李振國，郝星雨，賀甜蓮，景蕊，榮成，顧承真，鄭新宇

福建農(nóng)林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，福建 福州 350000

人類活動(dòng)造成的土壤重金屬鎘（Cd）污染已成為全球性的環(huán)境挑戰(zhàn)（Rai et al.，2019）。重金屬Cd可以通過食物鏈進(jìn)入人體，造成嚴(yán)重的健康危害（Lü et al.，2022），并嚴(yán)重制約農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展（Yuan et al.，2021）。超富集植物修復(fù)是一種經(jīng)濟(jì)和環(huán)境友好的修復(fù)方式，可以將Cd從土壤中完全去除或轉(zhuǎn)化為危害較小的形式以達(dá)到土壤修復(fù)目的（Ge et al.，2021），被認(rèn)為是原位修復(fù)Cd污染土壤的有效措施之一（Bhat et al.，2022）。

紫蘇（Perillafrutescens）為一年生草本植物，是一種在中國廣泛種植的Cd超富集植物（肖清鐵等，2018）。此外，該植物富含揮發(fā)油，并具有生物量大、生長周期短和經(jīng)濟(jì)效益高等優(yōu)點(diǎn)，可在修復(fù)污染土壤的同時(shí)產(chǎn)出的揮發(fā)性精油，兼具經(jīng)濟(jì)效益和環(huán)境效益（鄭梅琴等，2018）。然而，前期研究發(fā)現(xiàn)在采用紫蘇對(duì)鎘污染土壤進(jìn)行修復(fù)時(shí)，存在生物量大幅下降的現(xiàn)象，導(dǎo)致其難以大面積推廣應(yīng)用（張洪等，2006；Xiao et al.，2020）。

重金屬脅迫下往往引起植物體內(nèi)的氧化脅迫，導(dǎo)致活氧（ROS）的過度積累，高濃度的ROS則會(huì)損傷細(xì)胞，危及細(xì)胞功能，導(dǎo)致植物生物量的下降（Das et al.，1997）。因此，及時(shí)清除ROS可使植物免受毒害。植物體內(nèi)一些酶類抗氧化物質(zhì)，如過氧化物酶（POD）、超氧化物歧化酶（SOD）和過氧化氫酶（CAT）、抗壞血酸過氧化物酶（APX）等和非酶類抗氧化物質(zhì)如類黃酮和酚酸類化合物，可清除過量的ROS，以緩解植物的氧化損傷（Ferrer et al.，2008；Martinez et al.，2016；Choudhury et al.，2017）。此外酚酸類化合物還可以固化金屬，降低重金屬毒性，其單體在細(xì)胞壁的酯化醇化還能強(qiáng)化細(xì)胞壁的交聯(lián)作用，進(jìn)一步增強(qiáng)植物對(duì)金屬的防御能力。

竹醋液（BV）是竹炭生產(chǎn)過程中的副產(chǎn)物，由竹材緩慢熱解產(chǎn)生的一種揮發(fā)性、可溶于水的混合物，成分中酚類物質(zhì)含量較高（張宏等，2014）。研究表明，竹醋液可促進(jìn)植物生長（Zhu et al.，2021），且無細(xì)胞遺傳毒性，不會(huì)對(duì)生物群和人類健康造成不利影響（Sivaram et al.，2022）。在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，常被用作植物生長調(diào)節(jié)劑（促進(jìn)種子萌發(fā)（Hagner et al.，2021）、植物生長（Sun et al.，2020）和果實(shí)發(fā)育（Yu et al.，2017）等）和土壤改良劑（刺激土壤酶活性（Lashari et al.，2013）和減少氨揮發(fā)（Win et al.，2009）等）。研究表明，以酸類（Han et al.，2021）、酚類（Saidi et al.，2021）或酮類（Kang et al.，2022）化合物作為植物的外源添加劑，可以緩解植物的Cd損傷和/或提高植物的Cd富集能力。然而，竹醋液作為含有多種有機(jī)物的天然環(huán)保物質(zhì)，能否在促進(jìn)植物生長的同時(shí)實(shí)現(xiàn)對(duì)土壤重金屬的高效率修復(fù)卻鮮有報(bào)道。

基于此，本研究利用竹醋液對(duì)Cd脅迫下紫蘇進(jìn)行葉面噴施，針對(duì)紫蘇生物量、鎘含量、抗氧化酶活性和非酶類抗氧化物質(zhì)的分析，探究噴施BV對(duì)Cd脅迫下紫蘇生理的影響，以期闡明BV對(duì)植株Cd脅迫的毒性緩解效應(yīng)，為植物高效修復(fù)鎘污染土壤提供理論參考。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

紫蘇（Perillafrutescens）種子購自江西省會(huì)昌縣祖有種養(yǎng)場(chǎng)，為實(shí)驗(yàn)室前期篩選鎘的超富集植物。竹醋液由福建省建甌市恒順炭業(yè)有限公司提供，在隔絕空氣下加熱，熱解溫度450 ℃、升溫速率為10 ℃·min-1下制得。收集到的冷凝物在沉淀和過濾后，室溫放置6個(gè)月后使用。竹醋液的特性是：pH值2.2，總有機(jī)碳質(zhì)量濃度835.9 mg·L-1，總氮225.4 mg·L-1，總磷96.1 mg·L-1，總鉀27.3 mg·L-1，鎘未檢出。

