米 銳,關(guān)曉燕,王慶志,蔣經(jīng)偉,李華琳,姜蘋哲,,徐永平,李淑英,周遵春

( 1.遼寧省海洋水產(chǎn)科學(xué)研究院,遼寧 大連 116023; 2.大連賽姆生物工程技術(shù)有限公司博士后工作站,遼寧 大連 116620; 3.遼寧省噬菌體應(yīng)用工程技術(shù)研究中心,遼寧 大連 116620 )

蝦夷扇貝(Patinopectenyessoensis)屬軟體動(dòng)物門瓣鰓綱,為冷水性雙殼貝類,具有養(yǎng)殖周期短、味道鮮美、營養(yǎng)價(jià)值高等特點(diǎn),是我國主要的貝類養(yǎng)殖品種[1]。隨著蝦夷扇貝養(yǎng)殖規(guī)模的不斷擴(kuò)大,在養(yǎng)殖過程中出現(xiàn)的種質(zhì)退化、環(huán)境脅迫及病害頻發(fā)等問題,制約了蝦夷扇貝養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展[2-3]。而以致病性弧菌為主的細(xì)菌病是蝦夷扇貝親貝促熟、苗種繁育和養(yǎng)殖過程中的常見疾病,具有暴發(fā)性強(qiáng)、感染速度快、死亡率高等特點(diǎn),給蝦夷扇貝養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。由于抗生素類藥物的使用易引發(fā)細(xì)菌抗藥性及食品和環(huán)境安全等問題,在蝦夷扇貝等水生動(dòng)物的苗種繁育及健康養(yǎng)殖中被嚴(yán)格限制使用。因此,開發(fā)生產(chǎn)配方安全、原料新型的抗生素替代品已成為研究熱點(diǎn)。綠色環(huán)保、營養(yǎng)豐富的飼料添加劑有助于提高蝦夷扇貝的非特異性免疫機(jī)能及抗病能力,對于提升養(yǎng)殖效果、增加經(jīng)濟(jì)效益具有重要意義。

益生菌制劑可以維持宿主的微生態(tài)平衡,具有補(bǔ)充營養(yǎng)成分、改善腸道健康、提高飼料利用率和抑制病原菌增殖的功能。作為飼料添加劑使用是機(jī)體攝入益生菌最為實(shí)用、高效的方式[4-5]。目前,以地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)為主的益生菌制劑受到廣泛關(guān)注。地衣芽孢桿菌屬厚壁菌門,能夠厭氧繁殖,易于在腸道內(nèi)定殖生長。地衣芽孢桿菌穩(wěn)定性極高,可在高溫以及酸性等不利的環(huán)境中以內(nèi)生孢子的形式存在。同時(shí),地衣芽孢桿菌可以分泌多種消化酶、生長因子和抗菌物質(zhì),可以有效促進(jìn)營養(yǎng)成分降解,輔助機(jī)體能量代謝,還可以通過營養(yǎng)競爭、空間競爭等方式抑制致病菌的增殖,而對部分有益菌有促進(jìn)和共生作用[6-8]。作為重要的植物蛋白源,桑葉具有天然、營養(yǎng)、毒副作用小等特點(diǎn)。桑葉提取物中富含多種氨基酸、維生素、多糖類、單寧類及黃酮類物質(zhì),具有提高動(dòng)物生產(chǎn)性能、免疫機(jī)能及抗病能力的功能,在機(jī)體生長發(fā)育、營養(yǎng)代謝和免疫調(diào)控等生理過程中發(fā)揮顯著的作用[9-10]。地衣芽孢桿菌和桑葉提取物作為飼料添加劑已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖中,而關(guān)于二者聯(lián)合施用于水產(chǎn)養(yǎng)殖中的報(bào)道相對較少。

