鄧丹萍 謝天喜 劉向儒 孫志 薛連平 周勝楠何平 曾祥嵩 唐曉濤 方艷琳 陳路軍 彭小飛

(1.郴州市中醫(yī)醫(yī)院,湖南 郴州 423000;2.鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院,河南 鄭州 450052)

截至2022年7月20日,全球新型冠狀病毒肺炎(Corona virus disease 2019,COVID-19)確診病例累計已超過5.6267億例,死亡病例累計超636.8萬例,全球疫情仍處于高位,病毒還在不斷變異,對全球人民健康生命造成了極大的威脅[1]。新型冠狀病毒傳播速度快、傳染性強(qiáng),可經(jīng)呼吸道飛沫和密切接觸傳播[2]。中醫(yī)在這場防治疫情的戰(zhàn)爭中發(fā)揮著積極作用,在全國抗疫的全鏈條、全過程、全周期的不同階段都取得了成效[3]。

新型冠狀病毒肺炎屬于中醫(yī)疫病范疇,以人群普遍易感、聚集性發(fā)病、癥狀類似等為特點,多為輕型和普通型。國家衛(wèi)健委和中醫(yī)藥管理局在《新型冠狀病毒感染的肺炎診療方案(試行第九版)》[4]中將COVID-19輕型分為寒濕郁肺、濕熱蘊(yùn)肺,普通型分為濕毒郁肺、寒濕阻肺、疫毒夾燥,病因病機(jī)指導(dǎo)“濕邪”為患。吳鞠通在《溫病條辨》云[5]:“頭痛惡寒,身重疼痛,舌白不渴,脈弦細(xì)而濡,面色淡黃,胸悶不饑,午后身熱,狀若陰虛,病難速已,名曰濕溫。汗之則神昏耳聾,甚則目瞑不欲言,下之則洞泄,潤之則病深不解,長夏深秋冬日同法,三仁湯主之?！?/p>

郴州市中醫(yī)醫(yī)院(以下簡稱我院)第一時間與郴州市定點醫(yī)院組成中醫(yī)協(xié)同救治小組,對湘南地區(qū)確診的40例病人均采取中醫(yī)藥協(xié)同治療,其中34例病人使用三仁湯,均已治愈出院,無重癥[6]。三仁湯由薏苡仁、苦杏仁、白豆蔻、厚樸、滑石、通草、淡竹葉、法半夏8味中藥組成,治療濕溫病初起,邪在氣分,濕重于熱,以上焦為中心而彌漫三焦、郁阻表里之證,治法為宣暢氣機(jī)、清熱利濕。

UHPLC-Q-Orbitrap HRMS技術(shù)集液相色譜的高分離能力與質(zhì)譜的高靈敏度,強(qiáng)專屬性于一體,近年來廣泛用于藥物成分的分析,該法可獲得更詳細(xì)的分子結(jié)構(gòu)信息,使藥物微量成分的分析成為可能[7]。UHPLC-Q-Orbitrap HRMS技術(shù)可以快速識別復(fù)雜方劑中的各類化學(xué)成分,對進(jìn)一步的藥效學(xué)和藥動力學(xué)研究具重要意義[8]。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)[9]基于系統(tǒng)生物學(xué)的理論,構(gòu)建“多成分-多靶點-多途徑”的中藥網(wǎng)絡(luò),對揭示中藥復(fù)方的潛在作用機(jī)制具有巨大貢獻(xiàn)。

目前新型冠狀病毒3CL水解酶和ACE2已為藥物開發(fā)的熱點靶標(biāo)[10-11]。本研究在三仁湯的臨床實效性基礎(chǔ)上,使用UHPLC-Q-Orbitrap HRMS技術(shù)鑒定三仁湯的化學(xué)成分,再經(jīng)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究,探索三仁湯治療COVID-19的潛在作用機(jī)制,為該復(fù)方治療新型冠狀病毒肺炎提供理論支撐。

