謝燕華 康超 緱嬌 王松海 許鵬

(陜西省中醫(yī)醫(yī)院,陜西 西安 710003)

肝癌是臨床最為常見的惡性腫瘤之一,具有較高的發(fā)病率和死亡率,會對人們的健康乃至生命安全構成威脅[1]。近年來,隨著人口老齡化的加劇,以及人們生活、飲食等習慣的改變,肝癌的發(fā)病率逐年上升,并且呈現(xiàn)出一定的年輕化趨勢,其防治形勢不容樂觀[2]。然而至今,肝癌的發(fā)病機制并未真正明確[3]。近來有研究指出,在惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中,細胞凋亡抑制比細胞過度增殖起到的作用更重要,它是許多凋亡相關基因協(xié)同作用的結果,因此認為加強對細胞凋亡的干預,可能為惡性腫瘤的治療提供新的方向[4]。黃芩苷是一種黃酮類化合物,從黃芩根部分離提取,在抑菌、抗炎、利尿、解痙等方面有著重要的作用[5-6]。但是從目前臨床對黃芩苷在肝癌治療中的應用來看,并未見太多報道,其對腫瘤細胞增殖的抑制和凋亡的促進作用如何,仍有待深入探究[7-8]。為此,本研究針對黃芩苷誘導人肝癌HepG-2細胞凋亡及對Bcl-2和Bax表達的影響展開分析,旨在探討黃芩苷誘導HepG-2細胞凋亡的機制,從而為臨床提供一定的科學依據(jù)?，F(xiàn)報道如下:

1 儀器與材料

1.1儀器 NJL07-3型微波爐(南京杰全微波設備有限公司);3110型CO2培養(yǎng)箱(美國Thermo Fisher公司);CKX53倒置熒光顯微鏡(日本Olympus公司);FACSCalibur型流式細胞儀(美國Becton Dicknson公司);HH-420電熱恒溫水浴箱(新康醫(yī)療器械有限公司)。

1.2試藥 黃芩苷(南京青澤醫(yī)藥有限公司);細胞株:人肝癌細胞株HepG-2購自中國科學院細胞所細胞庫。小牛血清(北京華美生物工程公司);兔抗Bcl-2、Bax單克隆抗體均購自碧云天生物科技有限公司;免疫細胞化學試劑盒(福建邁新生物有限公司)。

2 方法

2.1HepG-2細胞培養(yǎng) 采用體外細胞培養(yǎng)的形式,培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液中,置37 ℃、95%濕度、體積分數(shù)5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。按給藥不同分為4組:對照組(細胞未給予黃芩苷處理),低劑量組(25 μg·mL-1),中劑量組(50 μg·mL-1),高劑量組(100 μg·mL-1)。

2.2MTT檢測 取對數(shù)生長期的人肝癌HepG-2細胞,加入適量0.25%胰酶消化,吹打制成單個細胞懸液,調整細胞密度為4×104個·mL-1,以每孔100 μL,加入96孔培養(yǎng)板內,再加入培養(yǎng)基80 μL。倒置顯微鏡觀察細胞貼壁后,加入不同濃度的莽草酸20 μL,使其終濃度為25、50、100 μg·mL-1,再置于 37 ℃、5% CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)24,48,72 h。每個濃度設4個復孔。終止培養(yǎng)后每孔加入20μL MTT溶液,繼續(xù)培養(yǎng)4 h后吸取上清液,用PBS溶液沖洗3次后,加入150 μL DMSO,振蕩,充分溶解結晶,用酶聯(lián)免疫檢測儀測定490 nm處各孔的吸光度(A值)。細胞增殖抑制率的計算同文獻[9]。

2.3流式細胞術 取對數(shù)生長期的人肝癌HepG-2細胞,用含10%胎牛血清的培養(yǎng)基制備成濃度為3×105個·mL-1的細胞懸液,于6孔板中每孔接種1 mL。將平板置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后加入黃芩苷(終濃度為25、50、100 μg·mL-1),48 h后收集細胞,按Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑說明書處理樣品。實驗重復3次。

2.4免疫細胞化學法檢測 爬片準備同文獻[10]。檢測操作:取出藥物處理后的HepG-2細胞爬片,95%乙醇室溫固定30 min;3 %H2O2-甲醇,室溫孵育20 min,消除內源性過氧化物酶活性;0.1% Tritonx-100室溫孵育30 min,利于抗體進入細胞;10%正常山羊血清室溫孵育20 min,封閉非特異性抗原;傾去血清,加入50 μL一抗,使其完全覆蓋細胞,置于濕盒內,4 ℃過夜;加入50 μL二抗,37 ℃,40 min;加入50 μL三抗,37 ℃,20 min;DAB顯色,顯微鏡下觀察,至陽性顯色明顯時用自來水沖洗,逐級脫色、透明、中性樹膠封片。

光鏡下觀察圖片,實驗結果采用Image Pro Plus軟件進行灰度值分析。光鏡下連續(xù)觀察5個視野,得出灰度值,取均值,計算其陽性率。

2.5Western Blot 收集細胞,1500 r/min離心5 min,PBS再洗2次。加入100 μL細胞裂解液,渦旋后放入冰中裂解90 min。4 ℃ 12000 r/min離心10 min,收集上清液。用Bradford法測定蛋白含量,各組取等量蛋白進行10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠,常規(guī)電泳,轉膜,膜用含5%脫脂奶粉TBST 4 ℃封閉非特異結合位點2 h,將膜與稀釋的一抗4 ℃冰箱中孵育過夜,TBST液充分洗膜3次,每次振搖10 min。再與二抗室溫孵育2 h。沖洗未結合二抗,TBST搖洗3次,每次8 min。取出NC膜加入顯色劑閉光顯色,顯色后凝膠成像系統(tǒng)照相并用密度分析軟件對蛋白含量進行定量。實驗重復3次。

