梁燚彤，李澤敏，吳宇倫，邱光磊，吳海珍，韋朝海*

1.華南理工大學環(huán)境與能源學院，廣東 廣州 510006；2.華南理工大學生物科學與工程學院，廣東 廣州 510006

厭氧氨氧化（Anammox）具有節(jié)省曝氣能耗、無需外加碳源和污泥產(chǎn)量低等優(yōu)勢，被認為是最具有前景的廢水脫氮工藝（Wu et al.，2022）。目前，Anammox工藝已開始應用于實際含氨氮廢水的研究，如焦化廢水、垃圾滲濾液、污泥消化液等（Zhou et al.，2020；Huo et al.，2022），通常以短程硝化（PN）和Anammox的工藝組合（PN-A）出現(xiàn)（陳重軍等，2014；Han et al.，2020）。然而，鑒于嚴格的總氮（TN）排放要求與PN-A工藝的局限性，在處理含氨氮廢水時，仍需考慮如下問題：（1）Anammox工藝產(chǎn)生的11.2%的NO3-將限制TN的達標或超低排放（Cao et al.，2021；李澤瑩等，2022）；（2）長期穩(wěn)定的部分硝化作用難以維持（Bao et al.，2017）。由此，PN階段的NO2-/NO3-的溢出不可避免，部分硝化帶來的NO2-的積累過量或不足是客觀存在的。因此，面對含氨氮廢水，Anammox不僅需要一個前端處理工藝（PN），更需要一個后端處理工藝（短程反硝化），以應對水質(zhì)演變過程中不同價態(tài)含氮化合物的濃度區(qū)間比例，最終實現(xiàn)總氮的徹底去除。

短程反硝化（PD）耦合厭氧氨氧化技術(shù)是實現(xiàn)含氨氮廢水最終氮達標或超低排放的關(guān)鍵技術(shù)，包括異養(yǎng)反硝化耦合Anammox工藝（Cao et al.，2021；朱紫旋等，2023），利用有機碳源驅(qū)動異養(yǎng)反硝化菌將殘余的NO3-還原為NO2-。同樣，自養(yǎng)反硝化（AuDen）與Anammox的耦合作用也能實現(xiàn)相同的目的，并且在成本效益、環(huán)境友好和工藝性能等方面表現(xiàn)出額外的優(yōu)勢（Di Capua et al.，2019）。然而，無論是異養(yǎng)反硝化還是自養(yǎng)反硝化（AuDen）與Anammox工藝的耦合，都依賴于反硝化菌與厭氧氨氧化菌（AnAOB）之間的協(xié)同合作。其中，反硝化菌（以FeS作為電子供體）必須足夠高效，能夠為AnAOB產(chǎn)生足夠的NO2-（公式 (1)），同時又不能過于強大，否則，反硝化菌會進一步將NO2-還原為N2（公式 (2)）。因此，Anammox（公式 (3)）與AuDen之間（公式 (1)和 (2)）的反應過程控制非常重要。

NO2-作為中間代謝物，是影響AnAOB與反硝化菌相互作用（合作/競爭）的關(guān)鍵因素。理想情況下，AnAOB與反硝化菌之間實現(xiàn)短程反硝化-厭氧氨氧化的協(xié)同合作能夠?qū)崿F(xiàn)高效脫氮。然而，當AnAOB與反硝化菌共培養(yǎng)時，NO2-作為共同競爭底物，如果反硝化菌生長速率過快，會對AnAOB造成威脅，長期運行，可能導致AnAOB的衰退與消亡（馬景德等，2019；Pan et al.，2019）。Ma et al.（2021）通過FeS驅(qū)動PD-A工藝在長期（120 d）運行的連續(xù)流實驗中發(fā)現(xiàn)，由于硫自養(yǎng)反硝化菌（SOB）與AnAOB對NO2-的競爭導致系統(tǒng)不穩(wěn)定和脫氮性能下降，Anammox對TN去除的貢獻從95.0%下降至80.0%。類似地，Qin et al.（2019）和Wu et al.（2020）在S2-驅(qū)動的PD-A工藝長期運行過程中也能發(fā)現(xiàn)了AnAOB的相對豐度下降或AnAOB的脫氮性能下降的現(xiàn)象。Yang et al.（2020）進一步表明，在S2O32-驅(qū)動的PD-A工藝運行過程中，當NO2-濃度不足時，AuDen反應是Anammox反應的3.40倍。因此，有必要研究NO2-對耦合系統(tǒng)AnAOB和SOB的相互作用與影響機制，對長期脫氮性能及微生物群落加以分析，可為Anammox耦合系統(tǒng)在含氨氮廢水中的穩(wěn)定高效運行提供調(diào)控策略。

