雍素云，史先鵬，周楠，周永春，張雪婷

1.陜西省人民醫(yī)院 藥學部，陜西 西安 710068

2.陜西省人民醫(yī)院 骨科，陜西 西安 710068

3.陜西省人民醫(yī)院 康復醫(yī)學科，陜西 西安 710068

氧化應激參與癌癥發(fā)展的所有階段[1]，活性氧（ROS）在惡性腫瘤前期過程中起著重要的致病作用。一方面，組織中產(chǎn)生的ROS 可以在相對較短的時間內(nèi)被生長因子誘導，如表皮生長因子（EGF）和血小板衍生生長因子（PDGF）；另一方面，炎癥細胞因子，如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）和白細胞介素-1β（IL-1β）的持續(xù)激活，通常需要大量的ROS的產(chǎn)生來支持[2-3]。細胞內(nèi)的ROS 主要由煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）氧化酶（Noxs）產(chǎn)生。Noxs 作為電子供體催化NADPH 產(chǎn)生O2，繼而產(chǎn)生ROS。Noxs 家族有Nox1-5、雙氧化酶1（DUOX1）和DUOX2。Noxs 蛋白本身幾乎沒有催化活性，需要與多種調(diào)節(jié)亞基結合形成穩(wěn)定的復合物才能發(fā)揮催化作用，包括p22Phox、p47Phox（異構體Noxo1）、p67Phox（異構體Noxa1）和p40Phox[4-5]。不同細胞中Noxs 的分布及功能也是不同的[6]。大腸腺瘤性息肉使個體易患結腸腺癌。Nox1 已被證明在高分化結腸腺瘤中過表達[7]。除結直腸癌中Nox1 和DUOX2 的上調(diào)以及胰腺癌中DUOX2 的上調(diào)外，還有大量證據(jù)支持幾種人體實體瘤中Nox4mRNA表達增強，與未受累的鄰近胃組織相比，胃腺癌中Nox1 和Nox4 顯著增加[8]。

歐前胡素屬于呋喃香豆素類化合物，主要來源于白芷、當歸、名黨參、水芹、福參、防風、羌活、蛇床子等，其中在白芷中含量較豐富[9]。研究表明，歐前胡素具有抗炎、抗高血壓、抗過敏及抗腫瘤等作用[10-11]。近年來，關于歐前胡素影響藥物代謝酶活性，影響心血管和神經(jīng)系統(tǒng)等多種藥理作用的研究逐漸增多，針對其藥理作用的研究領域不斷拓寬。因此，歐前胡素具有廣泛的藥理作用以及巨大的新藥開發(fā)潛力。前期研究中，歐前胡素通過降低胞內(nèi)ROS 水平發(fā)揮抗炎、抗高血壓等作用[12]。近期研究報道，歐前胡素可以減少H2O2誘導的HepG2細胞的細胞死亡，并減弱了ROS 的形成，但沒有顯示出細胞毒性，這表明其可能通過ROS 清除活性對H2O2誘導氧化損傷具有細胞保護作用，降低癌細胞的擴展[13]。然而歐前胡素對其他腫瘤細胞胞內(nèi)ROS 及Noxs 不同亞型的影響作用仍不清楚，本研究通過歐前胡素對胃癌及結腸癌細胞的ROS 及Noxs 影響作用，揭示其抗腫瘤作用新機制。

1 材料與方法

1.1 細胞

人胃癌細胞MKN-45購自武漢華爾納生物科技有限公司；人結腸癌細胞HT-29 購自北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術研究院。

1.2 試劑與儀器

歐前胡素（批號HY-N0285，質(zhì)量分數(shù)98%）購自美國MCE 公司；二苯基氯化碘鹽（DPI，批號HY-100965）購自美國MCE 公司；二甲基亞砜（DMSO，批號D8371）購自北京索萊寶科技有限公司；二氫乙錠（DHE，批號S0063）購自碧云天生物技術有限公司；兔多抗Nox1（批號DF8684）購自Affinity Biosciences Pty Ltd.；兔單抗Nox2（批號ab129068）購自Abcam 公司；兔多抗Nox3（批號A3677）購自武漢愛博泰克生物科技有限公司；兔多抗Nox4（批號DF6924）、兔多抗Nox5（批號DF4219）購自Affinity Biosciences Pty Ltd.；HRP 標記羊抗兔二抗（批號BA1055）購自武漢博士德生物工程有限公司。