筆者將地衣芽孢桿菌和桑葉提取物添加到飼料中,開展蝦夷扇貝飼養(yǎng)試驗(yàn)及弧菌攻毒試驗(yàn),評估其在蝦夷扇貝養(yǎng)殖中的作用,旨在為蝦夷扇貝健康養(yǎng)殖提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)用蝦夷扇貝、飼料購自大連當(dāng)?shù)厮a(chǎn)品批發(fā)市場。蝦夷扇貝殼長(70.0±7.4) mm,單體質(zhì)量(34.6±2.8) g,基礎(chǔ)飼料為螺旋藻(Spirulinaplatensis)和鼠尾藻(Sargassumthunbergii)按照質(zhì)量比1∶1組成的粉末。試驗(yàn)開始前蝦夷扇貝于人工控溫育苗池暫養(yǎng)10 d。暫養(yǎng)期間保持充氣,水溫(16±2) ℃,pH 8.0±0.5,鹽度30±2。每日換水50%后投喂飼料,飼料日投量為每枚蝦夷扇貝1.0×1010個(gè)藻細(xì)胞。益生菌株經(jīng)16S rDNA同源分析法鑒定為地衣芽孢桿菌,病原菌為哈維氏弧菌(Vibrioharveyi)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 飼料制備

將冰箱中-80 ℃凍存的地衣芽孢桿菌活化重懸后,按5%的接種比例加入到MSB液體培養(yǎng)基中,30 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)。將地衣芽孢桿菌培養(yǎng)至對數(shù)生長期后,離心棄上清液,采用麥?zhǔn)媳葷岱ㄕ{(diào)整菌液密度,備用。將新鮮桑葉用蒸餾水清洗干凈,勻漿粉碎,加入體積分?jǐn)?shù)75%的乙醇溶液(料液比為1 g∶15 mL),在工作頻率為40 kHz、功率為80 W的超聲波作用下浸提2 h,過濾去掉雜質(zhì),將浸提液濃縮后冷凍干燥得到凍干粉,即桑葉提取物。地衣芽孢桿菌與桑葉提取物在飼料中的添加量分別為107cfu/g和8 mg/g[11-12]。

1.2.2 飼養(yǎng)試驗(yàn)

將暫養(yǎng)后的蝦夷扇貝隨機(jī)分配至相同規(guī)格200 cm×100 cm×80 cm水族箱中,每箱50枚。試驗(yàn)共設(shè)3個(gè)處理組和1個(gè)對照組,每組3個(gè)平行。其中,對照組只飼喂基礎(chǔ)飼料,地衣芽孢桿菌添加組飼喂添加地衣芽孢桿菌的基礎(chǔ)飼料,桑葉添加組飼喂添加桑葉提取物的基礎(chǔ)飼料,聯(lián)合添加組飼喂同時(shí)添加地衣芽孢桿菌、桑葉提取物的基礎(chǔ)飼料。飼養(yǎng)試驗(yàn)持續(xù)30 d,飼養(yǎng)條件與暫養(yǎng)時(shí)期一致。分別于試驗(yàn)第0、10、20、30天取樣測定蝦夷扇貝消化酶和免疫酶活性。

1.2.3 取樣及酶活性測定

在每個(gè)取樣時(shí)間點(diǎn)從每個(gè)試驗(yàn)組隨機(jī)取3個(gè)蝦夷扇貝,用2 mL滅菌注射器從蝦夷扇貝閉殼肌血竇中抽取血淋巴1.5 mL置于預(yù)冷離心管中,4 ℃、4000 r/min(離心半徑5.9 cm)離心10 min,取上清液用于測定免疫酶活性。用無菌手術(shù)刀解剖蝦夷扇貝,分離出消化道并切取直腸組織,無菌生理鹽水沖洗后用濾紙吸干,以10倍磷酸鹽緩沖溶液(pH 7.5)勻漿10 min,勻漿液于4 ℃、4000 r/min(離心半徑5.9 cm)離心10 min,取上清液用于測定消化酶活性。

