何明欣,周向東,楊雅樓,徐立,張華,李琪

氣道黏液高分泌是慢性氣道炎性疾病的重要病理特征,長期的黏液高分泌易造成病原菌定植,進(jìn)而引起持續(xù)性的感染和難以緩解的氣道阻塞,從而嚴(yán)重影響患者的預(yù)后。氣道黏蛋白 (mucin, MUC) 5AC是氣道黏液最具代表的病理性表達(dá)產(chǎn)物,在各種炎性介質(zhì)、致病菌產(chǎn)物、蛋白酶及冷空氣等始動(dòng)因素刺激下易導(dǎo)致其過度表達(dá)[1-2]。然而在眾多促黏液因子中,目前已知中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶 (neutrophil elastase, NE) 對(duì)病理性黏蛋白分泌的促進(jìn)作用最強(qiáng),極易促成黏液栓的形成[3-4]。氣道慢性炎性狀態(tài)下,MUC5AC的合成儲(chǔ)備量已較正常時(shí)明顯增加,而當(dāng)氣道炎性反應(yīng)急性發(fā)生時(shí),胞漿中的黏蛋白儲(chǔ)存量無法在短時(shí)間內(nèi)進(jìn)一步增多,因此,急性發(fā)作時(shí)出現(xiàn)氣道黏液大量分泌的現(xiàn)象勢(shì)必與胞內(nèi)某種強(qiáng)有力的極性誘導(dǎo)因素導(dǎo)致黏蛋白出胞增多有關(guān)[5-6]。已有研究表明,Rho作為一種小分子G蛋白,在蛋白囊泡出胞過程中起著至關(guān)重要的作用,其亞型細(xì)胞分裂周期蛋白 (cell division cycle,Cdc) 42在細(xì)胞信號(hào)通路中具有分子開關(guān)的功能,參與細(xì)胞的黏附、遷移與極化,是蛋白出胞領(lǐng)域中研究最為廣泛的小分子G蛋白之一[7-8]。目前,Cdc42在癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移領(lǐng)域的研究較多,有關(guān)氣道黏液高分泌的研究甚少,故本實(shí)驗(yàn)以NE作為黏液高分泌刺激因子構(gòu)建體外細(xì)胞模型,采用siRNA干擾技術(shù)探究Cdc42與氣道黏蛋白高分泌的關(guān)系及其可能的介導(dǎo)作用,報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 (1)細(xì)胞、試劑:人支氣管氣道上皮細(xì)胞(16HBE) (ATCC,美國)、DMEM培養(yǎng)液、HEPES、Trizol、胎牛血清 (FBS)、HNE、抗GAPDH單克隆抗體(Sigma,美國)、Cdc42 siRNA及陰性對(duì)照(Santa Cruz,美國)、兔抗Cdc42蛋白抗體(博奧森,北京)、小鼠抗MUC5AC單克隆抗體,HRP-羊抗兔抗體(Santa Cruz,美國)、HRP-羊抗鼠抗體(Sigma,美國)BAC蛋白濃度測(cè)定試劑盒(碧云天,上海)、人MUC5AC ELISA試劑盒(凡科維)、LipofectamineTM2000試劑(Invitrogen,中國)。(2)儀器:SynergyHTX型多功能酶標(biāo)儀(Bio-TeK,美國),LightCycler 480 Ⅱ型熒光定量PCR儀(Roche,瑞士),ABLX5全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光圖像分析系統(tǒng)(Tanon,中國)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及分組 將16HBE細(xì)胞培養(yǎng)于含10%的胎牛血清和雙抗(100 U/ml青霉素、100 μg/ml鏈霉素)的DMEM培養(yǎng)基中,置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)孵育,常規(guī)換液培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞貼壁達(dá)80%～90% 時(shí)將其傳代至6孔板內(nèi),細(xì)胞數(shù)量為 (2～5)×105/孔,分為6組。(1)對(duì)照組:無FBS和雙抗的基礎(chǔ)DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞;(2)NE組:無FBS培養(yǎng)基中加入NE 25 nmol/L;(3)NE + Cdc42 siRNA組:細(xì)胞Cdc42 siRNA 5 μmol/L預(yù)處理30 min后加入25 nmol/L NE;(4)NE+陰性siRNA組:以陰性siRNA轉(zhuǎn)染后加入NE 25 nmol/L;(5)Cdc42 siRNA組:無FBS培養(yǎng)基中加入Cdc42 siRNA 5 μmol/L預(yù)處理;(6)陰性siRNA組:以陰性siRNA轉(zhuǎn)染后,無FBS培養(yǎng)基培養(yǎng)。每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,實(shí)驗(yàn)重復(fù)5次。

