耿麗華 史越 宮國義 宋順華

摘? ? 要：針對(duì)以南瓜為嫁接砧木的一種西瓜、甜瓜枯萎病，采用形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)方法鑒定了病原菌，并開展該病原菌的致病性試驗(yàn)，為該病害的有效防控提供依據(jù)。結(jié)果表明，該枯萎病病原菌為瓜亡革菌Thanatephorus cucumeris （Frank） Donk。人工接種該病原菌后，供試的13個(gè)蔬菜種類（西瓜、南瓜、西葫蘆、甜瓜、黃瓜、茄子、番茄、辣椒、蘿卜、甘藍(lán)、油菜、花椰菜和白菜）共計(jì)31個(gè)品種都能感病，品種的平均發(fā)病率為24.4%～100.0%。其中，供試的南瓜和西葫蘆對(duì)病原菌最為敏感，供試品種發(fā)病率均為100%，辣椒較為抗病，供試的2個(gè)品種平均發(fā)病率為29.5%。研究確定了引起以南瓜為嫁接砧木的西瓜、甜瓜枯萎的病原菌為瓜亡革菌，參加試驗(yàn)的13個(gè)蔬菜種類普遍感病。不同種類蔬菜之間以及同一種蔬菜的不同品種之間存在抗感差異。

關(guān)鍵詞：西瓜、甜瓜；枯萎??；病原菌；瓜亡革菌；致病性

中圖分類號(hào)：S432.4+4 ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1673-2871（2023）09-016-06

Identification of watermelon and melon wilt disease caused by Thanatephorus cucumeris and its pathogenicity to vegetables

GENG Lihua， SHI Yue， GONG Guoyi， SONG Shunhua

（Key Laboratory of Biology and Genetic Improvement of Horticultural Crops of North China Area， Ministry of Agriculture and Rural Affairs/Key Laboratory of Urban Agriculture（North）， Ministry of Agriculture and Rural Affairs/Vegetable Research Institute， Beijing Academy of Agricultural and Forestry Sciences， Beijing 100097， China）

Abstract： The pathogen of wilt disease in watermelon and melon grafting pumpkin stocks was identified according to the morphological and molecular characteristics， and its pathogenicity to vegetables was tested ， aiming to control the disease effectively. The results showed that the pathogen is Thanatephorus cucumeris （Frank）Donk. by inoculating this pathogen on various vegetables， the pathogenic range test showed that a total of 31 vegetables varieties （13 species：watermelon， pumpkin， squash， melon， cucumber， eggplant， tomato， hot pepper， radish， cabbage， rape， cauliflower and Chinese cabbage） were susceptible? to the pathogen， incidence rate of varieties was between 24.4%-100.0%， among which pumpkin and zucchini plants were the most susceptible， the incidence rate of the tested varieties was 100.0%. Pepper plants were less susceptible to the pathogen， the average incidence rate of the 2 tested varieties was 29.5%. In conclusion， Thanatephorus cucumeris was identified as pathogen of watermelon and melon wilt grafting pumpkin stocks in this study. The 13 vegetable species in this experiment were generally susceptible. There were differences in disease resistance among different vegetable species and different varieties of the same vegetable.

Key words： Watermelon and Melon; Wilt disease; Pathogen; Thanatephorus cucumeris; Pathogenicity

西瓜、甜瓜是夏季的主要水果，我國是全球西瓜、甜瓜最大的生產(chǎn)和消費(fèi)國，隨著產(chǎn)業(yè)的規(guī)?；驮O(shè)施化，西瓜、甜瓜種植的連作障礙問題日趨嚴(yán)重，土傳病害是其中的主要問題之一。

由土壤習(xí)居菌引起的西瓜、甜瓜根部病害在世界范圍內(nèi)普遍發(fā)生，導(dǎo)致幼苗猝倒、根部腐爛和植株萎蔫。據(jù)報(bào)道，國內(nèi)能引起西瓜、甜瓜幼苗根腐、成株枯萎的病原菌有10多個(gè)屬[1]，常見的有腐霉菌（Pythium spp.）、疫霉菌（Phytophthora spp.）、枝頂孢菌（Acremonium cucurbitacearum）和尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）等[2-4]，國外也報(bào)道了很多病原真菌可導(dǎo)致瓜類根腐和枯萎病害，其優(yōu)勢(shì)致病菌為絲核菌（Rhizoctonia spp.）、鐮刀菌（Fusarium spp.）、管釋單孢囊菌（Monosporascus cannonballus）、枝頂孢菌（Acremonium cucurbitacearum）、煙草苷菌（Plectosporium tabacinum）及根盤菌（Rhizopycnis vagum）等[5-8]。除此之外，與西瓜、甜瓜根腐和萎蔫病害相關(guān)的病原菌還有馬鈴薯殼孢屬菌（Pyrenochaeta lycopersici）、菜豆殼球孢菌（Macrophomina phaseolina）和大麗輪枝菌（Verticillium dahliae）[5， 9]。