顯影定影試劑盒購自天津市漢中攝影材料廠；CCK8 細胞增殖及細胞毒性檢測試劑盒購自武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司；DMEM 培養(yǎng)基、1640 培養(yǎng)基、MEM 均購自武漢普諾賽生命科技有限公司；胎牛血清購自依科賽生物科技（太倉）有限公司；氨芐西林購自阿拉丁公司；硫酸鏈霉素購自阿拉丁公司；胰蛋白酶-EDTA 消化液（0.25%）購自武漢普諾賽生命科技有限公司；RIPA 強效組織裂解液購自碧云天生物科技有限公司；BCA 蛋白檢測試劑盒購自碧云天生物科技有限公司；PVDF 膜購自美國Millipore 公司。

細胞培養(yǎng)皿、細胞培養(yǎng)瓶購自美國康寧CORNING 公司；電子天平購自上海博通公司；96孔培養(yǎng)板購自奈斯生物科技有限公司；電泳系統(tǒng)購自美國Bio-Rad 公司；轉(zhuǎn)膜系統(tǒng)購自美國Bio-Rad公司；微量移液器購自ThermoFisher 公司；超凈工作臺購自蘇州集團安泰空氣技術有限公司；低速離心機購自湖南可成儀器設備有限公司；電熱恒溫培養(yǎng)箱購自日本ASONE 公司；FlexStation 3 多功能酶標儀購自Molecular Devices 公司；CO2 恒溫培養(yǎng)箱購自日本SANYO 公司；倒置顯微鏡購自日本Nikon 公司。

1.3 方法

1.3.1 受試物配制 歐前胡素及DPI 用DMSO 配制成50 mg/mL 母液，-20 ℃溫度保存?zhèn)溆?。使用時，用對應培養(yǎng)基稀釋到所需濃度。

1.3.2 細胞處理 MKN-45 及HT-29 細胞置于含10% FBS、100 μg 青霉素-鏈霉素雙抗溶液和高糖DMEM 培養(yǎng)基中，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜，細胞密度達到80%時按1∶3 比例對細胞進行傳代，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3.3 CCK8 法檢測細胞增殖活性 取處于對數(shù)生長期，生長狀態(tài)良好的MKN-45、HT-29 細胞，分為對照組（加入新鮮等體積培養(yǎng)基）及歐前胡素3、10、30、100 μmol/L 組，用0.25%胰蛋白酶溶液消化MKN-45、HT-29 細胞制成單細胞懸液，以5×103個/孔接入96 孔板；另設空白組細胞在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜（在細胞孔周圍孔內(nèi)加入100 μL 無菌PBS）。每種藥物及濃度均設3 個復孔，吸棄各孔培養(yǎng)基，各組細胞依次加入不同濃度歐前胡素培養(yǎng)24 h 后，每孔加入10 μL CCK8，37 ℃培養(yǎng)2 h，酶標儀測定450 nm 波長處的各孔吸光度（A450），實驗重復6 次，計算細胞增殖率。

細胞增殖率＝（A給藥－A空白）/（A對照－A空白）

1.3.4 胞內(nèi)ROS 水平檢測 取培養(yǎng)好的MKN-45、HT-29 細胞分別分為3 組，即對照組（加入新鮮等體積培養(yǎng)基）、歐前胡素組（加入歐前胡素100 μmol/L干預24 h）[14]、陽性對照（DPI）組（加入DPI 0.05 μmol/L 干預24 h）。用1640 完全培養(yǎng)基調(diào)整細胞密度到2.5×105/mL，接入6 孔板，每孔2 mL細胞懸液，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。歐前胡素100 μmol/L 及DPI 0.05 μmol/L 孵育24 h，孵育完畢后，使用PBS 漂洗3 次，加入20 mL DHE熒光探針染料工作液孵育1 h，于熒光顯微鏡下觀察并采集圖像，使用Image Pro-plus 軟件計算每組胞內(nèi)ROS 水平，實驗重復9 次。

1.3.5 Noxs 相關蛋白表達檢測 分組同1.3.4 項下，歐前胡素及DPI 干預24 h 后，棄掉培養(yǎng)液，加入蛋白提取液（PMSF 與RIPA 比例為1︰100）冰上裂解，離心后使用BCA 法提取總蛋白，定量后的樣品上樣，每孔上樣量為20 μL，電泳并轉(zhuǎn)膜后封閉2 h，加入一抗，4 ℃冰箱孵育過夜，一抗抗體分別為GAPDH（1︰1 000）、Nox1（1︰1 000）、Nox2（1︰5 000）、Nox3（1︰1 000）、Nox4（1︰1 000），次日TBST 洗膜3 次后，根據(jù)一抗加入二抗，使用HRP 標記二抗（1︰10 000 稀釋），室溫搖床孵育2 h。使用TBST 洗膜3 次后，將ECL 試劑盒中A 液與B 液按1︰1 比例混勻，將工作液均勻滴加于膜上反應，于凝膠成像儀器下顯色，膠片掃描后，用BandScan 分析膠片灰度值，實驗重復9 次。

