廖桂花 段 鈺 王叢叢 徐明鋒 何春梅蘇凌業(yè) 鄭奕雄
(1.廣東省森林培育與保護(hù)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/廣東省林業(yè)科學(xué)研究院,廣東 廣州 510520;2.廣州市特色作物種質(zhì)資源研究與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院 農(nóng)業(yè)與生物學(xué)院,廣東 廣州 510225)
赪桐Clerodendrum japonicum是馬鞭草科Verbenaceae 大青屬[1]多年生落葉或常綠灌木[2],又名貞桐花﹑百日紅﹑耐久朋﹑荷苞花,主要分布于我國(guó)江蘇﹑浙江南部﹑江西南部﹑湖南﹑福建﹑臺(tái)灣﹑廣東﹑廣西﹑四川﹑貴州﹑云南等;國(guó)外分布于印度東北﹑孟加拉﹑錫金﹑不丹﹑中南半島﹑馬來(lái)西亞﹑日本等地區(qū)[1]。赪桐在中國(guó)栽培歷史悠久,中唐時(shí)期曾被引種至洛陽(yáng)[3]。中國(guó)的赪桐屬植物主要集中在華南地區(qū)和西南地區(qū),共有34 種[4]。其氣微味甘,全株可入藥用,是一種傳統(tǒng)的民間中藥材[5],在傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中,常用其治療上呼吸道感染﹑腹瀉﹑皮膚病﹑肺炎﹑咳嗽﹑發(fā)燒和結(jié)膜炎等病癥[6]。赪桐花冠高腳碟狀,朱紅色,先端5 裂,裂片不整齊;花萼紅色﹑花柱細(xì)長(zhǎng)﹑花期長(zhǎng),是優(yōu)良的鄉(xiāng)土景觀植物[5,7]。當(dāng)前,省委深入綠美廣東生態(tài)建設(shè),對(duì)鄉(xiāng)土景觀植物和林下高經(jīng)濟(jì)價(jià)值植物的開發(fā)應(yīng)用成為熱點(diǎn),本文旨在綜述赪桐藥理活性﹑化學(xué)成分﹑繁殖方法﹑分子生物學(xué)特征﹑經(jīng)濟(jì)價(jià)值﹑產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用等研究進(jìn)展,為赪桐栽培育種和資源開發(fā)利用提供參考。
赪桐已被廣泛用于傳統(tǒng)醫(yī)藥研究,《中華本草》[8]中提到其全株均可入藥,花可安神﹑止血,主治心悸失眠﹑痔瘡出血;葉具有祛風(fēng)散瘀﹑解毒消腫等功效,主治偏頭痛﹑跌打瘀腫﹑癰腫瘡毒;根﹑莖可清肺熱﹑利小便﹑涼血止血;臨床用于肺熱咳嗽﹑熱淋﹑小便不利﹑咳血﹑尿血﹑痔瘡出血﹑風(fēng)濕骨痛的治療。其中,《中華本草》[9]傣藥卷記載其具有清火解毒﹑涼血止血﹑通乳下乳﹑調(diào)經(jīng)止痛﹑提氣固脫﹑強(qiáng)筋壯骨之功效,可用于治療小便熱澀疼痛﹑睪丸腫痛﹑赤白下痢﹑胸悶﹑胸痛﹑月經(jīng)失調(diào)﹑子宮脫垂﹑脫肛﹑腰膝酸痛等[5]。《海南藥用植物名錄》記載赪桐具有清熱利濕﹑消腫拔毒﹑調(diào)經(jīng)散瘀功效,主治肺熱咳嗽﹑痔瘡出血﹑痢疾﹑風(fēng)濕骨痛﹑腰肌勞損等疾病[10]。廣西壯族民間老中醫(yī)秦祥仁組方曾謹(jǐn)遵《黃帝內(nèi)經(jīng)》,總結(jié)出治療咽喉急性疾病的“赪銀合劑”組方,具有能顯著改善風(fēng)熱型急性扁桃體炎的臨床藥用功效[11]。
赪桐雖然藥用歷史悠久,但其藥理機(jī)制研究尚未深入。實(shí)驗(yàn)證明,赪桐提取物具有抗炎﹑抗菌﹑抗補(bǔ)體﹑抗腫瘤等作用,在藥學(xué)應(yīng)用方面潛力較大。