本研究利用厭氧生物流化床反應器（AFBR）構(gòu)建了Anammox與FeS驅(qū)動的AuDen耦合體系（FSDADAS）。通過模擬NO2-積累的廢水水質(zhì)，評估不同NO2-濃度積累條件下長期反應器運行脫氮過程的穩(wěn)定性和效能，分析基質(zhì)效應與協(xié)同效應之間的關(guān)系；基于高通量測序的結(jié)果，對長期連續(xù)流反應器的微生物群落演替、微生物相互作用、水質(zhì)環(huán)境與微生物群落之間的相關(guān)性進行了分析，重點考察AnAOB與SOB基于NO2-的變化規(guī)律，闡明耦合系統(tǒng)的微生物群落的底物響應。通過以上工作，為厭氧氨氧化耦合技術(shù)的工程化應用及其過程調(diào)控提供原理參考。

1 材料與方法

1.1 反應裝置

實驗采用厭氧生物流化床（AFBR），裝置結(jié)構(gòu)見圖1，反應器由有機玻璃制成，總高52.0 cm，反應區(qū)內(nèi)徑50.0 mm，外徑90.0 mm，有效容積2.50 L，在反應器底部持續(xù)通入氮氣，維持流態(tài)化與厭氧狀態(tài)（DO<0.10 mg·L-1）。反應器頂部設(shè)置三相分離器，防止污泥流失。合成廢水經(jīng)蠕動泵從反應器底部流入，從頂部溢出并收集出水。反應器外壁設(shè)置水浴循環(huán)層，溫度控制在 (32±1) ℃范圍內(nèi)。

圖1 AFBR運行裝置Figure 1 Schematic diagram of AFBR

1.2 接種污泥與實驗用水

厭氧氨氧化種子污泥為實驗室長期馴化培養(yǎng)污泥，其混合液懸浮物（MLSS）和混合液揮發(fā)性懸浮物（MLVSS）質(zhì)量濃度分別為5.30 g·L-1和4.20 g·L-1，30 min內(nèi)沉淀污泥量（SV30）為29%，污泥體積指數(shù)（SVI）為55.70 mL·g-1。在培養(yǎng)階段，最高氮去除負荷（NRR）為 (0.790±0.100) kg·m-3·d-1。Anammox優(yōu)勢菌屬為Candidatuskuenenia，占整個群落的0.28%。自養(yǎng)反硝化種子污泥通過收集廣州某污水處理廠厭氧池污泥并馴化培養(yǎng)3個月后，其MLSS和MLVSS質(zhì)量濃度分別為4.60 g·L-1和3.40 g·L-1。SV30為35.0%，SVI為76.1 mL·g-1。在富集階段，最高NRR為0.400 kg·m-3·g-1。16S rRNA基因測序結(jié)果顯示，Proteobacteria為優(yōu)勢門，占群落的44.4%，自養(yǎng)反硝化污泥中的優(yōu)勢屬為Thiobacillus，占14.3%，未發(fā)現(xiàn)與厭氧氨氧化功能相關(guān)的屬。厭氧氨氧化污泥與自養(yǎng)反硝化污泥的質(zhì)量濃度按照MLSS為1:1的比例混合接種，種子污泥均由實驗室長期富集培養(yǎng)，自養(yǎng)反硝化電子供體采用硫化亞鐵，在缺氧的水相環(huán)境下通過共沉淀法合成FeS。接種后的混合污泥MLSS和MLVSS分別為4.95 g·L-1和3.41 g·L-1，污泥體積約占反應器總體積的30.0%。