1.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 將處于對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞調(diào)整濃度至(1～2)×105/L,加入無雙抗的培養(yǎng)基孵育12～24 h,當(dāng)細(xì)胞融合達(dá)70%～80%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染,按轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM2000說明書的實(shí)驗(yàn)步驟將Cdc42 siRNA及陰性對(duì)照轉(zhuǎn)染入16HBE細(xì)胞中,以陰性siRNA為陰性對(duì)照,轉(zhuǎn)染后24～48 h進(jìn)行細(xì)胞處理及相關(guān)檢測(cè)。

1.4 Western印跡檢測(cè)Cdc42蛋白含量 將細(xì)胞置于冰上,每孔加入100 μl的RIPA強(qiáng)裂解液(含PMSF∶RIPA=1 μl∶100 μl)裂解5 min,轉(zhuǎn)移至提前預(yù)冷的EP管中勻速搖15 min,使細(xì)胞充分裂解。4℃條件下14 000 r/min離心15 min,用BCA蛋白分析試劑盒測(cè)定上清液總蛋白并調(diào)平。選擇10% SDS-PAGE分離膠和5%濃縮膠,電泳跑膠,濕轉(zhuǎn)至PVDF (0.45 μm) 膜上。轉(zhuǎn)膜后把膜放入QuickBlock Western封閉液中低速振蕩封閉15 min。棄掉封閉液加入兔抗Cdc42蛋白一抗(1∶500) 勻速搖床30 min后放4℃搖床過夜。次日用1×TBST洗膜3次加入HRP標(biāo)記的二抗(1∶1 000)室溫下?lián)u床1 h,再次洗膜后用濾紙吸取多余水份,滴加ECL化學(xué)發(fā)光底物,放置1～3 min。使用凝膠成像儀對(duì)膜進(jìn)行曝光和顯影,并用Image J軟件分析結(jié)果。GAPDH作為內(nèi)參蛋白,實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5 ELISA法測(cè)MUC5AC蛋白水平 采用雙抗夾心ELISA法檢測(cè)樣品中MUC5AC靶蛋白濃度。取6組已經(jīng)過處理的細(xì)胞培養(yǎng)液,離心20 min后收集上清液。設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔、樣本孔,標(biāo)準(zhǔn)品孔各加入不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品50 μl,樣本孔內(nèi)加入待測(cè)樣品50 μl(10 μl樣品+40 μl樣品稀釋液),每孔加入酶標(biāo)試劑100 μl(空白孔不加樣品及酶標(biāo)試劑),用封板膜封住反應(yīng)孔置37℃孵育60 min。隨后PBS洗板5次,拍干,每孔加入顯色劑避光15 min。加終止液50 μl,測(cè)各孔A值(λ=450 nm),測(cè)量結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)品比值計(jì)算黏蛋白MUC5AC的相對(duì)值。

1.6 免疫熒光檢測(cè)各組細(xì)胞MUC5AC蛋白表達(dá) 將貼壁生長良好的細(xì)胞消化后接種于35 mm玻底共聚焦培養(yǎng)皿中,細(xì)胞密度為1×105/ml,分別對(duì)各種細(xì)胞進(jìn)行加藥刺激。處理結(jié)束后PBS洗滌3次,每次3～5 min,隨后使用4%多聚醛室溫下固定30 min;PBS洗滌3次,0.1 Triton X-100室溫下通透20 min,PBS洗滌3次,5%山羊血清室溫封閉30 min,滴加MUC5AC蛋白一抗 (1∶300) 后置于4℃濕盒過夜;次日PBS洗3次,避光滴加羊抗鼠熒光二抗 (1∶500) 室溫放置30 min;PBS洗滌3次,避光滴加DAPI染色液5 min;PBS洗3遍,滴加防淬滅劑。共聚焦激光掃描生物顯微鏡下觀察并拍片,采用Image Pro Plus 軟件分析細(xì)胞相對(duì)熒光強(qiáng)度。