采用GC-MS儀（安捷倫7890B-7000D，美國）對(duì)竹醋液進(jìn)行組分分析。GC條件：色譜柱為HPVOC（60 m×200 μm×1.1 μm），柱溫40 ℃，恒溫3 min后，以5 ℃·min-1速度升溫至80 ℃，恒溫5 min，再以5 ℃·min-1速度升溫至140 ℃，恒溫1 min，再以40 ℃·min-1速度升溫至270 ℃，恒溫6 min；載氣為氦氣，分流比10:1，進(jìn)樣量1 μL。進(jìn)樣口溫度200 ℃，接口溫度280 ℃。MS條件：EI源，電子能量70 eV，掃描質(zhì)量范圍（m/Z）為10－500。有機(jī)物成分見表1。

表1 竹醋液中有機(jī)物的組成及其相對(duì)含量Table 1 Composition and relative content of organic matter in bamboo vinegar

1.2 水培試驗(yàn)

紫蘇幼苗的培養(yǎng)和移植參照Xiao et al.（2020）。待紫蘇幼苗長至四葉期（約25 d），移植于42 cm×30 cm×15 cm的黑色塑料盆中，每盆9株，內(nèi)含10 L Hoagland完全營養(yǎng)液，調(diào)節(jié)pH至6.0左右，適應(yīng)性生長7 d，以待后續(xù)處理。

本研究在試驗(yàn)處理前開展預(yù)實(shí)驗(yàn)，考察了不同稀釋倍數(shù)（50、100、300倍和500倍）竹醋液對(duì)不同濃度（0、4 mg·L-1和8 mg·L-1）鎘脅迫下紫蘇生長的影響。通過觀察地上部和地下部的發(fā)育情況發(fā)現(xiàn)，在8 mg·L-1鎘脅迫下，紫蘇根系變黑，地上部幾乎停止生長，而稀釋300倍竹醋液可以促進(jìn)8 mg·L-1鎘脅迫下紫蘇的生長。稀釋50倍竹醋液會(huì)抑制不同濃度鎘脅迫下紫蘇的生長，其它稀釋倍數(shù)竹醋液均不同程度的促進(jìn)鎘脅迫下紫蘇的生長，以稀釋300倍竹醋液處理下，紫蘇生物量增加最多。

根據(jù)以上結(jié)果，本研究以稀釋300倍竹醋液作為葉面噴施濃度，每盆噴施20 mL，每4天進(jìn)行1次噴施，噴施時(shí)間為上午10:00，在預(yù)施竹醋液8 d后，更新營養(yǎng)液并用CdCl2溶液處理，將溶液的Cd2+濃度調(diào)整為0、4 mg·L-1和8 mg·L-1。水培實(shí)驗(yàn)在溫室中進(jìn)行，光照強(qiáng)度為180 μmol·m-2·s-1，光周期為12 h光照/12 h黑暗，溫度為光照25 ℃/黑暗22 ℃，濕度為60%。營養(yǎng)液Cd2+處理濃度0、4 mg·L-1和8 mg·L-1命名為Cd0、Cd4和Cd8，未噴施竹醋液命名和噴施竹醋液命名UBV和BV。

1.3 取樣與指標(biāo)的測(cè)定

1.3.1 取樣

在竹醋液處理16 d后采集植物樣本。每個(gè)處理隨機(jī)抽取5個(gè)植株，用0.1 mol·L-1的EDTA溶液仔細(xì)清洗根系，用蒸餾水沖洗3次。然后把它們分成根、莖和葉，一部分樣品放入信封中在105 ℃下干燥30 min，然后在72 ℃下干燥48 h，稱重并研磨過60目篩，以分析Cd濃度。其余樣品用液氮冷凍，并在-80 ℃下儲(chǔ)存，以測(cè)定其它指標(biāo)。

1.3.2 類黃酮含量的測(cè)定

類黃酮含量的測(cè)定采用含1% HCl的甲醇溶液浸提，測(cè)定參照Dou et al.（2018）。

1.3.3 鎘含量的測(cè)定

環(huán)境中鎘含量的測(cè)定是以50 mL水培液在70 ℃下蒸發(fā)至5 mL作為待消解樣品，采用HNO3-HClO4（V/V=9:1）雙酸消化法對(duì)水培液以及植物地上部和地下部樣品進(jìn)行消解，通過ICP-MS儀（安捷倫7700，美國）分析鎘濃度。

1.3.4 抗氧化酶活性和MDA含量的測(cè)定

過氧化物酶（POD）、超氧化物歧化酶（SOD）和過氧化氫酶（CAT）、抗壞血酸過氧化物酶（APX）活性測(cè)定分別采用愈創(chuàng)木酚法、氮藍(lán)四唑光化還原法、高錳酸鉀滴定法和抗壞血酸比色法，丙二醛（MDA）含量測(cè)定采用硫代巴比妥酸法（李忠光等，2008；汪敦飛等，2019）。