實驗采用合成廢水，主要由底物、礦物介質(zhì)和微量元素組成。以NH4Cl、NaNO2和NaNO3作為氮源，底物質(zhì)量濃度按需配比。礦物介質(zhì)包括NaHCO3、KH2PO4、MgSO4·7H2O、CaCl2·2H2O，微量元素的主要成分包括FeSO4·7H2O、ZnSO4·7H2O、CoCl2·6H2O、MnCl2·4H2O、CuSO4·5H2O、NaMoO4·2H2O、NiCl2·6H2O、H3BO3和EDTA（Van De Graaf et al.，1996）。

1.3 運行條件

通過模擬不同亞硝酸鹽濃度的水質(zhì)條件，探究亞硝酸鹽對耦合系統(tǒng)的長期影響。根據(jù)進水中亞硝酸鹽和硝酸鹽的含量，試驗分為3個階段：N0反應啟動階段、A1–4硝酸鹽不足階段（ρ(NO3-)/ρ(NH4+)=0.50，ρ(NO2-)=0、50、100、150 mg·L-1）、B1–4硝酸鹽充足階段（ρ(NO3-)/ρ(NH4+)=1.00，ρ(NO2-)=0、50、100、150 mg·L-1），實驗進水pH始終保持7.80左右，各階段的運行時間和實驗操作條件如表1所示。

表1 AFBR在不同階段的操作條件Table 1 Operational conditions of the AFBR at different phases

每天收集一次進水和出水樣品，測量pH值以及N、S和Fe的濃度。在每個操作階段結(jié)束時（即第21、35、50、65、80、95、110、125和140天）進行污泥樣品的收集，9個污泥樣品名稱分別標記為N0、A1、A2、A3、A4、B1、B2、B3和B4。

1.4 測試方法

1.4.1 指標測定與分析

指標檢測方法參考相關(guān)國家標準方法（國家環(huán)境保護總局，2002）。水樣通過0.22 μm水系濾膜過濾后分別檢測與分析，無機陰離子（NO3--N、NO2--N和SO42--S）使用離子色譜法（ICS-900，美國）、NH4+-N采用鈉氏試劑分光光度法、Fe(II)/總Fe采用鄰菲羅啉分光光度法、以及MLSS/MLVSS采用重量法，而pH、DO分別通過便攜式溶氧儀（JPBJ-608，中國）和pH計（PHBJ-260，中國）進行測量。

1.4.2 微生物分析

如1.2節(jié)所提及，在每個階段結(jié)束時收集AFBR完全混合后的污泥樣品，用液氮快速冷凍并保存至-80 ℃冰箱中，后委托上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進行16S rRNA基因測序。采用細菌通用引物515F（5′-GTGCCAGCMGCCGCGG-3′）和907R（5′-CCGTCAATTCMTTTRAGTTT-3′）對16S rRNA基因V4－V5區(qū)域進行PCR擴增。

1.5 數(shù)理分析與計算方法

厭氧氨氧化和自養(yǎng)反硝化對AFBR中總氮的去除貢獻率計算方法參考文獻（Ji et al.，2020），見公式(1)和 (2)，分別用CAN和CAD表示。