1 儀器與試劑

1.1儀器 UHPLC-Q-Orbitrap液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng):Ultimate 3000超高效液相色譜儀(美國Dionex公司),Q Exactive型高分辨質(zhì)譜(美國Thermo Fisher Scientific公司);AL104型萬分之一分析天平(瑞士Mettler Toledo上海有限公司);KQ-250DB型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

1.2藥材與試劑 藥材為三仁湯:參照吳鞠通《溫病條辨》[5]原方比例,組成為苦杏仁15 g,厚樸6 g,滑石18 g,白豆蔻6 g,通草6 g,淡竹葉6 g,薏苡仁18 g,法半夏15 g(以上藥物購自華潤三九鄭州公司);試劑包括甲醇、乙腈、甲酸均為色譜純(產(chǎn)自美國fisher公司)。

2 實驗方法

2.1色譜及質(zhì)譜條件

2.1.1色譜條件 色譜柱:ACQUITY UPLC?BEH C18柱(2.1×100 mm,1.7 μm);流動相:0.1%甲酸水溶液(A),乙腈(B);梯度程序為:0～4.0 min,5%B;4.0～51 min,5%B～100%B;51～56 min,100%B;56～56.2 min,100%B～5%B;56.2 min～60 min,5%B。柱溫40 ℃,進(jìn)樣器溫度4 ℃,進(jìn)樣量5 μL,流速0.2 mL·min-1。

2.1.2質(zhì)譜條件 采用UHPLC-Q-Exactive液質(zhì)聯(lián)用儀進(jìn)行樣品分析,離子源為HESI源(heated ESI),離子傳輸管溫度320 ℃,輔助氣溫度為300 ℃,鞘氣、輔助氣的體積流量分別為45、15 μL·min-1;檢測方式采用正負(fù)離子Full MS/dd-MS2模式,其中一級全掃描的分辨率為70000 FWHM,數(shù)據(jù)依賴的二級掃描分辨率為17500 FWHM,碰撞能梯度為20、40、60 eV,質(zhì)荷比窗口寬度設(shè)置為2,質(zhì)量掃描范圍80～1200 m/z。

2.2供試品溶液的制備取三仁湯0.5 g溶于20 mL甲醇,超聲提取20 min,4°離心機(jī)6000 r/min,離心10 min,取上清液,0.22 μm微孔濾膜濾過,待用。

2.3化合物結(jié)構(gòu)分析 根據(jù)“2.1”下的色譜、質(zhì)譜條件進(jìn)樣,根據(jù)高分辨質(zhì)譜提供的準(zhǔn)分子、離子和加荷離子信息推測得到化合物的精確相對分子質(zhì)量,用Xcalibur 4.0軟件對分子式進(jìn)行初步擬合,再根據(jù)質(zhì)譜提供的保留時間以及碎片離子信息,對樣品中化學(xué)成分進(jìn)行準(zhǔn)確識別。

2.4網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析

2.4.1三仁湯活性成分及靶點的篩選 在PubChem數(shù)據(jù)庫中下載質(zhì)譜法定性得到的37個化合物的2D結(jié)構(gòu),導(dǎo)入Swiss ADME網(wǎng)站進(jìn)行篩選,通過篩選的化合物在Swiss Target Prediction平臺預(yù)測潛在靶點。

2.4.2新型冠狀病毒肺炎相關(guān)靶點的篩選 基于Gene Cards數(shù)據(jù)庫,以“COVID-19”為關(guān)鍵詞,獲取COVID-19相關(guān)的疾病靶點。

2.4.3“藥物-活性成分-靶點-疾病”網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 將上述得到的藥物靶點和疾病靶點各自刪除重復(fù)后,在Draw Venn Diagram網(wǎng)站生成韋恩圖,得到三仁湯和COVID-19共同作用的靶點。將三仁湯的活性成分設(shè)為drug,COVID-19設(shè)為disease,上述得到的交集基因設(shè)為gene,建立Network和Type文件,并分別導(dǎo)入到Cytoscape 3.7.2軟件中構(gòu)建“藥物-成分-靶點-疾病”網(wǎng)絡(luò)。