1.3.5 酚酸含量的測(cè)定

可溶性酚酸基于80%預(yù)冷甲醇溶液提取，取醇不溶的沉淀，用于結(jié)合態(tài)酚酸的提?。ㄗT新中等，2010）。酚酸含量的測(cè)定參照鄭新宇等（2013），采用HPLC儀（安捷倫1260，美國）測(cè)定。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用不均勻平均法計(jì)算紫蘇全株中Cd的含量。富集系數(shù)（BCF）為植物體內(nèi)Cd質(zhì)量分?jǐn)?shù)與環(huán)境中Cd質(zhì)量分?jǐn)?shù)的比值，轉(zhuǎn)運(yùn)系數(shù)（TF）為植株Cd質(zhì)量分?jǐn)?shù)與地下部Cd質(zhì)量分?jǐn)?shù)的比值。總酚酸含量為可溶性酚酸與結(jié)合態(tài)酚酸的總和。數(shù)據(jù)的處理采用SPSS 25軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，Origin 2022軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行主成分分析（PCA），Pearson相關(guān)性分析用于檢測(cè)兩者之間的關(guān)系。所有結(jié)果以均值±標(biāo)準(zhǔn)差（SD）表示。在滿足正態(tài)性和方差齊性的情況下，基于最小顯著差異檢驗(yàn)（LSD）分析（P<0.05）。所有圖片均采用Origin 2022軟件繪制。

2 結(jié)果分析

2.1 竹醋液對(duì)紫蘇鎘富集能力的影響

本研究4 mg·L-1和8 mg·L-1Cd濃度處理下以及噴施BV后植株的單株總Cd富集量、地上部Cd含量、地下部Cd含量、BCF和TF進(jìn)行了檢測(cè)。

如圖1a所示，未噴施BV處理下，Cd4和Cd8處理下單株總Cd富集量為737 μg·plant-1和683 μg·plant-1，噴施BV分別顯著提高了69.3%（P<0.001）和55.7%（P<0.001），且以噴施BV的Cd4處理下，地上部Cd富集量最多，達(dá)到641 μg·plant-1；如圖1b和c所示，未噴施BV下，Cd4和Cd8處理下的地上部以及地下部Cd質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為647、411、2654 μg·g-1和5291 μg·g-1。而噴施BV增加了Cd4和Cd8處理下紫蘇的地上部鎘含量和地下部Cd含量，在Cd4處理下分別增加了16.5%（P=0.001）和14.0%（P=0.024），在Cd8處理下分別顯著增加了21.4%（P=0.003）和62.8%（P<0.001）；如圖1d、e所示，未噴施BV下，Cd4和Cd8處理BCF分別為240和131，TF分別為0.244和0.078。噴施BV導(dǎo)致紫蘇在Cd4和Cd8處理下的BCF分別提高了23.8%（P<0.001）和29.3%（P=0.002），而Cd8處理下，TF降低了25.0%（P=0.048），Cd4處理下的TF無顯著影響。如圖1f所示，在未噴施BV處理下，Cd8較Cd0處理下干重顯著降低了14.0%，Cd4較Cd0處理無顯著差異；在Cd0、Cd4和Cd8處理下，噴施BV較未噴施分別顯著增加了28.9%、36.8%（P<0.001）和20.6%（P<0.001）?？傊瑖娛〣V可以促進(jìn)不同Cd濃度下紫蘇的單株總Cd富集量，且促進(jìn)效果為Cd4>Cd8。

圖1 噴施BV對(duì)0、4 mg?L-1和8 mg?L-1 Cd濃度處理下，紫蘇的單株總Cd富集量（a）、Cd含量（b－地上部、c－地下部）、BCF（d）、TF（e）和干重（f）的影響Figure 1 Effects of BV spray on total Cd enrichment (a),Cd content (b–aboveground part,c–underground part),BCF(d),TF(e) and dry weight (f) of Perilla frutescens per plant at 0,4 mg·L-1 and 8 mg·L-1 Cd concentrations

2.2 竹醋液對(duì)鎘脅迫下紫蘇類黃酮含量的影響

如圖2a所示，未噴施BV時(shí)，Cd8和Cd4較Cd0處理葉中類黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別顯著增加了13.0%（P<0.001）和59.4%（P<0.001）；在Cd0、Cd4和Cd8處理下，噴施BV較未噴施相比，葉中類黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別顯著增加了17.8%（P=0.004）、80.0%（P<0.001）和31.9%（P<0.001）。

圖2 噴施BV對(duì)0、4 mg?L-1和8 mg?L-1 Cd處理紫蘇的類黃酮含量（a－葉、b－根）的影響Figure 2 Effects of BV spray on flavonoid content (a–leaves,b–root)of Perilla frutescens treated with 0,4 mg·L-1 and 8 mg·L-1 Cd