1.2.1 抗炎作用 研究表明,赪桐具有抗炎﹑消炎能力。赪桐根多個(gè)部位提取物,均表現(xiàn)出抗炎活性[12],對(duì)致炎物質(zhì)誘發(fā)的急性炎癥具有抑制作用[13],其中石油醚部位抗炎作用最明顯[12]??寡鬃饔脵C(jī)理主要是通過調(diào)節(jié)一些炎癥影響因子的合成與釋放,通過降低炎癥因子水平﹑從而提高SOD 活性[12,14],具體是通過抑制NO﹑TNF-a﹑IL-12﹑IL-6﹑IL-1β 炎癥因子的分泌[15]。而進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),赪桐抗炎作用過程可能不依賴丘腦-垂體-腎上腺軸系統(tǒng)(HPAA),而與降低MDA﹑NO 水平,提高SOD 水平有關(guān)[16];同時(shí)研究發(fā)現(xiàn)赪桐抗炎過程是通過作用于活性物質(zhì)關(guān)聯(lián)的靶點(diǎn)發(fā)揮作用,靶點(diǎn)多為功能性蛋白質(zhì),表現(xiàn)為一條作用通路可涉及多個(gè)靶點(diǎn),一個(gè)靶點(diǎn)可參與多條作用通路[17]。
1.2.2 抗菌作用 據(jù)研究表明,赪桐莖葉提取物中含有抗菌活性物質(zhì),能起到一定的殺菌﹑抗菌作用。赪桐莖葉提取物對(duì)金黃色葡萄球菌﹑傷寒沙門菌和枯草芽孢桿菌3 種供試細(xì)菌均具有抗菌活性,作用機(jī)制是通過破壞菌類的細(xì)胞壁和細(xì)胞膜的完整性及通透性,影響蛋白合成,導(dǎo)致TCA循環(huán)減慢而發(fā)揮抑菌作用。同時(shí),赪桐提取物的抗菌機(jī)理是通過破壞金黃色葡萄球菌細(xì)胞壁和細(xì)胞膜的完整性及通透性,影響蛋白合成,從而導(dǎo)致TCA 循環(huán)減慢而發(fā)揮抑菌作用[18]。
1.2.3 抗補(bǔ)體作用 赪桐是一種含有抗補(bǔ)體活性物質(zhì)的植物,赪桐醇提取物有較強(qiáng)的經(jīng)典途徑抗補(bǔ)體活性。補(bǔ)體系統(tǒng)具有抗感染功能,激活后能消滅外來(lái)微生物并清除機(jī)體內(nèi)不正常的細(xì)胞和組織,因此抗補(bǔ)體作用與免疫功能密切關(guān)聯(lián),能通過抑制補(bǔ)體過度釋放而避免引發(fā)炎癥[19]。
1.2.4 抗腫瘤作用 環(huán)五肽化合物具有抗腫瘤作用[20],研究發(fā)現(xiàn),赪桐地上部分提取物中的環(huán)狀五肽化合物中的4 種化合物對(duì)4 種人類癌細(xì)胞系(T24﹑A549﹑HepG2﹑MGC-803)顯示出微弱的細(xì)胞毒性[21],推斷出赪桐含抗腫瘤活性物質(zhì)。
赪桐的黃酮類﹑甾體﹑香豆素﹑三萜類等成分含量較高,個(gè)別成分類型的化合物數(shù)量也居多(表1)。目前,已分離鑒定出赪桐地上部分化合物17 個(gè)[2]。張樹琳等對(duì)赪桐的地上部分提取物進(jìn)行分離,得到16 個(gè)單體化合物及1 對(duì)差向異構(gòu)體[22]。另外,對(duì)其枝條﹑樹皮﹑葉片材料分離鑒定出35 個(gè)化合物[23],包括4 個(gè)環(huán)五肽,3 個(gè)木脂素類,4 個(gè)苯乙醇苷芳香醇,9 個(gè)萜類和其他類化合物。
表1 赪桐主要化學(xué)成分Table 1 C. japonicus main chemical composition
2.1.1 黃酮類化合物 赪桐黃酮類化合物含量豐富,主要含小麥黃素[24]﹑山奈酚[2]﹑高車前素[2]﹑木犀草素[2]﹑木犀草苷[2]﹑毛蕊花糖苷[25]等成分。黃酮類化合物具有抗病毒﹑抗氧化﹑抗炎﹑抗菌﹑抗補(bǔ)體等活性,廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥方面[26]。