引起瓜類枯萎病的病原菌較多，其中以尖孢鐮刀菌最為突出，曾在我國西瓜生產(chǎn)中的發(fā)生面積約占總栽培面積的42%[10]，是一種世界性的毀滅性土傳病害，成為導(dǎo)致全球西瓜產(chǎn)量和品質(zhì)降低的嚴(yán)重障礙之一[11]。嫁接栽培可有效地防治尖孢鐮刀菌引起的瓜類枯萎病。日本早在20世紀(jì)80年代即選育出抗尖孢鐮刀菌南瓜?；虵. oxysporum f. sp. lagenariae的南瓜品種Renshi，作為砧木并廣泛應(yīng)用[12]，我國在80年代末應(yīng)用嫁接技術(shù)防治西瓜枯萎病，在生產(chǎn)中也得到了廣泛應(yīng)用，南瓜是最常用的砧木之一[10]。采用南瓜嫁接栽培是防控西瓜、甜瓜枯萎病十分有效的措施之一。

近幾年來，筆者在工作中時(shí)常遇到西瓜、甜瓜種植者反映，采用南瓜砧木嫁接的西瓜、甜瓜發(fā)生枯萎病，并對(duì)南瓜砧木的抗病性產(chǎn)生疑問。發(fā)生該病的西瓜、甜瓜往往苗期生長(zhǎng)正常，而在初果期或果實(shí)膨大期植株發(fā)生枯萎，雖然在生產(chǎn)上沒有普遍發(fā)生，但是發(fā)生嚴(yán)重的棚室發(fā)病率可達(dá)100%，植株在果實(shí)尚未成熟之前發(fā)生枯萎，造成絕收。為了弄清楚病害發(fā)生的原因，筆者采集了典型的發(fā)病植株，進(jìn)行病原分離和鑒定，以便為今后生產(chǎn)上預(yù)防和控制該病害提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

具有典型發(fā)病癥狀的西瓜和甜瓜植株于2019年5月采自大興春茬西瓜、甜瓜種植大棚。

試驗(yàn)選用京研益農(nóng)（北京）種業(yè)科技有限公司提供的13個(gè)蔬菜種類，共計(jì)31個(gè)品種進(jìn)行致病性測(cè)定，品種名稱見表1。

真菌基因組DNA快速抽提試劑盒，購買于北京新時(shí)代眾合科技有限公司；其他無機(jī)試劑均為國產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）：馬鈴薯200 g、瓊脂17 g、葡萄糖20 g、蒸餾水1000 mL，于120 ℃高壓滅菌20 min。

1.2 方法

1.2.1 病原菌的分離純化 從典型發(fā)病植株根莖的病健交接處切取小塊組織，放到75%乙醇中浸泡2 s，使用滅菌水清洗3次，然后用滅菌濾紙吸干水分，置于PDA平板培養(yǎng)基上，在25 ℃恒溫條件下暗培養(yǎng)，長(zhǎng)出菌絲后，進(jìn)行分離和純化。

1.2.2 分離物致病性測(cè)定 分離物的培養(yǎng)：將分離物接種到PDA平板培養(yǎng)基上，在25 ℃條件下暗培養(yǎng)5 d，用打孔器從菌落邊緣打取直徑為7 mm的菌絲塊供試驗(yàn)使用。

接種方法：試驗(yàn)在北京市農(nóng)林科學(xué)院蔬菜研究所的抗病溫室中進(jìn)行。取直徑為90 mm的小育苗盒，在最底層鋪1/3育苗盒高度的滅菌培養(yǎng)基質(zhì)，第2層放置5個(gè)病原菌菌絲塊，第3層覆蓋1/3育苗盒高度的滅菌培養(yǎng)基質(zhì)，第4層播4粒西瓜（京穎）或甜瓜（京玉5號(hào)）種子，第5層覆蓋1/3育苗盒高度的滅菌培養(yǎng)基質(zhì)，以接種5個(gè)直徑為7 mm的空白PDA培養(yǎng)基塊作為對(duì)照（CK），每處理3個(gè)育苗盒。每天檢查出苗及幼苗發(fā)病情況，直到播種后15 d。以地上部出現(xiàn)萎蔫、幼苗死亡、莖基部出現(xiàn)褐變開裂或根系變色為發(fā)病標(biāo)準(zhǔn)。