同時(shí)，類黃酮含量在根中也表現(xiàn)出不同的差異（圖2b）。未噴施BV時(shí)，Cd4較Cd0處理根中類黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)無顯著差異。Cd8較Cd0處理根中類黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)顯著降低了70.2%（P<0.001）；噴施BV使Cd0和Cd4處理下根中類黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)顯著增加了13.8%（P=0.003）和34.7%（P<0.001），對(duì)Cd8處理下根中類黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)無顯著影響。可見，噴施BV可以提高紫蘇類黃酮含量。

2.3 根和葉中酚酸

本研究對(duì)紫蘇的14種酚酸類物質(zhì)進(jìn)行了檢測(cè)，包括沒食子酸、原兒茶酸、綠原酸、對(duì)羥基苯甲酸、咖啡酸、丁香酸、香蘭素、對(duì)香豆酸、阿魏酸、異綠原酸A、香豆素、苯甲酸、迷迭香酸和肉桂酸。Cd處理下，根和葉中酚酸均有不同程度的提高。噴施BV后，在Cd0、Cd4和Cd8處理下，葉中總酚酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)較未噴施相比分別顯著增加了36.9%、93.6%和30.9%（P<0.001，圖3a）。根中總酚酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)在Cd0處理下顯著降低了46.2%（P<0.001），Cd4和Cd8處理下顯著增加了25.3%和31.2%（P<0.001，圖3b）。Cd和BV處理對(duì)紫蘇根和葉的酚酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)表現(xiàn)為正向協(xié)同效應(yīng)。

圖3 噴施BV對(duì)0、4 mg?L-1和8 mg?L-1 Cd處理紫蘇的總酚酸含量（a－葉、b－根）Figure 3 Total phenolic acid content (a–leaves,b–root) of Perilla frutescens treated with 0,4 mg·L-1 and 8 mg·L-1 Cd by spraying BV

2.3.1 根和葉中可溶性酚酸

葉中可溶性酚酸除阿魏酸未被檢測(cè)到，其余均被檢測(cè)到（表2）。葉中可溶性酚酸含量為：異綠原酸A>苯甲酸>迷迭香酸>香蘭素>香豆素>原兒茶酸>對(duì)香豆酸>丁香酸>咖啡酸>綠原酸>對(duì)羥基苯甲酸>肉桂酸>沒食子酸；根中檢測(cè)到8種可溶性酚酸，苯甲酸>綠原酸>咖啡酸>異綠原酸A>對(duì)羥基苯甲酸>丁香酸>香豆素>原兒茶酸（表3）。且可溶性酚酸總量表現(xiàn)為葉>根。

表3 噴施BV對(duì)0、4 mg?L-1和8 mg?L-1 Cd處理下紫蘇根中可溶性酚酸含量影響Table 3 Effects of BV spray on soluble phenolic acid content in Perilla frutescens root treated with 0,4 mg·L-1and 8 mg·L-1

如表2所示，在未噴施BV時(shí)，Cd0、Cd4和Cd8處理下葉中總可溶性酚酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為627、654、1026 μg·g-1。噴施BV較未噴施相比，Cd0、Cd4和Cd8處理下葉中總可溶性酚酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別顯著增加了37.8%（P<0.001）、136.2%（P<0.001）和49.8%（P<0.001）。在所有被檢測(cè)的葉可溶性酚酸中，Cd處理下均有不同程度的改變，以Cd8處理下咖啡酸、沒食子酸、丁香酸和香蘭素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)變化較大，分別為Cd0的6.9、3.5、2.8、2.3倍。噴施BV導(dǎo)致Cd4處理下香豆素、咖啡酸和香蘭素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)變化較大，分別為未噴施的5.9、4.3、2.4倍。其中含量較高的異綠原酸A、苯甲酸和迷迭香酸，在Cd4處理下，噴施BV分別為未噴施的1.6、2.7和4.5倍。此外，沒食子酸、綠原酸、對(duì)羥基苯甲酸和對(duì)香豆酸在噴施BV后也有不同程度的增加。

如表3所示，在未噴施BV時(shí)，Cd0、Cd4和Cd8處理下根中可溶性酚酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為62.9、76.8、126 μg·g-1。噴施BV較未噴施相比，Cd0處理下根中可溶性酚酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)無顯著差異，Cd4和Cd8處理下根中可溶性酚酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別顯著增加了31.8%（P=0.007）和76.1%（P<0.001）。在所有被檢測(cè)的根可溶性酚酸中，Cd處理下均有不同程度的改變，以Cd8處理下丁香酸、異綠原酸A和苯甲酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)變化較大，分別為Cd0的2.2、3.3和2.5倍。噴施BV使Cd8處理下對(duì)羥基苯甲酸和咖啡酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)變化較大，分別為未噴施的2.2倍和2.5倍。其中含量較高的綠原酸和苯甲酸，在Cd8處理下，噴施BV分別為未噴施的1.9倍和1.8倍。此外，原兒茶酸在噴施BV后也有不同程度的增加。