2.1.2 甾體化合物 赪桐主要含22,23-二氫菠甾醇[24]﹑豆甾醇[24]﹑25,26-去氫豆甾醇[24]﹑甾醇[27]等甾體化合物成分。植物化學(xué)分離出的甾體和甾體生物堿皂苷具有多種藥理活性,如細(xì)胞毒﹑抗病毒﹑抗炎和抗真菌特性[28]。
2.1.3 香豆素化合物 赪桐含6-甲氧基-2H-色烯-2-酮等香豆素類化合物。香豆素類化合物是自然界中一類重要的化合物,具有抗腫瘤﹑抗凝血﹑抗菌﹑殺蟲等多種生物活性,應(yīng)用領(lǐng)域廣泛[29]。
2.1.4 三萜化合物 赪桐主要含烏索酸[24]﹑木栓酮[2]等三萜類化合物。三萜類化合物是一類結(jié)構(gòu)豐富﹑種類繁多的天然活性成分,廣泛存在于各類植物﹑菌類﹑蕨類及海洋生物中,具有顯著的抗炎﹑抗腫瘤﹑抗病毒及免疫調(diào)節(jié)等藥理活性[30]。
2.1.5 苯丙素苷化合物 赪桐含monoacetyl﹑martinoside﹑acteoside﹑clerodenoside A 等 化 合 物[24]。苯丙素苷具有抗病毒﹑抗腫瘤﹑抗真菌﹑抗高血壓﹑糖尿病等潛在活性和改善免疫功能的作用[31]。
2.1.6 揮發(fā)性化合物 田雯等[32]鑒定出赪桐地上部分的石油醚提取物含有油酸﹑亞麻酸甲酯﹑棕櫚酸甲酯﹑亞油酸甲酯﹑新植二烯﹑六氫法尼基丙酮﹑葉綠醇及維生素E等21 種揮發(fā)性化合物。
2.1.7 其他化合物 赪桐含有丁二酸酐[24]﹑金合歡素[2]﹑類葉升麻苷[17]及咖啡酸[25];另外可能含有蛋白質(zhì)[27]﹑糖[27]﹑鞣質(zhì)[27]﹑有機(jī)酸[27]﹑皂苷[27]﹑酚類[27]與內(nèi)酯[27]等化學(xué)成分。
秦祖杰等[33]最早建立了赪桐根總黃酮最佳的提取工藝和含量測(cè)定的體系(圖1),采用以蘆丁為對(duì)照品,NaNO2-Al(NO3)3-NaOH 顯色后,用紫外-可見分光光度法測(cè)定赪桐根中總黃酮含量,總黃酮的線性范圍為8.584~51.504 mg/L(r=0.999 4),平均加樣回收率為100.11%,RSD0.24%(n=6);最佳提取工藝為15 倍量50%乙醇超聲提取1.5 h。丘琴等[34]進(jìn)一步豐富赪桐根中總黃酮的提取工藝,通過對(duì)復(fù)合酶的用量﹑酶解溫度﹑酶解時(shí)間3 個(gè)自變量各水平的多元線性回歸及二項(xiàng)式擬合。用星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法選取最佳的提取工藝,并進(jìn)行預(yù)測(cè)分析,同樣以蘆丁為對(duì)照,結(jié)果顯示赪桐根總黃酮最佳提取工藝為酶的用量(0.35%)﹑酶解溫度(62℃)﹑酶解時(shí)間(125.7 min),總黃酮含量的預(yù)測(cè)值為10.37 mg/g。
圖1 赪桐根中總黃酮最佳的提取工藝流程Figure1 The optimum extraction process of total flavonoids from the root of C. japonicus
張樹琳等[22]采用色譜分離技術(shù),對(duì)赪桐乙醇提取物化學(xué)成分進(jìn)行系統(tǒng)的分離純化并進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定。用95%乙醇對(duì)赪桐干燥的地上部分進(jìn)行提取,利用反相柱色譜和半制備型HPLC,得到兩種先前未描述的化合物[21]。丘琴等[25]通過HPLC法,建立了測(cè)定赪桐根3 種不同極性部位咖啡酸﹑毛蕊花糖苷及山柰酚的含量測(cè)定方法。