1.4 統(tǒng)計學方法

運用Graphpad Prism 9.0 軟件作圖并分析，各組數(shù)據(jù)之間差異采用單因素方差分析（ANOVA）處理，分析結果采用表示。

2 結果

2.1 歐前胡素對MKN-45 及HT-29 細胞增殖活性的影響

如圖1 所示，與對照組比較，歐前胡素組MKN-45 及HT-29 細胞增殖活性均下降，且呈濃度相關性；30、100 μmol/L 歐前胡素可使MKN-45 細胞增殖率呈極顯著性下降（P＜0.001）；10、30、100 μmol/L 歐前胡素可使HT-29 細胞增殖率呈極顯著性下降（P＜0.01、0.001）。

圖1 歐前胡素對MKN-45 及HT-29 細胞增殖活性的抑制作用（，n=6）Fig.1 Imperatorin inhibited the proliferative activity of MKN-45 and HT-29 cells (,n=6)

2.2 歐前胡素對MKN-45 及HT-29 細胞胞內(nèi)ROS水平的影響

如圖2、3 所示，與對照組比較，歐前胡素組MKN-45 及HT-29 細胞胞內(nèi)ROS 水平均顯著下降（P＜0.05），DPI 組也可使MKN-45 及HT-29 細胞ROS 水平顯著下降（P＜0.01、0.001）。

圖2 歐前胡素對MKN-45 和HT-29 細胞胞內(nèi)ROS 熒光染色圖Fig.2 Fluorescence staining images of imperatorin effected on the ROS level of MKN-45 and HT-29 cells

圖3 歐前胡素對MKN-45 及HT-29 細胞胞內(nèi)ROS 水平的抑制作用（，n=9）Fig.3 Imperatorin inhibited the ROS level of MKN-45 and HT-29 cells (,n=9)

2.3 歐前胡素對MKN-45 及HT-29 細胞Noxs 蛋白表達水平的影響

如圖4、5 所示，與對照組比較，歐前胡素組MKN-45 細胞Nox1、Nox2、Nox3、Nox4、Nox5 蛋白表達水平均顯著降低（P＜0.05、0.01、0.001）；歐前胡素組HT-29 細胞Nox1 和Nox2 蛋白表達水平顯著降低（P＜0.05、0.01），但對Nox3、Nox4、Nox5 蛋白表達水平雖有降低趨勢，但無統(tǒng)計意義。

圖4 歐前胡素對MKN-45 細胞Noxs 蛋白表達水平的影響（，n=9）Fig.4 Imperatorin inhibited the Noxs protein expression level of MKN-45 cells (,n=9)

圖5 歐前胡素對HT-29 細胞Noxs 蛋白表達水平的影響（，n=9）Fig.5 Imperatorin inhibited the Noxs protein expression level of HT-29 cells (,n=9)

3 討論

在大多數(shù)細胞和組織中，Nox-依賴性ROS 的產(chǎn)生與生物信號和病理生理功能有關[15]，例如心血管[16-17]、神經(jīng)退行性[18-19]、癌癥[20-21]和代謝性疾病等[22-23]。這是由于氧化應激與癌癥細胞的細胞代謝密切相關。此外，氧化還原平衡的改變和被認為是癌癥的標志，并與惡性進展和藥物治療耐藥性有關。因此，針對ROS 與腫瘤相關聯(lián)的研究將有一定的臨床意義。本研究發(fā)現(xiàn)具有抗腫瘤活性的天然化合物歐前胡素，在抑制胃癌MKN-45 細胞及結腸癌HT-29 細胞的增殖率的同時，可以降低胞內(nèi)的ROS水平，這說明其抗腫瘤作用可能與ROS 相關。

代謝和微環(huán)境相關改變產(chǎn)生的高活性氧水平有助于調(diào)節(jié)癌癥細胞代謝[24]，而Noxs 酶在這一過程中起著關鍵作用。基于通用抗氧化分子在人體試驗中的應用的治療方法引起了人們的廣泛關注，但仍缺乏選擇性靶向氧化途徑的特定藥理學策略[25]。因此，由于Nox 同源物主要由增強的表達和/或激活機制調(diào)節(jié)，因此調(diào)節(jié)Nox 表達及其活性被認為是新的有前途的治療方法。一些Nox 成員在不同的癌癥模型中被發(fā)現(xiàn)失調(diào)，其中Nox1、Nox2、Nox4 是表達最頻繁的成員。