2.3.2 根和葉中結(jié)合態(tài)酚酸含量

葉中檢測(cè)到12種結(jié)合態(tài)酚酸，各酚酸含量表現(xiàn)為對(duì)香豆酸>咖啡酸>綠原酸>阿魏酸>對(duì)羥基苯甲酸>苯甲酸>沒食子酸>異綠原酸A>原兒茶酸>丁香酸>香蘭素>肉桂酸（表4）；根中檢測(cè)到11種結(jié)合態(tài)酚酸，各酚酸含量表現(xiàn)為咖啡酸>綠原酸>丁香酸>對(duì)羥基苯甲酸>對(duì)香豆酸>沒食子酸>苯甲酸>阿魏酸>原兒茶酸>香豆素>香蘭素（表5）。且結(jié)合態(tài)酚酸總量表現(xiàn)為葉<根。

表4 噴施BV對(duì)0、4 mg?L-1和8 mg?L-1 Cd處理下紫蘇葉中結(jié)合態(tài)酚酸含量影響Table 4 Effects of BV spray on the content of bound phenolic acid in Perilla frutescens leaves treated with 0,4 mg·L-1 and 8 mg·L-1 Cd

表5 噴施BV對(duì)0、4 mg?L-1和8 mg?L-1 Cd處理下紫蘇根中結(jié)合態(tài)酚酸含量影響Table 5 Effects of BV spray on the content of binding phenolic acid in Perilla frutescens root treated with 0,4 mg·L-1 and 8 mg·L-1 Cd

如表4所示，在未噴施BV時(shí)，Cd0、Cd4和Cd8處理下葉中結(jié)合態(tài)酚酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為304、427、631 μg·g-1。噴施BV較未噴施相比，Cd0和Cd4處理下葉中結(jié)合態(tài)酚酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別顯著增加了35.1%（P<0.001）和28.2%（P<0.001），而Cd8處理無顯著差異。在所有被檢測(cè)的葉中結(jié)合態(tài)酚酸，Cd處理下均有不同程度的改變，以Cd8處理下原兒茶酸、咖啡酸和丁香酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)變化較大，分別為Cd0的3.3、3.3和3.2倍。噴施BV導(dǎo)致Cd4處理下原兒茶酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)變化較大，為未噴施的2.3倍。其中含量較高的對(duì)香豆酸、咖啡酸和綠原酸，在Cd4處理下，噴施BV分別為未噴施的1.1、1.7和1.2倍。

如表5所示，在未噴施BV時(shí)，Cd0、Cd4和Cd8處理下根中結(jié)合態(tài)酚酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為314、307、363 μg·g-1。噴施BV較未噴施相比，Cd0處理下根中結(jié)合態(tài)酚酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)顯著降低了53.9%（P<0.001），Cd4和Cd8處理下根中結(jié)合態(tài)酚酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別顯著增加了21.5%（P<0.001）和16.5%（P<0.001）。在所有被檢測(cè)的根中結(jié)合態(tài)酚酸，Cd處理下以Cd8處理的香蘭素質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加較大，為Cd0的1.9倍。噴施BV導(dǎo)致Cd4處理下阿魏酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)變化較大，為未噴施的2.2倍。其中含量較高的對(duì)咖啡酸和綠原酸，在Cd4處理下，噴施BV分別為未噴施的1.5倍和1.2倍。噴施BV使Cd4和Cd8處理下苯甲酸和原兒茶酸也有不同程度的提高。

紫蘇葉中以及根中的可溶性酚酸和結(jié)合態(tài)酚酸含量也表現(xiàn)出不同的差異。在自然生長下，葉表現(xiàn)為可溶性酚酸含量大于結(jié)合態(tài)酚酸含量，而根中二者的含量相反。在Cd和BV處理后，葉以及根中兩種形態(tài)酚酸的相對(duì)含量并未改變。較未噴施BV相比，可溶性酚酸含量以噴施后Cd4處理下的葉和Cd8處理下的根中增加較多，結(jié)合態(tài)酚酸含量也有不同程度的提高，但相對(duì)增加量為可溶性酚酸含量更大，表明噴施BV可以增加Cd處理下可溶性和結(jié)合態(tài)酚酸含量，且以可溶性酚酸含量為主。值得注意的是，沒食子酸、綠原酸、對(duì)羥基苯甲酸、咖啡酸、對(duì)香豆酸和阿魏酸主要以結(jié)合態(tài)的形式存在于植物體，異綠原酸A、苯甲酸和迷迭香酸主要以可溶性的形式存在于植物體，酚酸形態(tài)的不同在植物體所執(zhí)行的功能也不同。

2.4 竹醋液對(duì)不同Cd濃度處理下植株抗氧化酶活性和丙二醛含量的影響

2.4.1 葉中抗氧化酶活性和丙二醛含量

如圖4所示，未噴施BV時(shí)，較Cd0相比，Cd4處理下葉CAT酶活性顯著增加了86.7%（P<0.001），Cd8處理下葉SOD酶活性顯著增加了11.1%（P=0.002），而Cd處理下的POD和APX酶活性均不同程度的降低。Cd4和Cd8處理均導(dǎo)致葉中MDA含量增加，較Cd0分別顯著增加19.6%和27.2%（P<0.001）；噴施BV較未噴施相比，在Cd0處理下，葉中POD酶活性顯著降低22.3%（P<0.001），APX酶活性顯著增加63.3%（P<0.001）。在Cd4處理下，葉中POD和SOD酶活性分別顯著增加10.9%（P=0.036）和11.6%（P=0.004），CAT酶活性顯著降低57.1%（P<0.001）。在Cd8處理下，葉中POD和APX酶活性分別顯著增加31.2%（P=0.001）和414.1%（P=0.002），SOD酶活性顯著降低6.5%（P=0.024）。噴施BV使Cd0處理下MDA含量顯著降低了18.7%（P<0.001），Cd4處理下MDA含量顯著增加了20.7%（P<0.001），而Cd8處理下無顯著差異。