3 結果

3.1黃芩苷對HepG-2細胞抑制作用比較 不同組別對HepG-2細胞具有抑制作用,隨著濃度的增加和時間的延長,抑制作用明顯增強(P<0.05)。如表1所示。

表1 不同濃度黃芩苷對不同時間點HepG-2細胞的抑制作用比較

3.2黃芩苷對HepG-2細胞抑制率比較分析 隨著濃度的不斷增加,以及作用時間的延長,黃芩苷對HepG-2細胞的抑制率逐漸上升(P<0.05)。如表2所示。

3.3流式細胞術觀察細胞凋亡結果 實驗結果顯示,對照組、黃芩苷25 μg·mL-1、50 μg·mL-1、100 μg·mL-1早期凋亡率分別為1.01%、6.91%、8.06%、9.71%。如圖1所示?？梢?黃芩苷可誘導HepG-2細胞發(fā)生凋亡,且隨著濃度的增加凋亡率更高。

表2 不同濃度黃芩苷對HepG-2細胞抑制率比較分析(n=4,%)

3.4不同濃度黃芩苷對凋亡相關基因Bcl-2、Bax的影響比較 不同濃度黃芩苷作用于HepG-2細胞,可抑制Bcl-2的表達,降低其濃度,并且顯著低于對照組(P<0.05);不同濃度的黃芩苷作用于HepG-2細胞,可使Bax表達上升,明顯高于對照組(P<0.05)。黃芩苷對HepG-2細胞凋亡相關基因Bcl-2、Bax的影響呈現(xiàn)出劑量依賴關系。如下表3、圖2、圖3所示。

表3 不同濃度黃芩苷對凋亡相關基因Bcl-2、Bax的影響比較

注:A.對照組;B.低劑量組;C.中劑量組;D.高劑量組

注:A.對照組;B.低劑量組;C.中劑量組;D.高劑量組

注:A.對照組;B.低劑量組;C.中劑量組;D.高劑量組

3.5Western Blot 如圖4所示,對照組均表達一定量的Bax、Bcl-2蛋白,藥物作用后,可明顯上調HepG-2細胞中Bax表達,降低抑制凋亡蛋白Bcl-2的表達,且Bax、Bcl-2在濃度100 μg·mL-1時的變化比在其它兩個濃度時作用更明顯。

注：A.對照組;B.低劑量組;C.中劑量組;D.高劑量組

4 討論

目前,臨床對肝癌的發(fā)病機制并未明確,但仍舊在不斷深入研究[11-12]。細胞凋亡是機體保持穩(wěn)態(tài)的一種方式。腫瘤細胞在擴散轉移、生長的過程中,細胞死亡有著十分重要的影響[13-14]。現(xiàn)階段,臨床對于抑制劑抑制能力強弱的評定中,一般將抑制率50%作為對比指標,所謂抑制率50%,指的是抑制劑使用后,細胞數(shù)量減少1/2所需的抑制劑濃度[15-16]。本研究中,黃芩苷對HepG-2細胞抑制作用和抑制率實驗顯示,50 μg·mL-1濃度,作用48 h抑制率為50.32%,接近臨床采用的50%標準。由此可以看出,該濃度、該作用時間點時,對HepG-2細胞凋亡的抑制作用最強。細胞凋亡首先表現(xiàn)為形態(tài)學的改變,尤其是細胞核形態(tài)學改變?yōu)橥怀鎏卣?因此在判定時對細胞形態(tài)學進行觀察。本研究中,使用流式細胞術對細胞凋亡率進行觀察,結果顯示黃芩苷誘導了HepG-2細胞凋亡的發(fā)生[17-18]。

研究指出,細胞凋亡的觸發(fā),是一個級聯(lián)式過程,多種基因參與其中,并對藥物誘導細胞凋亡產生影響[19-20]。在細胞凋亡過程中,Bcl-2發(fā)揮著十分重要的作用,也被認為是最具代表性的抑制和促凋亡基因[21-22]。Bax是Bcl-2活性的主要調控因子,自身形成同源二聚體,若細胞內的Bcl-2濃度較高,Bax的異源二聚體增加,凋亡的趨勢會減弱;若Bax較多時,則Bax本身形成的同源二聚體占主導,更容易發(fā)生細胞凋亡[23-24]。免疫細胞化學法檢測是Bcl-2、Bax測定的常見方法,在臨床上已被廣泛使用,具有較高的測定價值[25-26]。本研究結果中,與對照組相比,人肝癌HepG-2細胞中Bcl-2、Bax蛋白的表達具有顯著性差異(P<0.05),不同濃度黃芩苷作用后顯示,隨著濃度的增加,Bcl-2的表達水平下降,Bax表達水平上升,這一結果印證了黃芩苷具有協(xié)同增敏作用,促進人肝癌HepG-2細胞凋亡,這可能是其抑制癌癥作用的重要分子機制之一。

綜上所述,人肝癌HepG-2細胞凋亡過程中,黃芩苷發(fā)揮著十分重要的作用,通過對細胞形態(tài)學和分子水平的變化探究,認為這一凋亡機制可能與下調基因Bcl-2,上調Bax蛋白水平有關。