2 結(jié)果與討論

2.1 亞硝酸鹽對耦合系統(tǒng)脫氮效能的影響

2.1.1 亞硝酸鹽對耦合系統(tǒng)主反應（氮）的影響

為了研究NO2-對耦合系統(tǒng)的脫氮能力的影響，在長期實驗中，通過調(diào)節(jié)進水物料比，對各種形態(tài)氮的去除加以分析。圖2為AFBR耦合反應器運行期間氮的質(zhì)量濃度變化及去除效果。啟動階段（N0，1－21 d），在無積累的NO2-條件（ρ(NO3-)/ρ(NH4+)=1.00）下，出水NH4+-N和NO3--N的濃度不斷下降，總氮去除率不斷提高，表明反應器內(nèi)自養(yǎng)反硝化與厭氧氨氧化的同時發(fā)生，兩者耦合成功。運行10 d后，反應器脫氮效能趨于穩(wěn)定，出水NO3--N濃度接近0，然而，總氮去除負荷（TNRR）水平較低（0.050kg·m-3·d-1），出水NH4+-N質(zhì)量濃度處在 (23.8±2.0)mg·L-1范圍內(nèi)，出水TN質(zhì)量濃度較高，超出廢水排放達標值（20 mg·L-1）；Anammox對總氮貢獻率從80.5%下降至68.0%。估計是由啟動階段耦合反應器內(nèi)SOB與AnAOB底物NO2-的競爭，兩者之間的協(xié)同效應較差所導致的（Wu et al.，2020；Ma et al.，2021）。

圖2 厭氧流化床反應器（AFBR）的脫氮性能Figure 2 Nitrogen removal performance of anaerobic fluidized bed reactor (AFBR)

在硝酸鹽不足的階段（A，22－80 d），反應器進水ρ(NO3-)/ρ(NH4+)質(zhì)量濃度不變（ρ(NO3-)/ρ(NH4+)=0.50），積累的NO2-的質(zhì)量濃度逐漸提高（ρ(NO2-)/ρ(NH4+)=0－1.50）。A1–4階段出水NO3--N和NO2--N的質(zhì)量濃度均接近0，剩余氮主要是NH4+-N。當積累的NO2--N質(zhì)量質(zhì)量濃度為0、50、100和150 mg·L-1時，A1–4階段的總氮去除效率分別為48.8%±2.3%、88.1%±3.4%、97.5%±1.4%和98.4%±1.7%，總氮去除負荷分別達到0.100、0.250、0.340和0.420 kg·m-3·d-1。以A1階段（22－35 d）作為對照組，在NO2-積累的條件（A2–4）下，總氮去除效率和總氮去除負荷顯著提高（P<0.05）。值得注意的是，與對照組相比，A2階段出水NH4+-N質(zhì)量濃度從(74.3±1.3) mg·L-1大幅下降至 (20.5±2.8) mg·L-1，總氮去除效率從48.8%±2.3%大幅上升至88.1%±3.4%，說明在硝酸鹽不足、未滿足Anammox底物基質(zhì)比（1.32）之前，所積累的NO2--N（50 mg·L-1）更傾向于被AnAOB所利用，系統(tǒng)脫氮能力提高可能是由于積累的NO2-能夠調(diào)節(jié)兩者之間的協(xié)同效應，使耦合系統(tǒng)向有利于脫氮方向發(fā)展的緣故。

在硝酸鹽充足的階段（B，81－140 d），反應器進水ρ(NO3-)/ρ(NH4+)質(zhì)量濃度不變（ρ(NO3-)/ρ(NH4+)=1.00），積累的NO2-質(zhì)量濃度逐漸提高（ρ(NO2-)/ρ(NH4+)=0－1.50）。B1–4階段出水NO3--N和NO2--N質(zhì)量濃度接近于0，剩余氮主要是NH4+-N。當積累的NO2--N質(zhì)量濃度為0、50、100和150 mg·L-1時，B1–4階段的總氮去除率分別為80.3%±3.2%、93.6%±3.7%、98.5%±1.1%和97.3%±1.5%，總氮去除負荷分別達到0.230、0.330、0.420和0.480 kg·m-3·d-1。以B1階段（81－95 d）作為對照組，在有NO2-的條件（B2–4）下，總氮去除率和去除負荷顯著提高（P<0.05）。值得注意的是，與對照組相比，B2階段的出水NH4+-N質(zhì)量濃度從(36.1±3.3) mg·L-1下降至 (12.1±2.9) mg·L-1，總氮去除率從80.3%±3.2%提高至93.6%±3.7%，表明在基本滿足Anammox反應基質(zhì)比時，積累的NO2--N（50 mg·L-1）亦傾向于被AnAOB所利用，耦合系統(tǒng)的脫氮能力提高。因此，無論在硝酸鹽不足（ρ(NO3-)/ρ(NH4+)=0.50）或硝酸鹽充足（ρ(NO3-)/ρ(NH4+)=1.00）條件下，隨著積累的（ρ(NO2-)/ρ(NH4+)=0－1.50）質(zhì)量濃度增加，總氮去除率和去除負荷顯著提高，所積累的NO2-更傾向于被AnAOB所利用，促進了AnAOB與SOB之間的協(xié)同脫氮效應，耦合系統(tǒng)的脫氮能力顯著提高。

