齊軍強，王浩田，葉曉健，許國華*

（1.海軍軍醫(yī)大學第二附屬醫(yī)院，上海 200001；2.上海交通大學醫(yī)學院附屬同仁醫(yī)院，上海 200336）

隨著骨損傷或骨缺損增加，骨組織工程受到了極大的關注。理想的骨修復方案是開發(fā)一種具有良好生物活性和機械性能的生物材料，以保持組織功能［1］。目前，骨修復材料主要依賴于生物陶瓷和聚合物［2］。羥基磷灰石（hydroxyapatite,HA）具有良好生物活性和相容性，常被用于骨修復［3，4］。然而，HA 具有高脆性、無法控制的降解速度等缺點。聚合物具有良好的相容性、韌性和降解性，與細胞外基質的結構和特性類似，和HA 復合后的材料具有與天然骨相匹配的機械性能、可控的降解速度及優(yōu)異的生物活性，因此，HA/聚合物復合材料得到了廣泛研究［3，5，6］。

在骨重塑和愈合過程中，許多生長因子參與成骨細胞和破骨細胞的分化、成熟。骨是一種高度礦化和血管化的組織，成骨和成血管對于骨修復是必不可少的，因此，負載生長因子的骨修復材料得到了廣泛的研究［7，8］。本文對各種HA/聚合物復合材料作為生長因子載體用于骨修復的最新研究進行綜述。

1 載單因子HA/聚合物復合材料

1.1 骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2

骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2（bone morphogenetic proteins-2,BMP-2）是一種在骨發(fā)生、骨誘導、骨修復方面發(fā)揮重要作用的生長因子，可通過Smad1/5/8 信號通路上調堿性磷酸酶（alkaline phosphatase,ALP）、骨鈣蛋白（osteocalcin,OCN） 和骨橋蛋白（osteopontin,OPN）的表達，促進骨髓間充質干細胞（bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs）和成骨細胞的分化。美國食品和藥物管理局已于2002 年11 月批準其臨床使用［9，10］。

由于BMP-2 半衰期短、消失快，靶向緩釋可以減少骨誘導所需的BMP-2 劑量，同時避免大劑量BMP-2 帶來的副作用。Mohammadi 等［11］制備了負載BMP-2 的HA-可降解聚左乳酸復合材料，可實現(xiàn)BMP-2 體外緩釋21 d，皮下異位成骨實驗證實載BMP-2 的材料比未負載BMP-2 的材料更能增強間充質干細胞（marrow mesenchymal stem cells,MSCs）的聚集和初級骨化中心形成。Linh 等［12］通過膠原涂層和BMP-2 偶聯(lián)對HA 支架表面進行改性，支架可實現(xiàn)BMP-2 持續(xù)緩釋，同時顯著提高了脂肪干細胞成骨分化能力，具有良好的促分化能力。Zhao 等［13］通過聚多巴胺涂層將BMP-2 負載于聚乳酸-羥基乙酸/HA 支架上，可實現(xiàn)BMP-2 的緩釋。支架可模擬天然細胞外基質顯著促進MC3T3-E1 細胞的黏附和增殖，使MC3T3-E1 細胞的ALP 活性、成骨相關基因mRNA 表達和鈣沉積均顯著增加。劉勇等［14］將BMP-2 負載于聚多巴胺涂層的絲素蛋白/HA，與BMSCs 共培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，與絲素蛋白/HA、絲素蛋白/HA/聚多巴胺支架相比，絲素蛋白/HA/聚多巴胺/BMP-2 支架上細胞數(shù)量最多，增殖能力最強，ALP 活性最高，成骨誘導能力顯著高于其他兩組支架。Bal等［15，16］發(fā)現(xiàn)BMP-2 在聚乳酸-聚乙二醇/HA 復合材料中可緩釋25 d。載不同劑量BMP-2［0 μg（對照）、3 μg（低劑量）、10 μg（高劑量）］的聚乳酸-聚乙二醇/HA 復合材料促進大鼠脊柱融合實驗發(fā)現(xiàn)，術后8 周μCT、手動觸診試驗和組織學均顯示低、高劑量組91.6%（11/12）的標本呈骨性融合，證實低劑量BMP-2 負載于聚乳酸-聚乙二醇/HA 復合材料可實現(xiàn)BMP-2 緩釋，提高骨修復效果。Lee 等［17］開發(fā)了一種載BMP-2 和阿倫磷酸鈉的序貫給藥復合支架，BMP-2 通過激活成骨細胞促進成骨，而阿倫磷酸鈉抑制破骨細胞介導的骨吸收，兩者可協(xié)同促進骨再生。Chao 等［18］研究低劑量BMP-2 聯(lián)合HA/β-磷酸三鈣/膠原復合物修復種植體周圍臨界尺寸缺陷發(fā)現(xiàn)，含0.2 mg/ml BMP-2 的HA/β-磷酸三鈣/膠原復合物具有較強的成骨能力，可修復比格犬牙槽骨置入物周圍的缺損，穩(wěn)定置入物。