2.4.4PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 將上述得到的共有靶點導(dǎo)入STRING(https:/string-db.org/cgi/input.pl)數(shù)據(jù)庫構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò),蛋白種屬為“homo sapiens”,置信度為0.4,其他參數(shù)不變,得到蛋白相互作用關(guān)系的網(wǎng)絡(luò)圖,下載TSV格式。將該TSV文件導(dǎo)入到Cytoscape 3.7.2軟件,并使用cytoHubba功能進(jìn)行拓?fù)浞治?獲得核心靶點的PPI網(wǎng)絡(luò)圖。

2.4.5GO與KEGG富集分析 將三仁湯防治COVID-19的交集靶點上傳到Metascape平臺中進(jìn)行GO和KEGG富集分析,設(shè)定參考值P<0.05、富集因子>1.5、最小計數(shù)值為3。最后在微生信(http://www.bioinformatics.com.cn/)網(wǎng)站進(jìn)行GO和KEGG富集分析可視化。

3 結(jié)果

3.1三仁湯化學(xué)成分的定性研究 采用UHPLC-Q-Orbitrap HRMS,按“2.1”項中的檢測條件檢測供試品溶液并對三仁湯中的化學(xué)成分進(jìn)行分析,得到正離子模式與負(fù)離子模式下的總離子流圖(TIC),結(jié)果見圖1、圖2。通過查閱中英文文獻(xiàn)與相關(guān)數(shù)據(jù)庫,收集單味藥材的化學(xué)成分信息,建立本研究的化學(xué)成分?jǐn)?shù)據(jù)庫。使用Xcalibur4.0軟件對供試品進(jìn)行一級質(zhì)譜分析,確定其分子離子峰,并結(jié)合精確相對分子質(zhì)量初步擬合其分子式。在此基礎(chǔ)上,根據(jù)二級質(zhì)譜得到化合物的碎片離子信息,從三仁湯中鑒定了37種化學(xué)成分,見表1。

圖1 正離子模式下供試品溶液的總離子流色譜圖

圖2 負(fù)離子模式下供試品溶液的總離子流色譜圖

3.2三仁湯網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析

3.2.1三仁湯活性成分及靶點的篩選 將質(zhì)譜法定性出37個化合物進(jìn)行Swiss ADME 篩選。標(biāo)準(zhǔn)為Pharmacokinetics項目中GI absorption為“High”,Druglikeness項中滿足兩個指標(biāo)為“Yes”,共有26個化合物通過,將以上26個化合物的Canonical SMILES號導(dǎo)入Swiss Target Prediction在線網(wǎng)站,下載活性化合物潛在靶點表格,并設(shè)置Probability≥0為篩選條件,得到22個化合物、533個三仁湯潛在作用靶點。

3.2.2COVID-19靶點基因篩選 在Genen Cards數(shù)據(jù)庫中,以“COVID-19”為關(guān)鍵詞,設(shè)置relevance score≥30為篩選條件,得到COVID-19靶點482個。

3.2.3“藥物-活性成分-靶點-疾病”網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 將533個活性成分靶點基因與482個COVID-19靶點基因?qū)隓raw Venn Diagram(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/)在線網(wǎng)站,生成韋恩圖(見圖3),得交集靶點58個。

圖3 三仁湯與COVID-19交集靶點的韋恩圖

借助Cytoscape 3.7.2軟件進(jìn)行蛋白網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)可視化處理,構(gòu)建“中藥-活性成分-靶點-疾病”網(wǎng)絡(luò),網(wǎng)絡(luò)中共有82個節(jié)點:化合物22個,靶點58個,中藥1個,疾病1個,225條相互作用的邊,見圖4。

圖4 “中藥-活性成分-靶點-疾病”網(wǎng)絡(luò)圖

利用插件進(jìn)行拓?fù)鋵W(xué)分析,節(jié)點越大,度值(degree)越大,排名前五的化合物為光甘草定(Glabridin)、油酸(Oleic acid)、厚樸酚(Magnolol)、木蘭花堿(Magnoflorine)、亞麻酸(Linolelaidic acid)。