將B1與A2組（ρ(NOx-)/ρ(NH4+)=1.00，TN=200 mg·L-1）進行對比發(fā)現(xiàn)，在NO2-積累條件（A2）下，系統(tǒng)的脫氮率從80.3%±3.2%提高至88.1%±3.4%，Anammox對TN去除的貢獻率從81.7%±2.4%提高至92.5%±2.3%，認為是AnAOB與SOB之間對底物NO2-的競爭效應減小，協(xié)同效應加強的緣故。對比B2組和A3組，B3組和A4組，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，同樣是在NO2-積累的環(huán)境中，所積累的NO2-越高，TN去除率提高或保持，SO42-的實際產(chǎn)量相對減少，Anammox對TN去除的貢獻率略有下降，說明過量的NO2-積累濃度并不意味著脫氮效率越好，直接影響Anammox的反應，正如文獻所報道，大量的研究（Huang et al.，2022；韓雪恪等，2023）證實了過量的NO2–會抑制細菌生長，尤其是AnAOB的生長。NO2–濃度過高將會刺激Anammox松散的細胞外聚合物的快速分泌，導致Anammox顆粒污泥氣體釋放通道堵塞，進一步導致污泥崩解（Wan et al.，2022）。因此，以相同的TN、NH4+-N含量作為衡量尺度，適量的NO2-積累的環(huán)境會使Anammox對TN去除的貢獻率及耦合系統(tǒng)的脫氮效率提高，所積累的NO2-能夠緩解AnAOB與SOB之間的競爭，加強了協(xié)同效應。

2.1.2 亞硝酸鹽對耦合系統(tǒng)副產(chǎn)物（硫、鐵）的影響

副產(chǎn)物是反應體系冗余能量的體現(xiàn)，能夠從側(cè)面反映主反應的脫氮趨勢。圖3為AFBR耦合反應器運行期間副產(chǎn)物的濃度變化情況。硫酸鹽是FeS驅(qū)動的自養(yǎng)反硝化（AuDen）脫氮過程的副產(chǎn)物之一，理論上，還原1 mg的NO3--N和NO2--N可分別產(chǎn)生1.27 mg和0.76 mg的SO42--S。AuDen反應的副產(chǎn)物越少，說明耦合系統(tǒng)積累的NO2-越趨向Anammox反應。由圖3可知，N0階（1－21 d），SO42--S產(chǎn)量從30.5 mg·L-1一直增加至41.1 mg·L-1，說明NO2-更趨向于被SOB所利用。A1–4階段的SO42--S實際產(chǎn)生值依次為 (44.4±1.6)、(52.8±3.2)、(74.6±3.0) 和 (105.0±2.3) mg·L-1，分別是理論值的0.700、0.520、0.540、0.590倍，由此可見，在硝酸鹽不足的階段，在有NO2-積累條件（A2–4）下，AuDen反應的SO42--S產(chǎn)量相對減少，因此，NO2-更傾向于被AnAOB所利用。同理，B1–4階段的SO42--S實際產(chǎn)生量分別為 (75.2±1.9)、(85.6±1.8)、(114.4±2.7)和 (150.1±4.7) mg·L-1，分別是理論值的0.590、0.520、0.560、0.620倍，由此可見，在硝酸鹽充足的階段，在有NO2–積累的條件（B2–4）下，NO2-也能調(diào)節(jié)AnAOB與SOB之間的協(xié)同作用，減少AuDen反應的SO42-產(chǎn)生量，在一定程度上促進了Anammox反應的發(fā)生。值得注意的是，將B1與A2、B2與A3、B3與A4（ρ(NOx-)/ρ(NH4+)=1.00、1.50、2.00，TN=200、250、300 mg·L-1）階段進行對比發(fā)現(xiàn)，相同含量的NOx-，積累的NO2-含量越高（A2–4），AuDen反應的SO42-產(chǎn)量相對減少，正如2.1.1所述，Anammox對TN去除的貢獻百分比及耦合系統(tǒng)的脫氮效率顯著提高，主要是由于AnAOB與SOB之間對底物NO2-的競爭效應減小、協(xié)同效應加強的緣故。