采用南京建成科技有限公司測試盒測定蝦夷扇貝的免疫酶和消化酶活性,酶活性檢測重復(fù)3次。免疫酶中的酸性磷酸酶和堿性磷酸酶活性采用磷酸苯二鈉法測定,超氧化物歧化酶活性采用WST-1法測定,溶菌酶活性采用比濁法測定。消化酶中的淀粉酶活性采用碘-淀粉比色法測定,脂肪酶活性采用甲基試鹵靈底物法測定,胰蛋白酶和纖維素酶活性采用分光光度法測定,具體測定步驟參照試劑盒說明書。

1.2.4 哈維氏弧菌攻毒試驗(yàn)

每組隨機(jī)取25個(gè)蝦夷扇貝用于哈維氏弧菌攻毒試驗(yàn)。將活化的哈維氏弧菌接種到2216E培養(yǎng)基上,28 ℃培養(yǎng)24 h,用無菌海水將哈維氏弧菌重懸并稀釋至不同密度。通過預(yù)試驗(yàn)證實(shí),該株哈維氏弧菌對蝦夷扇貝存在致病性,并確定其對蝦夷扇貝72 h的半致死密度為107cfu/mL。每枚蝦夷扇貝經(jīng)閉殼肌注射100 μL半致死密度的哈維氏弧菌,攻毒試驗(yàn)設(shè)3組平行,持續(xù)96 h,每隔8 h觀察蝦夷扇貝發(fā)病情況并統(tǒng)計(jì)累積死亡率。攻毒試驗(yàn)期間蝦夷扇貝飼養(yǎng)條件與投喂試驗(yàn)一致。

1.2.5 攻毒蝦夷扇貝致病菌檢測

攻毒試驗(yàn)結(jié)束后,從每個(gè)試驗(yàn)組隨機(jī)取3個(gè)蝦夷扇貝,解剖切取1 cm消化道直腸組織,濾紙瀝干后以10倍體積磷酸鹽緩沖液(pH 7.5)勻漿處理10 min,勻漿液于4 ℃、4000 r/min(離心半徑5.9 cm)離心10 min,用無菌生理鹽水將上清液稀釋10倍,取200 μL涂布于硫代硫酸鹽檸檬酸鹽膽鹽蔗糖弧菌選擇性培養(yǎng)基,28 ℃倒置培養(yǎng),2 d后統(tǒng)計(jì)各試驗(yàn)組蝦夷扇貝消化道弧菌數(shù)目。

1.2.6 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)用SPSS 21.0軟件進(jìn)行單因素方差分析以及鄧肯多重比較,結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示,P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié) 果

2.1 地衣芽孢桿菌和桑葉提取物對蝦夷扇貝免疫酶活性的影響

隨著試驗(yàn)的進(jìn)行,各組酸性磷酸酶、堿性磷酸酶活性均逐漸升高,其中聯(lián)合添加組最高,地衣芽孢桿菌添加組次之,對照組最低(圖1a、b)。各組超氧化物歧化酶活性呈先升后降的趨勢,其中聯(lián)合添加組最高,對照組最低,而地衣芽孢桿菌添加組與桑葉添加組的超氧化物歧化酶活性差異不顯著(P>0.05)(圖1c)。各組的溶菌酶活性均緩慢上升,而聯(lián)合添加組的增長幅度明顯高于其他處理組;試驗(yàn)20 d后,各組溶菌酶活性趨于穩(wěn)定,對照組的活性最低,地衣芽孢桿菌添加組與桑葉添加組的溶菌酶活性差異不顯著(P>0.05)(圖1d)。

2.2 地衣芽孢桿菌和桑葉提取物對蝦夷扇貝消化酶活性的影響

各組淀粉酶、纖維素酶活性均顯著上升,其中聯(lián)合添加組活性最高,地衣芽孢桿菌添加組與桑葉添加組差異不顯著(P>0.05),對照組的活性最低(圖2a、b)。除對照組外,各處理組脂肪酶活性均呈先顯著上升后緩慢下降的趨勢,其中聯(lián)合添加組和地衣芽孢桿菌添加組活性相對最高,對照組的脂肪酶活性最低(圖2c)。在整個(gè)試驗(yàn)過程中,胰蛋白酶的活性變化不明顯,各處理組之間的胰蛋白酶活性均差異不顯著(P>0.05)(圖2d)。