2 結(jié) 果

2.1 各組細(xì)胞內(nèi)Cdc42蛋白表達(dá)水平比較 Cdc42 siRNA組的Cdc42蛋白表達(dá)量相較于對(duì)照組和陰性siRNA組顯著降低 (P<0.05),表明轉(zhuǎn)染成功。與對(duì)照組相比,NE組以及NE+陰性siRNA組的Cdc42表達(dá)量有明顯升高 (P<0.001),顯示NE可刺激Cdc42蛋白的表達(dá);NE+Cdc42 siRNA組相對(duì)于NE組其Cdc42蛋白表達(dá)有明顯的下降 (P<0.001);對(duì)照組與NE+Cdc42 siRNA組以及陰性siRNA組的Cdc42蛋白表達(dá)無明顯差異(P>0.05),見圖1。

注:與對(duì)照組比較,aP<0.001;與NE組比較,bP<0.001。圖1 各組細(xì)胞內(nèi)Cdc42蛋白的表達(dá)水平比較Fig.1 Comparison of the expression levels of Cdc42 protein in each group of cells

2.2 各組細(xì)胞分泌至上清液中的MUC5AC蛋白水平比較 與對(duì)照組相比,NE組以及NE+陰性siRNA組MUC5AC蛋白分泌水平明顯上升(P<0.001);而NE+Cdc42 siRNA組MUC5AC蛋白分泌水平與對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.400),但與NE組以及NE+陰性siRNA組相比MUC5AC蛋白水平明顯下降(P<0.001);對(duì)照組與陰性siRNA組比較MUC5AC蛋白水平無明顯差異(P=0.450),見圖2。

注:與對(duì)照組比較,aP<0.001;與NE組比較,bP<0.001。圖2 各組細(xì)胞培養(yǎng)上清中MUC5AC蛋白水平比較Fig.2 Comparison of MUC5AC protein levels in cell culture supernatant of each group

2.3 各組細(xì)胞中MUC5AC蛋白水平比較 免疫熒光結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比, NE組和NE+陰性siRNA組的MUC5AC表達(dá)明顯增高 (P<0.001);NE+Cdc42 siRNA組MUC5AC蛋白分泌與對(duì)照組相比差異無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),而與NE組以及NE+陰性siRNA組相比MUC5AC蛋白表達(dá)水平明顯下調(diào)(P<0.05);對(duì)照組與陰性siRNA組比較MUC5AC蛋白水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),見圖3。

注:綠色熒光表示MUC5AC蛋白,藍(lán)色熒光表示細(xì)胞核。圖3 各組細(xì)胞中MUC5AC蛋白的表達(dá)水平比較Fig.3 Comparison of the expression levels of MUC5AC protein in each group of cells

3 討 論

正常分泌的氣道黏液能抵御部分外來的致病因子和刺激因子,起到保護(hù)氣道、濕潤空氣等作用。但各種致病因子長期反復(fù)作用于氣道黏膜時(shí),會(huì)引起黏膜下腺體過度增生及杯狀細(xì)胞過度化生,從而產(chǎn)生大量的黏稠黏液,表現(xiàn)為氣道黏液高分泌。該狀態(tài)是諸多慢性氣道炎性疾病如哮喘、慢性支氣管炎等最早出現(xiàn)也是最常伴隨的癥狀之一[9]。此類疾病除了黏液分泌過多以外其纖毛清除功能也呈不同程度的下降,導(dǎo)致病理性的黏液無法隨纖毛擺動(dòng)而順勢(shì)排出,常隨潴留時(shí)間的延長而形成黏液栓,有利于氣道細(xì)菌的生存與繁殖,如此周而復(fù)始誘導(dǎo)氣道黏液高分泌現(xiàn)象的進(jìn)一步惡化,最終嚴(yán)重影響患者的治療和預(yù)后[10-11]。