3.2.4PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 將上述得到的58個共有靶點導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò),蛋白種屬為“homo sapiens”,置信度為0.4,隱藏沒有關(guān)聯(lián)的3個靶點,其他參數(shù)不變,得到蛋白相互作用關(guān)系的網(wǎng)絡(luò)圖,下載TSV格式。將該TSV文件導(dǎo)入到Cytoscape 3.7.2軟件,并使用cytoHubba插件進(jìn)行拓?fù)浞治?可視化結(jié)果如圖5。節(jié)點越大,顏色越深,越靠近中心代表degree值越高。

圖5 三仁湯治療COVID-19的PPI網(wǎng)絡(luò)圖

3.2.5三仁湯治療COVID-19靶點富集分析 將三仁湯治療COVID-19的58個相關(guān)靶點上傳到Metascape平臺中進(jìn)行KEGG和GO富集分析,設(shè)定參考值P<0.05、富集因子>1.5、最小計數(shù)值為3。KEGG富集分析篩選得出118個條目,見圖6?？v軸表示通路名稱,橫軸表示富集因子,氣泡面積大小表示該通路上基因富集的數(shù)目。上述核心靶點參與的生物學(xué)過程主要包括HIF-1信號通路(HIF-1 signaling pathway)、基化終產(chǎn)物及其受體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路(AGE-RAGE signaling pathway)、癌癥信號通路(Pathways in cancer)、抗EGFR酪氨酸激酶抑制劑(EGFR tyrosine kinase inhibitor resistance)、PI3K-Akt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路(PI3K-Akt signaling pathway)、化學(xué)致癌受體激活(Chemical carcinogenesis receptor activation)、冠狀病毒疾病——COVID-19(Corona virus disease-COVID-19)等。

GO功能富集分析篩選得出551個條目,其中生物過程(Biological process,BP)條目402個,細(xì)胞組成(Cellular component,CC)條目68個,分子功能(Molecular function,MF)相關(guān)條目81個,分別取BP、CC、MF前5條在微生信(http://www.bioinformatics.com.cn/)網(wǎng)站進(jìn)行可視化,見圖7。生物過程主要集中在(Positive regulation of cell migration)、炎癥反應(yīng)(Inflammatory response)、白細(xì)胞遷移的調(diào)節(jié)(Regulation of leukocyte migration)等,細(xì)胞組成主要集中在細(xì)胞外基質(zhì)(Extracellular matrix)、膜筏(Membrane raft)、囊腔(Vesicle lumen)等,分子功能主要集中在肽酶的活動(Peptidase activity)、病毒受體的活動(Virus receptor activity)和蛋白酶綁定(Protease binding)等。

圖6 三仁湯治療COVID-19的核心靶點KEGG信號通路富集分析

圖7 三仁湯治療COVID-19的核心靶點GO信號通路富集分析

4 討論

此次抗擊疫情過程中,中醫(yī)藥全程深度介入治療,充分證明了中醫(yī)藥在疫情防治中的重要作用,凡是中醫(yī)藥參與治療的確診患者,治愈率高、死亡率低[12-13]。COVID-19起病隱匿,傳變迅速,纏綿難愈。近年來,諸多文獻(xiàn)研究本次疫病的成因為濕、毒、瘀、燥,強(qiáng)調(diào)“濕邪”貫穿于疾病的始終[14-15]。三仁湯重在上中下三焦分消濕濁,輔以甘寒,化濕而不傷陰,清熱而不傷中土[16]。該方以苦杏仁之宣降開水之上源“氣化則濕亦化”;豆蔻仁、厚樸、法半夏辛開苦降,溫運(yùn)中州,恢復(fù)脾胃升降以助運(yùn)化;薏苡仁、淡竹葉、滑石、通草淡滲于下,使?jié)裥皬男”愣17]。三焦同治,使?jié)駸嵘舷路窒?肺氣得以宣肅。