圖2 地衣芽孢桿菌和桑葉提取物對蝦夷扇貝淀粉酶、纖維素酶、脂肪酶和胰蛋白酶活性的影響Fig.2 Effects of B. licheniformis and mulberry leaf extracts on activities of amylase, cellulase, lipase and trypsin of the Yesso scallop

2.3 地衣芽孢桿菌和桑葉提取物對攻毒蝦夷扇貝累積死亡率的影響

地衣芽孢桿菌和桑葉提取物對攻毒蝦夷扇貝累積死亡率的影響見圖3。注射哈維氏弧菌24 h后,首先在對照組發(fā)現(xiàn)死亡個(gè)體,之后分別在攻毒后32、40、48 h分別在桑葉添加組、地衣芽孢桿菌添加組、聯(lián)合添加組發(fā)現(xiàn)首個(gè)死亡個(gè)體。隨著攻毒試驗(yàn)的進(jìn)行,各處理組蝦夷扇貝死亡個(gè)體數(shù)逐漸增加。攻毒96 h時(shí),對照組蝦夷扇貝的累積死亡率達(dá)到76%,顯著高于其他組(P<0.05)。聯(lián)合添加組蝦夷扇貝的累積死亡率最低,為48%,地衣芽孢桿菌添加組與桑葉添加組蝦夷扇貝的累積死亡率差異不顯著(P>0.05)。

圖3 地衣芽孢桿菌和桑葉提取物對攻毒哈維氏弧菌蝦夷扇貝累積死亡率的影響Fig.3 Cumulative mortalities of Yesso scallop diets containing B. licheniformis and mulberry leaf extracts after the V. harveyi challenge

2.4 地衣芽孢桿菌和桑葉提取物對攻毒蝦夷扇貝消化道弧菌的抑制作用

地衣芽孢桿菌和桑葉提取物對攻毒蝦夷扇貝消化道弧菌的抑制作用見圖4。對照組蝦夷扇貝消化道弧菌數(shù)目明顯高于其他處理組,地衣芽孢桿菌添加組與桑葉添加組的弧菌數(shù)目無明顯差異,聯(lián)合添加組蝦夷扇貝消化道弧菌數(shù)目最少,抑菌效果最明顯。

3 討 論

3.1 地衣芽孢桿菌和桑葉提取物對蝦夷扇貝免疫酶活性的影響

蝦夷扇貝沒有特異性免疫系統(tǒng),主要依靠體液中的細(xì)胞免疫和體液免疫因子來增強(qiáng)機(jī)體的防御能力和免疫機(jī)能[13]。酸性磷酸酶、堿性磷酸酶、超氧化物歧化酶和溶菌酶能夠積極參與機(jī)體的免疫防御活動(dòng)、阻斷脂質(zhì)過氧化、消除侵入的致病菌,是衡量蝦夷扇貝免疫機(jī)能的重要指標(biāo)[14]。