NE作為絲氨酸蛋白酶超家族成員,由中性粒細(xì)胞生成,是目前病理性黏蛋白高分泌過程中已知的最強(qiáng)刺激因子,破壞性極強(qiáng),可誘導(dǎo)氣道重塑引發(fā)肺纖維化等[12-13]?，F(xiàn)已證實(shí)諸多促進(jìn)黏蛋白生成的因素同時(shí)也會(huì)促進(jìn)其分泌至胞外,而Rho蛋白是調(diào)控囊泡出胞的蛋白之一,其作為GTPase的Ras超家族成員,廣泛存在于真核細(xì)胞中膜相關(guān)的細(xì)胞器內(nèi),當(dāng)它與GTP結(jié)合時(shí)處于活性狀態(tài) (Rho-GTPase),與GDP結(jié)合時(shí)處于失活狀態(tài),該機(jī)制使其可通過類似分子開關(guān)的作用調(diào)控蛋白囊泡的出胞過程[14]。而Rho蛋白又包含諸多亞型,如Rac、Cdc42、Rif等,其中Cdc42蛋白亞型是細(xì)胞極性建立過程中的關(guān)鍵因子,起初隨機(jī)分布在細(xì)胞內(nèi),被激活后就會(huì)富集到細(xì)胞膜上,然后啟動(dòng)一系列下游生物過程,輔助相關(guān)蛋白囊泡的出胞運(yùn)動(dòng)[15]。因此,氣道炎性反應(yīng)急性發(fā)作時(shí)出現(xiàn)的黏液分泌大量增多,很可能與胞內(nèi)有極強(qiáng)的介導(dǎo)因素促使黏蛋白出胞相關(guān)[16-17],故而Cdc42蛋白在黏液高分泌中的作用值得進(jìn)一步詳細(xì)研究。

本實(shí)驗(yàn)以NE作為刺激因子,構(gòu)建黏液高分泌的體外細(xì)胞模型,分別對(duì)轉(zhuǎn)染前和轉(zhuǎn)染后的16HBE細(xì)胞進(jìn)行刺激。結(jié)果發(fā)現(xiàn),16HBE在NE刺激后其細(xì)胞外MUC5AC以及細(xì)胞內(nèi)的Cdc42蛋白水平表達(dá)明顯增加;而轉(zhuǎn)染Cdc42 siRNA后,再用NE刺激,胞內(nèi)Cdc42蛋白水平分泌量相較對(duì)照組沒有明顯升高,相較于NE組卻出現(xiàn)了明顯的下降,同時(shí)上清液中的MUC5AC與之結(jié)果相一致。由此可見,NE這些促黏液因子會(huì)通過刺激Cdc42蛋白的表達(dá),進(jìn)而促進(jìn)MUC5AC的分泌和出胞,反之亦然。因此推測(cè)抑制Cdc42蛋白很可能成為控制慢性氣道炎性疾病的病理性黏液高分泌的又一重要靶點(diǎn)。

綜上所述,Cdc42蛋白是NE刺激下氣道MUC5AC蛋白高分泌的重要上游信號(hào)分子。但Cdc42如何促進(jìn)MUC5AC出胞的具體膜介導(dǎo)機(jī)制還尚不十分清楚,未來需要更多的體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)來進(jìn)一步闡明Cdc42在黏液高分泌中的確切機(jī)制。

利益沖突:所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻(xiàn)聲明

何明欣:設(shè)計(jì)研究方案,實(shí)施研究過程,論文撰寫;周向東、李琪、張華:提出研究思路,分析試驗(yàn)數(shù)據(jù),論文審核;徐立:實(shí)施研究過程,資料搜集整理,論文修改;楊雅樓:進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析