1.2.3 病原菌的鑒定 形態(tài)學(xué)鑒定：將病原菌接種在PDA培養(yǎng)基上，25 ℃恒溫暗培養(yǎng)，觀察菌落形態(tài)特征。根據(jù)相關(guān)資料進(jìn)行菌種的鑒定[13]，確定病原物種類。

分子生物學(xué)鑒定：將病原菌接種在PDA培養(yǎng)基上，25 ℃恒溫暗培養(yǎng)5 d，收集菌絲體，加液氮研磨成粉末，用真菌試劑盒提取其DNA；用真菌通用引物ITS1/ITS4進(jìn)行該病原菌rDNA核糖體內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)的PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增片段由北京新時(shí)代眾合科技有限公司進(jìn)行測(cè)序，將得到的序列在NCBI中檢索，下載同源序列，使用MEGA7軟件用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，用自舉法對(duì)發(fā)育樹進(jìn)行1000次重復(fù)檢驗(yàn)。

1.2.4 病原菌的致病范圍測(cè)定 供試品種見表1。

病原菌的培養(yǎng)和接種方法同1.2.2。葫蘆科和茄科蔬菜每育苗盒播種4粒種子，十字花科蔬菜每育苗盒播種6粒種子，每處理3個(gè)育苗盒，重復(fù)3次，隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)。每天檢查出苗及幼苗發(fā)病情況，觀察至播種后15 d時(shí)，將未病死的幼苗小心拔出，沖洗干凈，檢查根部的發(fā)病情況，計(jì)算幼苗的發(fā)病率，幼苗的發(fā)病率/%=發(fā)病幼苗數(shù)量/幼苗總數(shù)量×100。所有供試品種的發(fā)病率取播種后15 d的平均觀察值。

2 結(jié)果與分析

2.1 癥狀觀察

甜瓜植株的發(fā)病癥狀為莖基部產(chǎn)生黃褐色水漬狀凹陷斑，后期顏色變深（圖1-A），有的擴(kuò)展至環(huán)莖一周，呈蜂腰狀縊縮（圖1-B），拔出病株可見病原菌主要侵染根尖及根莖部的皮層（圖1-C）；發(fā)病嚴(yán)重的全株枯萎（圖1-D）。西瓜植株的發(fā)病癥狀與甜瓜類似。

2.2 分離物致病性測(cè)定

通過病原菌分離培養(yǎng)，從甜瓜根部與莖基部獲得分離物JLFT1-150428-1，從西瓜根部與莖基部獲得分離物JLFX-150428-2，對(duì)2個(gè)分離物分別進(jìn)行致病性試驗(yàn)，均能使寄主發(fā)病，且癥狀與田間發(fā)病癥狀相同，對(duì)照處理的幼苗生長(zhǎng)正常，沒有出現(xiàn)任何發(fā)病癥狀（圖2）。分別從接種發(fā)病的寄主上分離病原菌，獲得的分離物分別與JLFT1-150428-1和JLFX-150428-2形態(tài)相同，表明JLFT1-150428-1和JLFX-150428-2均為病原菌。

2.3 病原菌鑒定

2.3.1 形態(tài)學(xué)特征 在25 ℃黑暗條件下培養(yǎng)，2個(gè)病原菌在PDA培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)相同，初期無色至乳白色，呈放射狀擴(kuò)展（圖3-A～B），隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加，菌落顏色逐漸變深至淺黃，老熟菌絲黃褐色，后期可形成菌核（圖3-C）；顯微鏡觀察結(jié)果表明，其菌絲分枝與主枝近于直角，且在分枝基部有明顯縊縮，在分枝不遠(yuǎn)處有一個(gè)隔膜，與主枝分隔開（圖3-D）。

2.3.2 分子生物學(xué)鑒定 分別提取2個(gè)病原菌菌株的DNA，對(duì)rDNA-ITS序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得大小分別為642和650 bp的2個(gè)片段。將這2個(gè)片段的序列分別提交至NCBI，進(jìn)行同源序列檢索，結(jié)果都與JF699278（Thanatephorus cucumeris）的序列同源性最高，均為100%。