張雅昆等[35]以赪桐中類葉升麻苷的得率為考察指標(biāo),通過單因素試驗(yàn)﹑響應(yīng)面試驗(yàn)﹑神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)法等,有效優(yōu)化赪桐類葉升麻苷的提取工藝。目前已建立不同產(chǎn)地赪桐根75%乙醇提取物HPLC 指紋圖譜,經(jīng)聚類分析和主成分分析均將赪桐根按照成分差異區(qū)分為4 類[36]。柳賢福等[37]研究廣西產(chǎn)赪桐的HPLC 指紋圖譜,并建立含12 個(gè)共有峰的赪桐特征指紋圖譜,研究顯示不同產(chǎn)地赪桐特征圖譜的相似度均>0.9,同時(shí)反映了同一產(chǎn)地赪桐中化學(xué)成分的趨同,并表示可用于赪桐藥材的質(zhì)量控制。
研究表明,赪桐具有較強(qiáng)的耐蔭性及對(duì)弱光的利用能力[38],強(qiáng)光照會(huì)抑制其生長(zhǎng),赪桐在遮蔭條件下表現(xiàn)出更好的生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)[39]。種苗繁育過程中,赪桐對(duì)營(yíng)養(yǎng)元素具有一定的敏感性,合理施肥有助于苗木生長(zhǎng)發(fā)育。目前關(guān)于赪桐種苗繁育技術(shù)的報(bào)道尚少,主要包括扦插繁殖﹑組培繁殖和種子繁殖等。
赪桐莖段芽點(diǎn)繁多,扦插是赪桐繁殖常用的育苗方法。選取無(wú)病蟲害﹑粗細(xì)均勻的一年生赪桐枝條,每個(gè)插穗保留2~3 個(gè)腋芽,插穗下端5 cm埋入混合基質(zhì)育苗杯中。實(shí)驗(yàn)證明,激素能有效地促進(jìn)赪桐插穗生根和壯苗[40]。采用不同濃度梯度NAA 或IBA 植物激素﹑不同浸泡時(shí)間梯度處理赪桐插穗,發(fā)現(xiàn)NAA 或IBA 濃度在100~200 mg/L﹑浸泡30~60 min 效果最佳。
赪桐組培快繁技術(shù)的建立,可以更好的保存擴(kuò)繁優(yōu)質(zhì)種質(zhì)資源。赪桐組培繁殖以嫩芽為外植體;采用75%乙醇和0.1%的升汞溶液進(jìn)行消毒處理,誘導(dǎo)不定芽發(fā)生;最后進(jìn)行增殖和生根培養(yǎng)[41]?;诮M培快繁方法的建立,以切取赪桐無(wú)菌帶葉葉柄為誘導(dǎo)材料,設(shè)置多倍體誘導(dǎo)劑秋水仙素水溶液濃度為20 mg/L 進(jìn)行處理,已獲得赪桐多倍體無(wú)菌苗[42]。
赪桐種子帶有質(zhì)地堅(jiān)硬種殼,影響種子萌發(fā)。實(shí)驗(yàn)證明,破殼處理方法能極顯著地提高赪桐種子發(fā)芽率,發(fā)芽率達(dá)到92%;另外選擇3 cm 播種深度﹑烘焙處理6 h﹑自然水浸泡處理72 h﹑濃度為30 mg/L 的萘乙酸﹑25 mg/L 赤霉素﹑30 mg/L的6-BA 激素浸泡處理等方法,均可提高赪桐種子發(fā)芽率[38]。
在赪桐的常規(guī)育苗實(shí)踐中,一般扦插繁殖最為常用。赪桐生長(zhǎng)1 年以上的木質(zhì)化枝條,具有較好的生根性能。當(dāng)溫度25 ℃﹑濕度70%~75%時(shí),扦插條7~10 天即可萌發(fā)新根,1 年生扦插苗一般繁育成本2~3 元/株。目前,基于赪桐扦插苗繁育技術(shù),按照株距0.3 m×0.3 m 的采穗園種植規(guī)格,每畝每年可采穗條至少22 000 條。在組培繁殖方法中,赪桐莖段和葉片由于具有絨毛,獲取無(wú)菌外植體過程較為困難,原材料損耗較多,組培瓶苗繁育成本4~6 元/株。赪桐組培苗生長(zhǎng)較為緩慢,育苗周期較長(zhǎng)導(dǎo)致成本升高。赪桐的結(jié)實(shí)率較低,種子繁殖方式很少采用,且種子具有堅(jiān)實(shí)的硬殼,導(dǎo)致發(fā)芽率較低,一般不采用種子繁殖進(jìn)行造林育苗。