圖4 噴施BV對(duì)0、4 mg?L-1和8 mg?L-1 Cd濃度處理下紫蘇葉中PDD活性（a）、CAT活性（b）、SOD活性（c）、APX活性（d）和MDA含量（e）的影響Figure 4 Effects of BV spray on PDD activity (a),CAT activity (b),SOD activity (c),APX activity (d)and MDA content (e) in Perilla frutescens leaves treated with 0,4 mg·L-1 and 8 mg·L-1 Cd concentrations

2.4.2 根中抗氧化酶活性和丙二醛含量

如圖5所示，未噴施BV時(shí)，Cd處理下根中POD、SOD、CAT和APX酶活性均不同程度的降低，MDA含量在Cd4和Cd8處理下較Cd0分別顯著增加了62.0%（P<0.001）和59.4%（P<0.001）；噴施BV較未噴施相比，在Cd0處理下，根中POD和SOD酶活性分別顯著降低了24.0%（P<0.001）和43.5%（P<0.001），APX酶活性顯著增加了47.4%（P<0.001）。在Cd4和Cd8處理下POD、SOD和APX酶活性均不同程度的增加，Cd4處理下分別顯著增加了64.2%（P=0.036）、32.6%（P<0.001）和67.0%（P<0.001），Cd8處理下分別顯著增加了65.1%（P=0.001）、26.7%（P<0.001）和76.0%（P=0.029）。噴施BV使Cd0處理下MDA含量顯著增加了19.3%（P=0.003）的，而Cd4和Cd8處理下MDA含量分別顯著降低了10.6%（P=0.006）和8.62%（P=0.019）。

圖5 噴施BV對(duì)0、4 mg?L-1和8 mg?L-1 Cd濃度處理下紫蘇根中PDD活性（a）、CAT活性（b）、SOD活性（c）、APX活性（d）和MDA含量（e）的影響Figure 5 Effects of BV spray on PDD activity (a),CAT activity (b),SOD activity (c),APX activity (d)and MDA content (e) in Perilla frutescens root treated with 0,4 mg·L-1 and 8 mg·L-1 Cd concentrations

2.5 竹醋液對(duì)不同Cd濃度處理下植株酶系統(tǒng)和非酶系統(tǒng)的影響

如圖6a所示，前兩個(gè)主成分解釋了總方差的87.5%，其中PC1的貢獻(xiàn)為66.0%。說明Cd和BV處理改變了葉中這些指標(biāo)的含量。在UBVCd0、BVCd0和UBVCd4處理下，POD、APX和CAT酶活性是酶系統(tǒng)的特征信號(hào)，在分離過程中起著至關(guān)重要的作用。而UBVCd8和BVCd8處理下，類黃酮和酚酸非酶系統(tǒng)負(fù)責(zé)這種分離。

圖6 噴施BV對(duì)0、4 mg?L-1和8 mg?L-1 Cd濃度處理下紫蘇酶系統(tǒng)和非酶系統(tǒng)的主成分分析（PCA）得分圖Figure 6 Principal component analysis (PCA) scores of enzymatic and non-enzymatic systems of Perilla frutescens at 0,4 mg·L-1 and 8 mg·L-1 Cd concentrations treated with BV

如圖6b所示，前兩個(gè)主成分解釋了總方差的的76.7%，其中PC1的貢獻(xiàn)為44.7%，而PC2的貢獻(xiàn)為32.0%。6個(gè)處理均在前兩個(gè)主成分中成功分離。表明BV和Cd處理均對(duì)紫蘇根系中所研究的性狀有顯著的影響。酶系統(tǒng)SOD、POD、APX和CAT以及非酶系統(tǒng)酚酸和類黃酮均在兩個(gè)主成分中成功分散。

2.6 酚酸、類黃酮與Cd富集指標(biāo)的相關(guān)性分析

如圖7所示，葉中結(jié)合態(tài)酚酸與BCF、TF呈現(xiàn)顯著負(fù)相關(guān)（P<0.05），r分別為-0.64和-0.84。根中可溶性酚酸、結(jié)合態(tài)酚酸和總酚酸與TF呈現(xiàn)顯著負(fù)相關(guān)（P<0.05），r分別為為-0.81、-0.66和-0.75。

圖7 采用皮爾遜相關(guān)系數(shù)來確定紫蘇根和葉中重金屬與酚酸和類黃酮含量之間的關(guān)系Figure 7 Pearson correlation coefficient was used to determine the relationship between heavy metals and phenolic acids and flavonoids contents in Perilla frutescens roots and leaves