圖3 厭氧流化床反應器（AFBR）的硫、鐵元素變化Figure 3 Changes of sulfur and iron in anaerobic fluidized bed reactor (AFBR)

鐵也是FeS驅(qū)動的自養(yǎng)反硝化（AuDen）脫氮過程的副產(chǎn)物，主要以Fe(II)/Fe(III)的沉淀物或類次生礦物（FeOOH）的形式存在（Gong et al.，2016；Hu et al.，2020），但反應產(chǎn)生的鐵化合物與污泥混合，表現(xiàn)為無定型態(tài)或結(jié)晶較差的顆粒，這與文獻報道一致（Gramp et al.，2010）。由圖3可知，在反應器運行過程中，對照組Fe(II)/總Fe的比例呈下降趨勢，實驗組全階段的Fe(II)/總Fe基本維持在20%－30%范圍內(nèi)，說明NO2-積累的環(huán)境使鐵的變化比較穩(wěn)定。綜上，通過副產(chǎn)物SO42-的產(chǎn)量相對（理論值或?qū)Ρ仍囼灒┫陆第厔菘梢园l(fā)現(xiàn)，隨著NO2-濃度增加，NO2-更傾向于被AnAOB所利用，有利于提高耦合系統(tǒng)的脫氮能力。

2.2 亞硝酸鹽對微生物群落的影響

2.2.1 微生物多樣性和豐富度分析

AFBR耦合反應器微生物多樣性和豐富度如表2所示，實驗中9組微生物測序樣本覆蓋率（Coverage）均大于0.999，能保證測序結(jié)果的準確性。Shannon和Simpson指數(shù)代表樣品多樣性，Chao和ACE指數(shù)代表樣品豐富度。由表2可知，實驗組（A2–4和B2–4）的Chao和ACE指數(shù)與對照組（A1和B1）數(shù)值相當，表明反應器豐富度變化不大。A1–4和B1–4的Simpson指數(shù)呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，Shannon指數(shù)呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢，一致表明群落多樣性先降低后升高，這是因為隨著NO2--N濃度的增加，一定量（50－100 mg·L-1）的NO2--N能夠滿足Anammox的生長需求和調(diào)節(jié)AnAOB與SOB之間的協(xié)同作用，過量（150 mg·L-1）的NO2--N則會對微生物群落造成抑制或脅迫作用（Sijbesma et al.，1996；Wan et al.，2022）。

表2 不同階段的菌群微生物多樣性指數(shù)Table 2 Richness and diversity of microbial communities in different phases

2.2.2 微生物群落演替分析

反應器的脫氮性能主要由微生物群落組成結(jié)構(gòu)和功能微生物的功能共同決定。將微生物檢測相對豐度>1.00%的菌門作為主要菌門，耦合群落各階段微生物門水平的組成如圖4所示。9組微生物群落中共發(fā)現(xiàn)12個主要菌門，主要以Proteobacteria（34.8%－78.4%）為主，其次為Chloroflexi（2.9%－12.1%）、Bacteroidota（2.7%－12.2%）、Actinobacteriota（1.5%－10.2%）等。