基于2個(gè)病原菌菌株JLFT1-150428-1和JLFX-150428-2的rDNA-ITS序列與NCBI中的相關(guān)序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖4），這2個(gè)病原菌均與JF699278聚在一起，因此，這2個(gè)病原菌相同，為瓜亡革菌Thanatephorus cucumeris （Frank） Donk。

綜合形態(tài)學(xué)特征和分子生物學(xué)鑒定結(jié)果，表明引起該病害的病原菌有性態(tài)為Thanatephorus cucumeris （Frank） Donk，屬于擔(dān)子菌亞門瓜亡革菌屬瓜亡革菌；無性態(tài)為半知菌亞門絲核菌屬立枯絲核菌（Rhizoctonia solani Kühn）。

2.4 病原菌致病性測(cè)定

病原菌致病性試驗(yàn)結(jié)果表明，該病原菌可侵染供試的13個(gè)種類共計(jì)31個(gè)蔬菜品種（表2）。人工接種后，供試的蔬菜品種全部感染病原菌，31個(gè)品種的平均發(fā)病率為24.4%～100.0%。其中，南瓜和西葫蘆對(duì)病原菌最敏感，供試品種的發(fā)病率均為100.0%；辣椒較為抗病，供試的2個(gè)品種發(fā)病率分別為24.4%和34.5%；供試的3個(gè)黃瓜品種的發(fā)病率為44.4%～94.4%；供試的3個(gè)蘿卜品種的發(fā)病率為33.4%～71.8%；供試的3個(gè)白菜品種的發(fā)病率為50.0%～97.1%。由此可見，同種作物的不同供試品種之間發(fā)病率不盡相同，甚至存在較大差異。

3 討論與結(jié)論

通過病原菌的形態(tài)學(xué)特征觀察，結(jié)合分子生物學(xué)鑒定，筆者的研究結(jié)果表明，近年來在南瓜砧木嫁接的西瓜、甜瓜上所發(fā)生的一種枯萎病，其病原菌為瓜亡革菌。瓜亡革菌侵染西瓜、甜瓜的根尖及根莖部的皮層，造成根腐，進(jìn)而使植株萎蔫。目前已知有10余個(gè)病原菌能引起西瓜、甜瓜成株枯萎，最常見的是尖孢鐮刀菌[10]。而筆者研究的南瓜砧木嫁接的西瓜、甜瓜上發(fā)生的枯萎病，并非由最常見的尖孢鐮刀菌侵染引起。單憑田間癥狀難以準(zhǔn)確識(shí)別病原菌的種類，而對(duì)不同種類病原菌所引起的病害，往往在防控方法上有著很大差異，因此，準(zhǔn)確鑒定病原菌種類是有效控制病害的前提。

瓜亡革菌屬于擔(dān)子菌亞門瓜亡革菌屬，其無性態(tài)為半知菌亞門絲核菌屬立枯絲核菌。瓜亡革菌是一種非常復(fù)雜的土壤習(xí)居菌，根據(jù)菌絲的融合情況可劃分為14個(gè)融合群[14]，大多數(shù)類群為植物病原真菌，多引起植物的莖部病害。該菌的寄主范圍非常廣泛，包括260多種植物，它可以侵染水稻、玉米、大豆、馬鈴薯等農(nóng)作物和幾乎所有的蔬菜作物，引起多種作物的立枯病[15-17]。瓜亡革菌引起水稻紋枯病，為水稻上的三大病害之一，嚴(yán)重影響了水稻的產(chǎn)量和質(zhì)量[18]；侵染煙草葉片引起的煙草靶斑病，田間損失可達(dá)50%[19-21]。

立枯絲核菌導(dǎo)致的西瓜、甜瓜苗期病害，即西瓜、甜瓜立枯病在生產(chǎn)中比較常見，但是瓜亡革菌（立枯絲核菌）導(dǎo)致西瓜、甜瓜成株期病害的研究比較少見。筆者的試驗(yàn)結(jié)果表明，瓜亡革菌可侵染供試的所有蔬菜品種，但是對(duì)于不同種類的蔬菜作物致病力是有差異的，比如在同等的高接種壓力下，辣椒的發(fā)病率明顯低于其他作物，據(jù)此推測(cè)，采用辣椒與瓜類輪作會(huì)有助于減輕該病害的發(fā)生。

在供試的不同種類蔬菜作物中，不同品種對(duì)于該病原菌存在抗感差異，因此，針對(duì)該病害，有望篩選培育出抗病性較強(qiáng)的品種，來降低在生產(chǎn)上的危害程度，提高蔬菜產(chǎn)量和品質(zhì)。

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