葉綠體基因組數(shù)據(jù)在系統(tǒng)發(fā)育﹑居群遺傳和譜系地理等研究領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用[43],赪桐葉綠體基因組的獲取對(duì)其種群進(jìn)化分析具有重要意義。赪桐葉綠體基因組長(zhǎng)度為152 171 bp,包括83 415 bp 的大單拷貝區(qū)(LSC)和17 318 bp 的小單拷貝區(qū),由一對(duì)25 719 bp 的反向重復(fù)區(qū)分隔。葉綠體基因組編碼133 個(gè)基因,包括88 個(gè)蛋白質(zhì)編碼基因﹑37 個(gè)tRNA 基因和8 個(gè)rRNA 基因[44]。同時(shí)利用葉綠體基因組信息比對(duì)發(fā)現(xiàn),赪桐與同屬于大青屬Clerodendrum的海通C.mandarinorum和滇常山C.yunnanense兩種植物親緣關(guān)系較密切[45]。
全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)常被應(yīng)用到植物轉(zhuǎn)錄組學(xué)﹑基因組學(xué)﹑代謝組學(xué)和遺傳學(xué)等研究中[46],全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)是赪桐分子生物學(xué)研究的基礎(chǔ)。通過對(duì)赪桐花期不同組織部位進(jìn)行全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序[47],共獲得31 368 條轉(zhuǎn)錄本序列,注釋到30 473個(gè)基因。根據(jù)GO 功能注釋,分別有109 844 條GO 條目參與生物過程,75 764 條參與細(xì)胞組分,28 724 條參與分子功能。通過KEGG 數(shù)據(jù)庫(kù)分析,共有9 681 條序列參與了138 條代謝通路,其中有4 653 條序列參與了43 條次生代謝產(chǎn)物合成路徑。全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組通過注釋,預(yù)測(cè)到CDS 序列31 368個(gè),662 個(gè)轉(zhuǎn)錄因子,5 405 個(gè)跨膜蛋白,6 066 個(gè)SSR,749 個(gè)lncRNA。
在獲得赪桐第三代全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)基礎(chǔ)上,利用RT-qPCR 技術(shù),已篩選出CjUBQ-1 和CjACT-2 為赪桐基因表達(dá)分析的最優(yōu)內(nèi)參基因[48]。理想的內(nèi)參基因應(yīng)在不同處理?xiàng)l件下,以及在各類型細(xì)胞或者組織中均能穩(wěn)定表達(dá),內(nèi)參基因是分析藥用植物主要活性成分生物合成的關(guān)鍵酶基因表達(dá)量需借助的一種參考[49]。生物信息學(xué)在植物生命科學(xué)研究和應(yīng)用中發(fā)揮著重要的作用,常用于植物的基因組﹑轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組等方面信息收集,有助于植物的生理﹑生化和遺傳機(jī)制的探究[50]。赪桐bHLH 和NAC 基因家族生物信息已有報(bào)道[51-52],此外對(duì)赪桐FT 同源基因也開展了相關(guān)生物信息學(xué)分析,并且揭示了赪桐CjFT1 和CjTFL1-2 參與赪桐成花調(diào)節(jié)途徑[53]。