本試驗(yàn)中,地衣芽孢桿菌和桑葉提取物聯(lián)合施用時(shí),可更顯著地提高蝦夷扇貝的酸性磷酸酶和堿性磷酸酶活性,與Lin等[15]的研究結(jié)果相似,表明地衣芽孢桿菌和桑葉提取物能夠分泌非特異性磷酸酶或通過誘導(dǎo)激發(fā)的形式,提高蝦夷扇貝分泌磷酸酶的能力。當(dāng)二者聯(lián)合施用時(shí),磷酸酶的響應(yīng)能力更強(qiáng),可以激活吞噬細(xì)胞更有效地識別和消滅病原體[16]。各組的超氧化物歧化酶活性呈先升后降的趨勢,表明在超氧化物歧化酶水平上,蝦夷扇貝對地衣芽孢桿菌和桑葉提取物產(chǎn)生了短期適應(yīng)性。而在適應(yīng)期后,過量的酶導(dǎo)致機(jī)體氧化壓力不足,氧化因子缺乏,抗氧化能力下降[17-18]。相對來說,聯(lián)合添加組具備更強(qiáng)的清除和平衡細(xì)胞內(nèi)活性氧自由基、抑制氧化損傷的能力。各組的溶菌酶活性緩慢上升后趨于穩(wěn)定。這可能是因?yàn)闄C(jī)體需要一段整合時(shí)間使溶菌酶進(jìn)入血淋巴以提供基礎(chǔ)免疫,而在蝦夷扇貝適應(yīng)了地衣芽孢桿菌和桑葉提取物的免疫刺激之后,各組溶菌酶活性保持穩(wěn)定[19]。而相比于其他組,聯(lián)合添加組可以更有效地水解致病菌細(xì)胞壁的糖苷鍵,起到生物防御的作用。

3.2 地衣芽孢桿菌和桑葉提取物對蝦夷扇貝消化酶活性的影響

消化酶活性的高低決定了蝦夷扇貝對營養(yǎng)物質(zhì)消化吸收的能力以及體內(nèi)營養(yǎng)物質(zhì)積累的速度,是反映蝦夷扇貝消化生理機(jī)能的重要指標(biāo)。蝦夷扇貝的消化酶主要為淀粉酶、纖維素酶、脂肪酶和胰蛋白酶等[20]。相對于肝胰腺等其他組織,蝦夷扇貝的消化酶主要由消化系統(tǒng)中的直腸組織分泌產(chǎn)生。為有效評估地衣芽孢桿菌和桑葉提取物誘導(dǎo)扇貝消化酶合成的作用效果,故選取蝦夷扇貝直腸組織進(jìn)行消化酶活性測定。

本試驗(yàn)中,聯(lián)合添加組蝦夷扇貝的淀粉酶和纖維素酶活性顯著高于其他組。這表明地衣芽孢桿菌和桑葉提取物聯(lián)合施用時(shí)可以刺激蝦夷扇貝分泌更多的淀粉酶和纖維素酶用于營養(yǎng)物質(zhì)代謝,更高效地將大分子物質(zhì)分解成易被吸收的小分子物質(zhì),有效增強(qiáng)蝦夷扇貝的糖類水解能力[21]。除對照組外,各組蝦夷扇貝的脂肪酶活性均呈先顯著上升后緩慢下降的趨勢,這可能是由于地衣芽孢桿菌和桑葉提取物可以刺激蝦夷扇貝在短期內(nèi)分泌并積累過多的脂肪酶,而過飽和的脂肪酶會(huì)使機(jī)體出現(xiàn)免疫疲勞現(xiàn)象,降低酶與底物的結(jié)合能力,導(dǎo)致部分脂肪酶失活[22]。盡管如此,各處理組的脂肪酶活性仍明顯高于對照組。在整個(gè)試驗(yàn)過程中,各處理組之間的胰蛋白酶活性均無顯著差異,這可能是因?yàn)榈匾卵挎邨U菌和桑葉提取物不能有效誘導(dǎo)蝦夷扇貝的胰蛋白酶的產(chǎn)生,說明地衣芽孢桿菌和桑葉提取物對各類消化酶活性的影響具有選擇性,與蝦夷扇貝本身的消化機(jī)制及飼料添加劑的種類有關(guān)[23]。

3.3 地衣芽孢桿菌和桑葉提取物對蝦夷扇貝抵抗哈維氏弧菌感染的影響

哈維氏弧菌是一種海洋致病菌,可通過分泌溶血素、腸毒素、胞外蛋白酶及脂多糖等使病原體從宿主獲取營養(yǎng)并通過組織傳播,對甲殼類、貝類和魚類等多種水產(chǎn)動(dòng)物產(chǎn)生致病作用[24]。