圖4 門水平的微生物群落相對豐度Figure 4 Relative abundance of microbial community at phylum level

SOB所在的Proteobacteria門是微生物在細菌域分布最廣的門類，涵蓋多種代謝途徑的微生物，如硫自養(yǎng)反硝化菌（SOB，如Thiobacillus、Sulfurifustis等）、異養(yǎng)反硝化菌（HDB，如Denitratisoma、Limnobacter等）、好氧亞硝化菌（AOB，如Nitrosomonas、Ellin6067等）（Sharma et al.，2022）。而AnAOB所在的Planctomycetota門僅占0.26%－1.51%，主要是包括Candidatuskuenenia，Ca.brocadia和Ca.anammoximicrobium（Dedysh et al.，2020），雖然所占比例較少，但是仍能表現(xiàn)出較高的脫氮水平，與Du et al.（2017）的研究結(jié)果相似，其厭氧氨氧化反應器中檢測的Ca.kuenenia僅占0.23%。其他在厭氧氨氧化系統(tǒng)中常見的菌門包括Chloroflexi門和Bacteroidota門，根據(jù)文獻（Lawson et al.，2017）報道，前者能夠降解AnAOB分泌的蛋白質(zhì)和多糖類化合物，進一步穩(wěn)定厭氧氨氧化顆粒污泥的結(jié)構(gòu)，后者主要為反硝化菌群（PHOS-HE36、Ignavibacterium、SJA-28、AKYH767等），能夠和AnAOB進行氮交換（NO3-和NO2-），這些功能被認為與AnAOB的代謝實現(xiàn)功能互補，有利于AnAOB的代謝與活性。由圖4可知，隨著積累的NO2-濃度增加，Proteobacteria門的豐度表現(xiàn)出先升高后降低的趨勢，而Planctomycetota門及與AnAOB的共生菌門Chloroflexi和Bacteroidota均表現(xiàn)出豐度先降低后升高的趨勢。這表明所積累的NO2-濃度增加促進了SOB的生長而抑制了AnAOB及其共生群落的生長，但這種抑制作用對Anammox的脫氮效果影響不大，系統(tǒng)較高的NH4+-N去除效率驗證了以上觀點，主要原因可能與酶的活性表達相關(guān)。Kartal et al.（2016）認為，AnAOB緩慢的生長速率與Hzs活性密切相關(guān)；Wan et al.（2022）認為一定濃度的NO2--N（30 mg L-1）能夠促進Hzs基因簇的電子的聚集和轉(zhuǎn)移，使AnAOB代謝相關(guān)的酶基因（Hzs，Hdh等）均上調(diào)。因此，盡管所積累的NO2-使AnAOB豐度下降，但提高了Hzs基因的表達。

從屬水平進一步解釋在不同階段中功能微生物的演替。將微生物檢測相對豐度>0.50%的菌屬作為主要分析對象，從9組微生物樣品中共檢測出30個屬，圖5為屬水平的功能微生物熱圖。由圖5可見，對所觀察的A1–4和B1–4兩組實驗，除Thiobacillus，Ca.kuenenia和Desulfurivibrio、SM1A02、1013-28-CG33、SC-I-84外，其他功能微生物菌均表現(xiàn)出從橙色變藍色的趨勢，即豐度在不斷下降，尤其在A3–4和B1–4階段。結(jié)合2.2.1節(jié)的物種多樣性和豐富度的分析，反應器運行期間豐富度幾乎不變，而Simpson和Shannon指數(shù)一致，表明群落多樣性先降低后上升，因此，隨著NO2-的氮負荷提高，微生物的功能逐漸具體化，由污染負荷造成的水質(zhì)環(huán)境條件（如NO2-、SO42-、NO3-、NH4+、Fe(II)/Fe(III)等），將對功能微生物進行環(huán)境選擇，從而優(yōu)化了群落功能，使耦合系統(tǒng)的脫氮能力顯著提高。