Nox1 亞型在多種組織中表達[26]，但在結腸、前列腺和血管細胞中占主導地位[27]，其表達可由多種條件誘導。然而，Nox1 的異常激活和/或表達通過細胞代謝的放松調(diào)節(jié)參與了越來越多的疾病，包括動脈粥樣硬化、高血壓、炎癥和癌癥[26]。Nox1 在一些腫瘤中上調(diào)，并作為癌基因發(fā)揮作用[28-29]。這種上調(diào)對糖酵解升高至關重要，并在線粒體功能障礙的癌癥細胞中提供額外的NAD+[29-31]。在因致癌Ras激活或p53 缺失而導致線粒體功能受損的癌癥細胞和原發(fā)性胰腺癌組織中也觀察到Nox1 上調(diào)。Nox1功能的阻斷選擇性地損害具有線粒體功能障礙的癌癥細胞，導致細胞糖酵解減少，細胞活力喪失，并抑制體內(nèi)癌癥生長，這表明Nox1 是癌癥治療的潛在新靶點[28]。Nox2 衍生的ROS 產(chǎn)生增強是氧化微環(huán)境的原因，該微環(huán)境對腫瘤發(fā)生、腫瘤進展、細胞增殖[32]和細胞代謝[33]產(chǎn)生深刻影響。Nox2 依賴的ROS 生成誘導低氧誘導因子1α（HIF1α）的激活，從而刺激HIF 相關的癌癥事件[32]。迄今為止，已觀察到Nox4 參與多種惡性腫瘤，包括肺癌、腎細胞癌癥、結直腸癌、胃癌。Nox4 衍生的ROS 在幾種組織和細胞類型的不同病理生理過程中控制與細胞增殖、遷移、存活、轉(zhuǎn)化、細胞代謝和代謝重編程有關的各種細胞過程。與Nox2 類似，Nox4衍生的ROS 參與HIFα 的激活。在膠質(zhì)母細胞瘤中，異常的Nox4 依賴性ROS 生成通過介導HIF1α穩(wěn)定來影響叉頭框蛋白M1（FOXM1）的調(diào)節(jié)。轉(zhuǎn)化生長因子β1（TGF-β1）介導Nox4 上調(diào)，進而促進ROS 的產(chǎn)生、生長、存活、缺氧和膠質(zhì)母細胞瘤的血管生成。在人神經(jīng)母細胞瘤SHSY5Y 細胞中也觀察到Nox4 依賴性HIFα 的穩(wěn)定，其中Nox4 的表達在缺氧條件下上調(diào)。在Nox4 敲除的癌癥細胞中，HIF1α 靶向基因（如編碼葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白的SLC2A1）的表達被阻止，從而支持Nox4 介導的代謝重編程的相關作用[34]。

在人類的淋巴組織、睪丸和血管中已經(jīng)檢測到Nox5 的表達[35]。研究表明，Nox5 有助于血管和腎臟病理[36]。最近的一項研究表明，Nox5 在兔中對動脈粥樣硬化具有潛在的保護作用[37]。Nox3 分布在內(nèi)耳中，它對耳蝸的形成至關重要，前庭中的碳酸鈣晶體負責檢測線性加速度、重力和聽覺[38]。此外，DUOX1 和DUOX2 在甲狀腺中表達，對甲狀腺激素合成至關重要[39]。但考慮到安全性和效益，應該盡量避免對DUOX1 和DUOX2 的藥理抑制，以避免甲狀腺功能減退和腸炎癥[40]。因此，本研究深入探索了歐前胡素對2 種癌細胞MKN-45 及HT-29 的不同Noxs 亞型的影響。

本研究中，歐前胡素可以降低MKN-45 細胞中5 種Noxs，但是對不同Noxs 的抑制程度稍有不同，其中對Nox1 的抑制作用最強（P＜0.001），對Nox2及Nox4 的抑制作用強于對Nox3 及Nox5 的作用。在HT-29 細胞中，歐前胡素可以明顯降低Nox1 及Nox2 蛋白表達水平（P＜0.05、0.01），對Nox3、Nox4、Nox5 蛋白表達水平有降低趨勢，但無統(tǒng)計學意義。這說明歐前胡素對不同Noxs 的影響存在差異性，可能對Nox1 及Nox2 的作用相對較強，與其抗腫瘤作用存在相關性。

綜上所述，歐前胡素抗腫瘤作用可能與阻斷Noxs-ROS 信號通路有關，新作用機制的發(fā)現(xiàn)為抗腫瘤提供了新的治療思路。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突