本研究采用UHPLC-Q-Orbitrap HRMS技術(shù)對三仁湯中的化學(xué)成分進(jìn)行分析,鑒定了37種化學(xué)成分。采用中藥網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法,將質(zhì)譜法定性出37個化合物及靶標(biāo)進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)分析,得到22個化合物、533個三仁湯潛在作用靶點。將三仁湯533個活性成分靶點基因與482個COVID-19靶點進(jìn)行交集,得到82個節(jié)點:靶點58個,化合物22個,中藥1個,疾病1個,225條相互作用的邊,靶點主要涉及了病毒感染、免疫調(diào)節(jié)、細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)等方面,其中出現(xiàn)頻次較高的有血管內(nèi)皮生長因子(AVEGFA)、表皮生長因子受體(EGFR)、白細(xì)胞介素6(IL-6)、蛋白激酶(AKT1)、原癌基因(JUN)、細(xì)胞間黏附分子-1(ICAM1)等。VEGFA是一種與血管和神經(jīng)生成有關(guān)的神經(jīng)營養(yǎng)因子;EGFR與腫瘤細(xì)胞的增殖、血管生成、腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移及細(xì)胞凋亡的抑制有關(guān);IL-6是活性較強(qiáng)的炎癥因子,與腫瘤生長、血管形成和免疫調(diào)節(jié)等反應(yīng)密切相關(guān),且IL-6與肺損傷的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[18];AKT1參與包括細(xì)胞凋亡和葡萄糖代謝在內(nèi)的細(xì)胞過程,與癌癥的發(fā)生有關(guān);ICAM1參與細(xì)胞的識別,細(xì)胞的活化和信號轉(zhuǎn)導(dǎo),細(xì)胞的增殖與分化,細(xì)胞的伸展與移動,與免疫應(yīng)答、炎癥發(fā)生、凝血、腫瘤轉(zhuǎn)移以及創(chuàng)傷愈合等有關(guān)[19-22]。

三仁湯對COVID-19的治療通過GO富集分析得到了551條(P<0.05)信號通路,KEGG富集分析得到了118條(P<0.05)信號通路。其中基因數(shù)目在與炎癥反應(yīng)及肺損傷保護(hù)相關(guān)的多條通路上富集較多,主要包括:HIF-1信號通路(HIF-1 signaling pathway)、基化終產(chǎn)物及其受體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路(AGE-RAGE signaling pathway)、癌癥信號通路(Pathways in cancer)、抗EGFR酪氨酸激酶抑制劑(EGFR tyrosine kinase inhibitor resistance)、PI3K-Akt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路(PI3K-Akt signaling pathway)、化學(xué)致癌受體激活(Chemical carcinogenesis- receptor activation)、冠狀病毒疾病——COVID-19(Corona virus disease-COVID-19)、細(xì)胞衰老(Cellular senescence)、腫瘤的轉(zhuǎn)移(Transcriptional misregulation in cancer)等,與冠狀病毒、SARS-CoV-2、人巨細(xì)胞病毒、甲型流感、乙型肝炎病毒感染相關(guān)。例如:HIF-1信號通路在免疫性炎癥、病毒感染、細(xì)菌感染、巨細(xì)胞代謝等炎性疾病中起重要作用[23];抗EGFR酪氨酸激酶抑制劑與炎癥因子相關(guān),對間質(zhì)性肺病的預(yù)防和治療提供依據(jù)[24];PI3K-Akt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路使細(xì)胞周期維持運(yùn)行,是抑制細(xì)胞凋亡,促進(jìn)細(xì)胞生長增殖的重要因素[25-26];冠狀病毒疾病——COVID-19則與COVID-19的治療密切相關(guān)。

綜上所述,本研究基于UHPLC-Q-Orbitrap HRMS技術(shù)對三仁湯的成分進(jìn)行系統(tǒng)分析,能夠充分表征三仁湯的藥效物質(zhì);三仁湯可通過多靶點、多通路達(dá)到對新型冠狀病毒肺炎的治療作用。