提高供體母羊的重復(fù)利用率。