韓 鎳,李冠恒,陸玲玲,夏佳靖,金 琳*

(1.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬光華醫(yī)院超聲科,上海 200052;2.上海體育學(xué)院運動健康學(xué)院,上海 200438)

糖尿病性胃輕癱(diabetic gastroparesis, DGP)是以非機械梗阻胃延遲排空為主要特征的綜合征[1],早期常伴噯氣、惡心、嘔吐及上腹痛等癥狀,嚴重影響患者生活質(zhì)量,且近年來發(fā)病率迅速增長。另一方面,由于糖尿病引發(fā)胃動力障礙的機制較為復(fù)雜,導(dǎo)致成模率較低,目前尚無獲得廣泛認可的DGP動物模型[2]。超聲可用于評估胃動力,但相關(guān)動物模型研究較少,且缺乏統(tǒng)一標(biāo)準。本研究通過小劑量鏈脲佐菌素(streptozotocin, STZ)聯(lián)合不規(guī)律高脂高糖飲食法構(gòu)建大鼠DGP模型,觀察超聲用于評估其胃動力的價值。

1 資料與方法

1.1 實驗動物 清潔級雄性6周齡SD大鼠26只[動物許可證號:SCXK(滬)2022-0004],體質(zhì)量(200±20)g;飼養(yǎng)條件:溫度(22±2)℃,相對濕度40%～60%,24 h自由飲水。本實驗經(jīng)機構(gòu)倫理委員會批準(批準號:20221130)。

1.2 主要儀器及試劑 羅氏血糖儀;佳能Aplio i800超聲診斷儀,配備18 MHz線陣探頭、速溶胃腸超聲助顯劑;成都泰盟HV1403多通道數(shù)據(jù)采集和分析系統(tǒng)。STZ、卡巴膽堿(carbachol, CCh)、戊巴比妥鈉(美國Sigma);檸檬酸鈉緩沖液(北京索萊寶科技有限公司);磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline, PBS)(蘇州君欣生物科技有限公司);克-亨液(Krebs-Hensleit's solution)(武漢普諾賽生命科技有限公司)。

1.3 建立大鼠DGP模型 將接受普通飼料(含碳水化合物50%、脂肪10%、蛋白質(zhì)20%)適應(yīng)性飼養(yǎng)1周的26只大鼠隨機分為模型組(n=18)和對照組(n=8),分別以高脂高糖飼料(基礎(chǔ)維持飼料68.8%、豬油10%、蔗糖20%、膽固醇1%、膽酸鈉0.2%)和普通飼料飼養(yǎng)1周。于實驗第3周始對模型組大鼠經(jīng)腹腔注射1% STZ溶液(以pH 值為4.4的0.1 mol/L檸檬酸緩沖溶液配制)20 mg/kg體質(zhì)量,72 h后經(jīng)尾靜脈取血,測定非空腹血糖,以>16.7 mmol/L為建模成功[3];否則再經(jīng)腹腔注射STZ溶液25 mg/kg體質(zhì)量,72 h后測定非空腹血糖,若仍未建模成功繼續(xù)重復(fù)上述干預(yù),直至建模成功或死亡。對照組大鼠經(jīng)腹腔注射等量檸檬酸緩沖溶液。建模期間對模型組大鼠均以不規(guī)律高脂高糖飲食法飼養(yǎng),單數(shù)日上午進食、雙數(shù)日下午進食;對照組大鼠以規(guī)律普通飼養(yǎng)法飼養(yǎng)。每周記錄大鼠體質(zhì)量和非空腹血糖,共持續(xù)8周。

1.4 測試口服葡萄糖糖耐量(oral glucose tolerance test, OGTT) 成功建模后對2組大鼠停飼但不禁飲12～14 h,之后以50%葡萄糖溶液(2 ml/kg體質(zhì)量)灌胃,分別于灌胃后0(即刻)、30、60、90及120 min經(jīng)尾靜脈取血,檢測血糖值。