葉中結(jié)合態(tài)酚酸與地上部Cd含量呈現(xiàn)顯著負(fù)相關(guān)（P<0.05），r= -0.65。根中可溶性酚酸、結(jié)合態(tài)酚酸和總酚酸與地下部Cd含量呈現(xiàn)顯著正相關(guān)（P<0.05），分別為r=0.98、0.85和0.94。根中類黃酮與地下部Cd含量呈現(xiàn)顯著負(fù)相關(guān)（P<0.05），r=-0.81。

3 討論

植物暴露于過量的Cd脅迫下會(huì)導(dǎo)致生物量的損失，而植物生物量是評(píng)價(jià)植物修復(fù)效率的重要指標(biāo)之一（Liu et al.，2019）。BCF是衡量植物對(duì)元素的吸收和貯藏能力，TF是判斷植物元素由地下部轉(zhuǎn)運(yùn)至地上部的效率。Cd由根系進(jìn)入植物細(xì)胞中，一部分被根系細(xì)胞壁鈍化以及儲(chǔ)存于細(xì)胞的液泡中，一部分通過木質(zhì)部轉(zhuǎn)運(yùn)至地上部。本研究結(jié)果表明，BV可以提高Cd脅迫下紫蘇生物量、地下部和地上部Cd含量，提高紫蘇的Cd富集量。BV在一定程度上緩解了Cd對(duì)紫蘇的生長抑制作用，這與吳苗苗（2022）以黑麥草為植物修復(fù)材料中得出的結(jié)果相似。BV提高了紫蘇BCF，而降低了8 mg·L-1Cd脅迫下紫蘇TF，表明根系在高Cd脅迫下的重要作用。前人已證明龍葵是一種Cd的超富集植物（Zhang et al.，2011），而楊春燕（2020）研究結(jié)果顯示，3種不同品種的Cd超富集植物龍葵，均為TF<1。本研究結(jié)果中TF<1，這可能與環(huán)境的選擇有關(guān)。此外，種子來源、Cd處理濃度以及培養(yǎng)條件均會(huì)導(dǎo)致結(jié)果不同。

Cd在植物體的細(xì)胞壁和液泡等非活性部位的分布，對(duì)植物產(chǎn)生較弱的毒性作用。游離于細(xì)胞質(zhì)或其他功能細(xì)胞器時(shí)，表現(xiàn)為劇烈的細(xì)胞毒性，會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞功能異?；騿适Вw內(nèi)活性氧（ROS）的過度產(chǎn)生是金屬脅迫進(jìn)而損傷細(xì)胞的重要標(biāo)志之一。植物細(xì)胞中存在的抗氧化酶可清除過量ROS，降低膜脂氧化損傷程度，從而使植物維持正常生理活動(dòng)。其中SOD酶可以清除O2-，POD、CAT和APX酶可以清除H2O2，而MDA含量是衡量膜脂氧化損傷程度的重要指標(biāo)（林琳等，2022）。本研究中，Cd脅迫導(dǎo)致紫蘇抗氧化酶活性降低，MDA含量增加，這與謝惠玲等（2011）對(duì)不同濃度Cd脅迫下紫蘇的抗氧酶活性研究結(jié)果相似。通過噴施BV，Cd脅迫下根系抗氧化酶活性增加，尤其對(duì)APX酶活性的改善，導(dǎo)致Cd脅迫下膜脂氧化損傷程度降低。表明BV對(duì)Cd脅迫下植物抗氧化酶系統(tǒng)的改善，緩解植物細(xì)胞氧化損傷。

酚類化合物含量在Cd脅迫下有明顯的響應(yīng)，酚類化合物合成的增加，通常表現(xiàn)出對(duì)逆境更好的適應(yīng)性（Sharma et al.，2019）。酚類代謝物參與由脅迫因素產(chǎn)生的ROS的清除，具有相當(dāng)強(qiáng)的抗氧化性能（Sgherri et al.，2003）。植物酚類化合物含量在Cd脅迫下的顯著提高（Wang et al.，2020），表明它們?cè)谥亟饘倌褪苄灾械闹匾裕↘üpper et al.，2004）。本試驗(yàn)中，不同濃度Cd脅迫下葉和根中總類黃酮和總酚酸含量均有不同程度的響應(yīng)。Kovácik et al.（2008）以甘菊為植物材料，證明了酚酸類化合物在Cd脅迫中起到重要的抗氧化作用。本研究中酚類物質(zhì)含量的提高，表明BV對(duì)Cd脅迫下植物抗氧化作用的改善，更多的酚類物質(zhì)為植物提供更加強(qiáng)大的金屬防御能力，從而緩解植物損傷。