BMP-2 的使用劑量過低不能誘導骨缺損愈合，劑量過高則會導致囊腫樣骨形成和明顯的軟組織腫脹［19］，同時各種復合材料對BMP-2 的緩釋效果存在差異，所以應根據(jù)具體的復合材料選擇合適的BMP-2 負載劑量，使得材料能誘導骨形成修復缺損而無不良并發(fā)癥出現(xiàn)。

1.2 血管內皮生長因子

血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）是最重要的血管生長因子之一，主要作用是誘導新生血管形成。此外，VEGF 具有間接促進MSCs 分化為成骨細胞的能力［20］。血管新生是早期骨修復的重要環(huán)節(jié)，支架復合VEGF 可有效地提高成骨效能［21］。因此VEGF 在骨組織工程中越來越受到重視。

Knaack 等［22］發(fā)現(xiàn)肝素修飾的膠原蛋白/HA 多孔支架可仿生骨基質，能可控釋放VEGF，刺激血管形成，促進骨再生。Quinlan 等［23］將包裹VEGF 的海藻酸鹽微粒整合到膠原-HA 支架，可持續(xù)釋放VEGF長達35 d。當復合支架置入大鼠顱骨缺損處，與空白組和無VEGF 的支架相比，缺損區(qū)新生血管增多，骨組織也/明顯增加，說明增強的骨生成與血管生成相關。Liu 等［24］采用選擇性激光燒結技術和共沉淀法制備的多孔聚己內酯/HA/VEGF 支架具有良好的細胞相容性和生物活性，可顯著促進大鼠皮下新生血管的形成，增強大鼠顱骨缺損處的骨再生。Chen 等［25］發(fā)現(xiàn)VEGF 涂層的HA/磷酸鈣/聚己內酯支架可顯著增強人MSCs 和人臍靜脈內皮細胞的增殖、血管生成因子（血管性血友病因子和血管生成素-1）和成骨相關蛋白（BMP-2、OPN 和OCN）表達。對照HA/磷酸鈣/聚己內酯支架，VEGF 負載支架可顯著改善兔股骨缺損的骨再生，置入8 周后見明顯的血管生成、骨組織再生和礦化。Jin 等［26］發(fā)現(xiàn)與HA/VEGF/MSCs 支架和HA/MSCs 支架相比，涂有5 層膠原蛋白/肝素多層薄膜的HA/VEGF/MSCs 支架可顯著促進內皮分化標志物CD31、胎肝激酶-1 和血管性血友病因子的表達，支持更多細胞的生長，且植入大鼠背部肌肉28 d 后可見更多數(shù)量的血管。劉定坤［27］制得內部載VEGF、外層載萬古霉素的HA/海藻酸鈉/殼聚糖復合支架，HA 質量占比為40%、海藻酸鈉/殼聚糖含量為60%的復合支架具有最佳的力學性能、孔隙率、降解率等理化性能。HA 質量占比為60%、海藻酸鈉/殼聚糖含量為40%的復合支架具有最佳的VEGF 緩釋效果，且對金黃色葡萄球菌表現(xiàn)出顯著的抑菌活性，是一種性能優(yōu)異的多功能支架。

血管生成對骨組織修復具有重要意義，增強血管化的骨再生支架具有可行性和廣闊的應用前景。過量的VEGF 可誘導大量血管生成，使血管通透性增加，繼而引起全身性低血壓和水腫［28］，因此，在構建骨修復材料時適宜劑量的VEGF 具有重要意義。

2 載雙因子HA/聚合物復合材料

自然骨愈合是受多種生長因子調控的復雜過程，血管生成起著至關重要的作用。VEGF 雖然具有成血管-成骨作用，但單獨使用不足以高效促進骨再生［29，30］?；赩EGF 的成血管特性和BMP-2 的成骨性能，VEGF 和BMP-2 的雙重遞送得到廣泛研究，以構建生長因子的控制釋放與骨自然愈合過程相協(xié)調的釋放系統(tǒng)［23，24］。