1.5 超聲檢查 檢查前對2組大鼠停飼8 h。以100℃飲用水沖泡50 g胃腸超聲助顯劑至約250 ml,冷卻至37℃,以強飼法予大鼠5 ml助顯劑實驗餐。腹部檢查區(qū)域備皮后,將大鼠置于鼠套中,以半仰臥位保定于可塑性軟墊中,盡量使其處于較自然狀態(tài),于鼠套中央開口以暴露腹部。將探頭置于左肋弓下,觀察胃竇、胃體和胃底區(qū)域,以超聲全胃圓柱體法(ultrasonic whole stomach cylinder method, UWSCM)公式計算實驗餐后0(即刻)、30及60 min全胃腔容積[4];以左肝、腸系膜上靜脈及腹主動脈為定位標(biāo)志,獲取胃竇短軸切面,計算實驗餐后0(即刻)、30及60 min胃竇面積[5];分別按照以下公式計算胃排空率(gastric emptying rate, GER)、胃竇收縮頻率(antrum contraction frequency, ACF)、胃竇收縮幅度(antrum contraction amplitude, ACA)及胃竇動力指數(shù)(motility index, MI):胃竇GER=(1-實驗餐后不同時間點胃竇面積/實驗餐后即刻胃竇面積)×100%,全胃腔GER=(1-實驗餐后不同時間點全胃腔容積/實驗餐后即刻全胃腔容積)×100%, ACF=進食實驗餐后前9 min內(nèi)每3 min胃竇收縮次數(shù)的平均值, ACA=[胃竇最大舒張面積(Areamax)-胃竇最小收縮面積(Areamin)]/胃竇最大舒張面積×100%, MI=ACA×ACF。

1.6 離體胃竇肌條實驗 以過量戊巴比妥鈉麻醉后處死大鼠,取胃竇近幽門部位組織并制成10 mm×3 mm平滑肌條,置于4℃ PBS中備用;將肌條一端固定于恒溫浴槽底部、另一端與拉力傳感器感應(yīng)頭相連,使肌條處于完全松弛狀態(tài)并垂直浸沒于37℃恒溫浴槽中;加入10 ml克-亨氏液,持續(xù)混合后通入95% O2和5% CO2;牽拉肌條至最適張力[(1.2±0.1)g],平衡約30 min后向浴槽滴加0.5 mol/L CCh,以多通道數(shù)據(jù)采集和分析系統(tǒng)記錄張力;記錄肌條最大收縮力,即最大刺激后張力與刺激前張力之差。

1.7 病理檢查 對胃竇組織行HE染色,之后于光鏡下觀察胃竇黏膜層及肌層細胞形態(tài)。

1.8 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 27.0統(tǒng)計分析軟件。以±s表示計量資料,行兩獨立樣本t檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

模型組首次注射后8只建模成功,其余10只未能成功;第二次注射后4只建模成功、4只未成功;第三次注射后2只建模成功、2只死亡。

2.1 體質(zhì)量、血糖及OGTT 第6～8周,模型組大鼠體質(zhì)量均明顯低于對照組(P均<0.05,圖1A)。第3周始模型組大鼠非空腹血糖顯著升高(P均<0.05,圖1B),各時間點糖耐量水平均顯著高于對照組(P均<0.05,圖1C)。

圖1 大鼠體質(zhì)量、血糖及糖耐量變化曲線 A.體質(zhì)量; B.非空腹血糖; C.糖耐量 (*:P<0.01)

2.2 超聲 相比對照組,模型組大鼠實驗餐后30、60 min GER顯著降低(表1);模型組Areamin大于、ACA和MI均小于對照組(P均<0.001,表2);見圖2。

表1 模型組與對照組大鼠實驗餐后GER比較(%)

表2 模型組與對照組大鼠胃竇動力相關(guān)指標(biāo)比較

圖2 超聲聲像圖示大鼠實驗餐后胃排空表現(xiàn) A.全胃腔容積(箭); B.胃竇面積(箭)