本試驗(yàn)中,地衣芽孢桿菌可增加蝦夷扇貝腸道優(yōu)勢菌含量并優(yōu)化腸道微生物菌群結(jié)構(gòu),通過競爭性排斥作用抑制弧菌生長[8]。同時(shí),地衣芽孢桿菌還可以通過分泌細(xì)菌素類、蛋白類、脂肽類、多肽類、酚類等活性物質(zhì)來對弧菌產(chǎn)生生物拮抗作用,有效提高蝦夷扇貝的抗病能力[4,25]。桑葉提取物具有廣譜抑菌功能,其中的水解單寧酸可以降低蝦夷扇貝腸道的通透性,阻斷弧菌與腸道結(jié)合的受體,抑制弧菌感染[26-27]。本試驗(yàn)結(jié)果表明,飼料中添加地衣芽孢桿菌和桑葉提取物可顯著增強(qiáng)蝦夷扇貝抵抗弧菌感染的能力,當(dāng)二者聯(lián)合施用時(shí),可以更有效地破壞致病菌的細(xì)胞壁,引起細(xì)胞裂解,抑制弧菌的氧化磷酸化作用,鈍化其致病能力,這也與各組蝦夷扇貝免疫酶活性的變化規(guī)律一致。因此,相比于其他處理組,聯(lián)合添加組蝦夷扇貝的累積死亡率更低,消化道致病菌更少,抗病效果更明顯。

3.4 地衣芽孢桿菌和桑葉提取物的協(xié)同增效作用

益生菌和中草藥作為飼料添加劑往往單獨(dú)應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖中,而有研究表明,二者復(fù)合使用比單獨(dú)應(yīng)用效果更好[28]。本試驗(yàn)中應(yīng)用的地衣芽孢桿菌和桑葉提取物作用過程耦合、互利共棲,具有顯著的協(xié)同效應(yīng)。桑葉提取物的有效成分含有葡萄糖苷類化合物,在蝦夷扇貝消化道內(nèi)難以吸收,生物利用度低。而地衣芽孢桿菌在新陳代謝過程中產(chǎn)生的α-糖苷酶和β-糖苷酶是桑葉提取物代謝反應(yīng)中重要的配糖體水解酶,可將桑葉中的大分子物質(zhì)分解為更易吸收的活性肽、氨基酸等小分子物質(zhì),提高生物活性物質(zhì)溶出率,利于機(jī)體吸收。同時(shí),這些酶具有氧化、甲基化、酯化、還原等多種生物功能,可以催化不同底物,將桑葉提取物中的部分次級代謝產(chǎn)物轉(zhuǎn)化為藥理活性物質(zhì)[29-30]。反之,桑葉提取物可以為地衣芽孢桿菌提供生長所需要的專一性底物,提高其存活率。桑葉提取物中富含蛋白質(zhì)、微量元素、維生素等多種營養(yǎng)成分及生物活性物質(zhì),可以為地衣芽孢桿菌的生長繁殖、新陳代謝提供營養(yǎng)物質(zhì)[31]。同時(shí),桑葉提取物中的有效成分還可以抑制地衣芽孢桿菌中致病性雜菌的增殖[32]。本試驗(yàn)結(jié)果表明,相比于單獨(dú)添加組,聯(lián)合施用地衣芽孢桿菌和桑葉提取物可以更有效地提高蝦夷扇貝的消化功能、免疫機(jī)能及抗病能力。

4 結(jié) 論

綜上所述,聯(lián)合施用地衣芽孢桿菌和桑葉提取物,可以顯著增強(qiáng)蝦夷扇貝的消化功能和免疫機(jī)能,有效提高蝦夷扇貝抵抗哈維氏弧菌感染的能力。本試驗(yàn)結(jié)果對開發(fā)和生產(chǎn)綠色健康的水產(chǎn)飼料具有重要參考價(jià)值。