Li 等［33］在兔橈骨缺損修復實驗中發(fā)現(xiàn)，與單純納米HA/絲素蛋白/聚己內酯支架、單純BMP-2/VEGF 和空白對照組相比，載BMP-2/VEGF 雙因子支架組術后12 周可見明顯的板層新骨形成，骨小梁排列規(guī)則，新生骨組織內無明顯間隙，骨缺損修復完成，BMP-2 和OCN 表達水平最高。Chen 等［34］利用殼聚糖和透明質酸鈉逐層涂層改性HA 支架，支架的抗壓強度從3.5 MPa 提高到了6.0 MPa。BMP-2 和VEGF 負載于復合支架可實現(xiàn)持續(xù)釋放，在體外14 d可累積釋放80%，促進MC3T3-E1 細胞生長和成骨分化。顯微CT、I 型膠原和凝集素的免疫化學染色結果表明，載BMP-2/VEGF 的復合支架具有良好的成骨和成血管能力，能很好地促進新骨形成，修復兔臨界尺寸顱骨缺損。同樣有研究表明，負載BMP-2 和VEGF 的多孔絲素蛋白/HA 復合支架在大鼠顱骨缺損模型中對血管化和骨再生具有協(xié)同效應［35］。生物材料控制生長因子有序釋放的特性在骨修復與再生領域也受到廣泛關注。Godoy-Gallardo 等［36，37］通過聚多巴胺涂層將BMP2 和VEGF 分層負載于聚已內酯/HA支架的內外層，VEGF 體外釋放快速，而BMP-2 的釋放更緩慢、更持久，符合骨愈合過程和骨組織工程應用的需要。載雙因子的復合支架與BMSCs 和人內皮祖細胞共培養(yǎng)可明顯上調成骨（OCN、ALP）和血管生成（內皮衍生超極化因子-1、VEGF-A 和VEGF-R2）基因的表達，成骨活性顯著優(yōu)于只負載BMP2 的支架，是一種高效的骨修復材料。Dou等［38］將VEGF 和載BMP-2 的O-羧甲基殼聚糖微球負載于HA/膠原蛋白支架，成功制得載雙因子復合支架，BMP-2 體外緩釋可達21 d，而VEGF 在14 d 內達到釋放的峰值。即VEGF 在BMP-2 之前達到了一個釋放高峰，實現(xiàn)了生長因子的順序釋放，并與人骨生長的模式一致。在正常骨愈合過程中，VEGF 表達在早期達到峰值，而BMP-2 表達在后期達到峰值。根據(jù)生長因子之間的協(xié)同和疊加效應，VEGF 首先有效誘導血管生成，然后BMP-2 促進骨形成，雙因子的順序釋放可顯著促進骨再生。體內實驗顯示，載雙因子支架中血管的數(shù)量和大小顯著優(yōu)于單純支架和BMP-2 負載支架。綜上所述，載VEGF 和BMP-2 的復合緩釋支架可以實現(xiàn)雙因子的順序釋放，更有效地促進新生血管的形成和生長，增強支架的成骨效果，最終加速骨組織修復。納米HA/聚酰胺66 是一種具有良好生物相容性、力學性能的骨替代材料，已廣泛應用于骨再生領域［39，40］。然而，有限的生物活性阻礙了其在組織工程中的進一步應用。Li 等［41］將BMP-2 衍生肽和VEGF 模擬肽雙重接枝到聚酰胺66聚合物鏈上，制得多肽修飾的HA/聚酰胺66 支架，BMP-2 衍生肽和VEGF 模擬肽均可持續(xù)釋放并保持生物活性，促進BMSCs 的黏附、增殖和成骨分化及人臍靜脈內皮細胞的增殖和成血管分化。支架置入SD 大鼠股骨嚴重骨折處8 周，骨折線消失，小梁骨穿過骨折間隙連接，皮質骨連續(xù)。載雙因子的納米HA/聚酰胺66 支架可同時促進血管生成和成骨，為骨不連治療中促進骨再生提供了一種有前景的方法。

載BMP-2/VEGF 的新型復合支架兼具成骨和促血管生成能力，能夠高效增強新骨形成，為臨床應用中的骨修復和再生提供了潛在的解決方案。

3 小結與展望

迄今為止，HA/聚合物復合材料作為骨再生支架和生物活性分子可控緩釋載體調節(jié)骨愈合、促進骨缺損修復取得了一定的進展。但應用于臨床骨修復治療還有一定的距離。如何優(yōu)化材料、制備仿生結構、提高材料性能，如何將生長因子與載體材料高效負載，如何精準控制釋放生長分子、調節(jié)信號通路，如何減少或避免不良反應等仍然是今后需要繼續(xù)深入研究和解決的問題。骨愈合是涉及多種細胞、生物分子、調節(jié)機制的復雜過程，臨床中骨損傷或骨缺損的原因存在多樣性，因此，未來骨修復材料應具有高度仿生結構、優(yōu)異的理化性能和生物活性，可模擬自然骨再生過程實現(xiàn)生物分子的時空遞送，同時兼?zhèn)湔{節(jié)破骨細胞、免疫細胞活性的功能。相信隨著材料學、再生醫(yī)學、骨組織工程學的發(fā)展及臨床治療的需求，HA/聚合物多功能復合材料將具有廣闊的前景。