2.3 離體胃竇平滑肌條實驗 模型組大鼠離體胃竇平滑肌肌條最大收縮力[(0.58±0.32)g]小于對照組[(1.12±0.24)g](P<0.001,圖3)。

圖3 滴加0.5 mol/L CCh后大鼠離體平滑肌條實驗 A.收縮反應(yīng)圖; B.最大收縮力柱狀圖

2.4 病理學(xué)所見 模型組大鼠胃竇黏膜層胃小凹溝紋不均勻,部分上皮細胞脫落,主細胞及壁細胞減少(圖4A);對照組大鼠胃竇黏膜結(jié)構(gòu)層次清晰,腺體分布規(guī)則,排列致密、整齊(圖4B)。模型組大鼠胃竇平滑肌細胞變小,可見空泡樣改變,細胞核不規(guī)則、核膜皺縮明顯(圖4C);對照組大鼠胃竇平滑肌細胞多呈梭形,細胞核規(guī)則,呈長橢圓形,核膜相對平滑,褶皺少而淺(圖4D)。

圖4 胃竇組織病理圖 A、B.模型組(A)及對照組(B)大鼠胃竇黏膜層(HE,×200); C、D.模型組(C)及對照組(D)大鼠胃竇肌層(HE,×400)

3 討論

理想的動物模型對探索糖尿病DGP病理生理機制及治療方法十分重要。糖尿病引起胃排空障礙不僅與胃排空延遲有關(guān),還與胃排空加速有關(guān)[6];但在建立DGP動物模型過程中,胃延遲排空并非必然現(xiàn)象,導(dǎo)致成模率較低。

目前常見DGP動物模型主要分為糖尿病自然模型和糖尿病非自然模型,后者指在糖尿病基礎(chǔ)上聯(lián)合不規(guī)律高脂高糖飲食所建立的DGP模型。本研究通過小劑量多次注射STZ聯(lián)合不規(guī)律高脂高糖飲食成功建立了大鼠DGP模型。相比單次大劑量注射STZ,小劑量多次注射可使血糖水平逐步上升,逐漸破壞大鼠胰島β細胞,降低其酮癥死亡率,且更接近于人類DGP發(fā)生發(fā)展過程[7-8];聯(lián)合不規(guī)律高脂高糖飲食可進一步縮短后續(xù)胃輕癱發(fā)展時間,以于較短時間內(nèi)成模,且所獲模型較為穩(wěn)定[2,9]。

核素檢查為診斷胃排空延遲的金標(biāo)準,但費用較高、難以推廣。根據(jù)動物癥狀可評估DGP大鼠建模成功與否[10],但受觀察者主觀影響較大,且胃排空減緩程度與癥狀嚴重程度并非呈線性關(guān)系,不足以準確判斷[1]。亦可采用終末性測試檢測胃排空情況評估建模成功與否,該方法經(jīng)濟、簡便、對設(shè)備要求低,但檢測后動物無法繼續(xù)存活,不支持重復(fù)測量。超聲為非終末性檢查方法,不僅可實時評價GER和胃動力功能[11],且不影響動物存活;予大鼠口服超聲助顯劑后,胃底出現(xiàn)容受性舒張,助顯劑在胃底、胃體部逐步充填并向胃竇部推進,期間全胃腔容積及胃竇面積逐步減小,可利用超聲動態(tài)觀察胃收縮、蠕動及排空全過程,進而評價胃動力情況[11-14]。WU等[5,15]以胃竇單平面測量法評估DGP大鼠胃排空。本研究在其基礎(chǔ)上進一步評估全胃腔容積及相關(guān)胃動力參數(shù),結(jié)果顯示模型組大鼠GER顯著下降,符合DGP特征;其胃竇收縮功能和胃竇動力指數(shù)明顯受損而胃竇舒張功能和收縮頻率未見明顯變化,原因可能與DGP病程發(fā)展有關(guān),或與不同部位其病理損傷類型不同有關(guān)。同時,本研究離體胃竇平滑肌條實驗結(jié)果顯示模型組大鼠胃平滑肌收縮力顯著下降,與超聲表現(xiàn)一致,符合DGP病理學(xué)表現(xiàn)。

綜上所述,超聲可用于評估DGP大鼠模型胃動力。受氣體干擾,本研究超聲顯示大鼠局部胃壁與助顯劑分界面稍欠清晰,可能對測量結(jié)果造成影響,有待后續(xù)加以改進。