赪桐作為一種適應(yīng)性極強(qiáng)﹑林下觀賞與藥用功能兼?zhèn)涞闹参铮谫Y源挖掘與利用方面具有重要的潛在價(jià)值。林下經(jīng)濟(jì)發(fā)展過程中,耐蔭性灌木不僅具有調(diào)節(jié)環(huán)境溫濕度,塑造林蔭空間結(jié)構(gòu)等多種功能,還可以穩(wěn)定人工林下群落生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定性,在綠美廣東行動(dòng)的林相改造和森林質(zhì)量提升中具有重要作用。另外,赪桐花型奇特﹑圓錐花序大而開展,具有很高的觀賞價(jià)值。赪桐全株可入藥,其總黃酮具有很好的抗炎活性,且不依賴HPAA 系統(tǒng);赪桐總黃酮總抗氧化能力與Vc 相當(dāng),具有良好的抗氧化活性,藥用價(jià)值極高。加強(qiáng)赪桐優(yōu)質(zhì)資源挖掘﹑篩選與鑒評(píng)﹑配套綠色高效育苗技術(shù),對(duì)助力林下經(jīng)濟(jì)發(fā)展具有重要意義。
目前藥用植物研究和發(fā)展至4.0 時(shí)代[54],開展藥用植物種質(zhì)的培育創(chuàng)新是中藥現(xiàn)代化的必由之路[55]。赪桐含有的黃酮﹑甾體﹑香豆素﹑萜類以及揮發(fā)性化合物等,具有良好的消炎﹑抗菌等藥理作用,同時(shí)具有清火解毒﹑治肺熱咳嗽等多種功效。赪桐主要化學(xué)物質(zhì)的提取與測(cè)定,以及葉綠體基因組完整序列和第三代全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的獲取,對(duì)未來(lái)赪桐有效成分利用及藥理活性物質(zhì)代謝生理研究奠定了重要基礎(chǔ)。赪桐作為一種良好的林下藥用植物,主要研究與利用方向還處于初級(jí)階段,主要集中在成分及藥理研究方面,其中黃酮類化合物含有多種生物活性物質(zhì),在食療保健和臨床藥學(xué)等行業(yè)有廣泛的應(yīng)用前景。在抗癌醫(yī)學(xué)治療方面,赪桐地上部分提取物對(duì)人類癌細(xì)胞系表現(xiàn)出細(xì)胞毒性,在抗癌方向研究具有很好的應(yīng)用價(jià)值[21];在植物類殺蟲試劑研發(fā)方面,赪桐石油醚提取物對(duì)斜紋夜蛾具有很好的殺蟲作用,在未來(lái)植物源殺蟲劑研發(fā)方面意義重大[32];在食療保健方面,赪桐干燥根已建立三項(xiàng)相關(guān)中藥飲片質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)[56-58],其中“赪銀合劑”在治療風(fēng)熱型急性扁桃體炎已有臨床應(yīng)用;在云南地區(qū),赪桐的花序被用作林森蔬菜食用[59]。赪桐作為適生性良好的觀賞植物,在園林觀賞和造景綠化方面早有應(yīng)用,利用形式多以在公園片植﹑林下造景等配置方式種植于花壇﹑林下和坡地等,具有生態(tài)美化的作用效果[4]。另外,赪桐目前僅有“狀元紅1 號(hào)”1 個(gè)新品種登記,其新優(yōu)種質(zhì)創(chuàng)制需求隨著園林景觀造景及林下經(jīng)濟(jì)發(fā)展日益增強(qiáng)。針對(duì)赪桐現(xiàn)有國(guó)內(nèi)外利用現(xiàn)狀,在種源性狀調(diào)查﹑優(yōu)質(zhì)資源挖掘及利用等方面均需繼續(xù)深入。