越來越多的證據(jù)表明，酚酸在植物應(yīng)對(duì)金屬脅迫的重要性。擁有清除ROS和作為金屬螯合劑的雙重作用（Vasconcelos et al.，1999），其在細(xì)胞壁的酯化，對(duì)細(xì)胞壁的金屬防御起到重要作用（De Ascensao et al.，2003）。例如，綠原酸和咖啡酸是植物中重要的抗氧化劑，可防止脂質(zhì)過氧化（Niggeweg et al.，2004），而原兒茶酸是一種具有高螯合強(qiáng)度的苯酚（Irtelli et al.，2006），丁香酸比對(duì)羥基苯甲酸更有活性（Razal et al.，1996）。在本研究中，所有這些化合物均被檢測(cè)到，尤其葉中的可溶性酚酸，更為豐富。BV的施加，使得Cd脅迫下可溶性和結(jié)合態(tài)酚酸含量增加，其中可溶性酚酸含量增加更多。表明施加BV可以同時(shí)提高金屬脅迫下由酚酸類化合物提供的植株抗氧化和金屬固化的雙重能力。我們觀察到，BV處理使Cd脅迫下植物體的沒食子酸、原兒茶酸、綠原酸、咖啡酸、和苯甲酸含量增加，并加速酯化為結(jié)合態(tài)酚酸，為植株提供了更強(qiáng)的金屬防御能力。研究表明，根系細(xì)胞壁中Cd的含量大于葉（Tian et al.，2011），將有毒的金屬離子固定在植物的非活性部位－細(xì)胞壁，尤其是根系，似乎是更有效的。相關(guān)性分析表明，根系中可溶性、結(jié)合態(tài)和總酚酸含量均與地下部Cd含量呈顯著正相關(guān)（P<0.05），與TF呈顯著負(fù)相關(guān)（P<0.05），表明酚酸在根系金屬防御的重要性。植物葉以可溶性酚酸為主，而根以結(jié)合態(tài)酚酸為主，這與植物不同器官的功能差異有關(guān)。我們猜測(cè)，根中高比例的結(jié)合態(tài)酚酸可能在細(xì)胞壁的固定中發(fā)揮重要作用。根系中大部分酚酸特異性或非特異性地酯化在細(xì)胞壁中，并且可能在根系抵抗應(yīng)激源中發(fā)揮重要作用。

酶系統(tǒng)和非酶系統(tǒng)在應(yīng)對(duì)金屬脅迫引起的氧化損傷起到及其重要的作用，研究植物酶系統(tǒng)和非酶系統(tǒng)對(duì)金屬脅迫的響應(yīng)機(jī)制，對(duì)探究BV增強(qiáng)紫蘇Cd富集能力至關(guān)重要。本研究結(jié)果表明，未噴施BV時(shí)，葉和根系以高Cd脅迫下的膜脂氧化損傷更大（圖6），這與Chen et al.（2020）的主成分分析結(jié)果相似。而噴施BV引起了不同Cd濃度脅迫下葉和根系的損傷差異。在低Cd脅迫下，葉中以CAT、POD和APX酶系統(tǒng)發(fā)揮主導(dǎo)作用。在高Cd脅迫下，葉中以酚酸和類黃酮等非酶系統(tǒng)發(fā)揮主導(dǎo)作用。而根中各Cd濃度脅迫引起的差異是酶系統(tǒng)和非酶系統(tǒng)共同作用的結(jié)果。通過施加BV，引起各濃度Cd脅迫下葉和根系中各指標(biāo)的差異，且低Cd脅迫下葉的差異更大。造成這種現(xiàn)象的原因是植物在低Cd脅迫下生理組織未受到嚴(yán)重破壞，抗氧化酶活性的提高可以抵抗不利環(huán)境，而在高Cd脅迫下，抗氧化酶活系統(tǒng)對(duì)ROS的去除無法滿足植物的生長需要，此時(shí)非酶系統(tǒng)發(fā)揮關(guān)鍵作用（Pan et al.，2021）。在高Cd脅迫下，噴施BV對(duì)葉和根系各指標(biāo)的差異不顯著，表明BV對(duì)高Cd脅迫下的毒性緩解作用較弱，這可能由于高Cd脅迫下植物的生理已經(jīng)受到嚴(yán)重的損害，BV無法逆轉(zhuǎn)植物的組織損傷。

綜上所述，隨Cd濃度的升高，紫蘇POD和APX酶活性下降，酶系統(tǒng)受到一定程度的損傷，MDA含量增加，導(dǎo)致生物量下降。在Cd脅迫條件下，噴施BV提高了POD、APX酶活性以及類黃酮和酚酸類物質(zhì)含量，降低了MDA含量，表明噴施BV可以通過增強(qiáng)紫蘇的抗氧化系統(tǒng)來緩解Cd脅迫，以保證紫蘇的正常生理活動(dòng)。此外，主成分分析結(jié)果表明，BV可以改善低鎘脅迫下紫蘇的酶系統(tǒng)和非酶系統(tǒng)來增加植物對(duì)逆境環(huán)境的適應(yīng)性，而對(duì)高Cd脅迫下植物生理損傷，BV的影響效果較小。

4 結(jié)論

（1）竹醋液可以提高Cd脅迫下紫蘇生物量、地下部和地上部Cd含量，提高紫蘇的Cd富集效率。

（2）竹醋液通過提高紫蘇的類黃酮和酚酸類物質(zhì)含量，調(diào)節(jié)紫蘇抗氧化酶活性，改善Cd脅迫下紫蘇的ROS清除系統(tǒng)，提高紫蘇抵抗不良環(huán)境的能力。