圖5 屬水平上的功能微生物熱圖Figure 5 Heatmap of functional microorganisms at genus level

具體來說，Ca.kuenenia是典型的AnAOB，參與耦合系統(tǒng)發(fā)生Anammox反應，成為能夠降解NH4+-N和NO2--N的主要功能微生物，即使呈現(xiàn)一定的下降趨勢，但仍能保持一定的豐度和活性（橙色），這在2.1.1節(jié)NH4+-N的去除效率中得到驗證。Thiobacillus屬于典型的SOB，參與耦合系統(tǒng)中的AuDen反應，能夠降解NO3--N和NO2--N的主要功能微生物，而Desulfurivibrio則為典型的硫酸鹽還原菌，能夠還原由AuDen產(chǎn)生的SO42-，兩種相對的微生物豐度從深藍色變成橙色，即豐度上升，C.kuenenia、Thiobacillus以及Desulfurivibrio這三類微生物是耦合系統(tǒng)主要的功能微生物，受到積累程度不同的NO2-濃度的調(diào)節(jié)。另外，SM1A02、1013-28-CG33、SC-I-84等微生物屬于水解菌（Rambo et al.，2020），以蛋白質(zhì)、多糖化合物為食，當水質(zhì)環(huán)境污染負荷脅迫其他微生物的生存時，不少功能微生物豐度下降（橙色變藍色），甚至死亡，而SM1A02、1013-28-CG33、SC-I-84等水解菌就成為這種場景的獲益者，尤其是在高濃度的NO2-積累條件（A3–4、B3–4）下，這類水解菌的豐度越高。根據(jù)以上數(shù)據(jù)及分析，可以歸納為：環(huán)境（NO2-）不僅影響了微生物種群的結(jié)構(gòu)與功能，相反，微生物種群能夠調(diào)整結(jié)構(gòu)來適應影響它們的環(huán)境。

2.2.3 水質(zhì)條件與微生物群落之間的相關(guān)性

由于物種樣品數(shù)據(jù)的DCA結(jié)果顯示第一軸軸長為3.88（≥3.50），采用典型相關(guān)性分析法（CCA）對AFBR反應器各階段的進水NO2--N濃度、NH4+-N去除率、NO3--N去除率、出水SO42--S濃度、Fe比例、Anammox和AuDen對TN去除的貢獻率等理化性質(zhì)與關(guān)鍵功能微生物之間的作用關(guān)系進行分析，結(jié)果如圖6所示。紅圈代表AnAOB類，紫圈代表SOB類，黃圈代表異養(yǎng)反硝化菌（HDB）類。可以發(fā)現(xiàn)，以Ca.kuenenia代表的AnAOB的豐度與NH4+-N的去除率（P=0.0207）、Anammox對TN去除的貢獻率（P=0.0418）和Fe比例（P=0.00262）均呈正相關(guān)關(guān)系，而與NO2--N濃度（P=0.539）呈負相關(guān)關(guān)系。而SOB的主要優(yōu)勢菌屬Thiobacillus與NO2--N濃度（P=0.00533）、SO42--S（P=0.0253）、AuDen對TN去除的貢獻率（P=0.0221）呈正相關(guān)關(guān)系，與NO3--N去除率（P=0.123）、Fe比例（P=0.121）呈負相關(guān)關(guān)系。NO2--N濃度與Anammox和AuDen對TN去除的貢獻率都呈銳角（P=0.00767），因此，NO2-濃度與Anammox、AuDen對總氮的貢獻都呈正相關(guān)關(guān)系。

圖6 不同廢水水質(zhì)與脫氮理化性質(zhì)和群落組成之間的典型相關(guān)性分析（CCA）Figure 6 Canonical correlation analysis (CCA) between different wastewater quality and physicochemical properties and community composition of denitrification

此外，以Truepera、Denitratisoma、Limnobacter等為代表的大部分異養(yǎng)反硝化菌與NO3--N去除率、NH4+-N去除率和Anammox對TN去除的貢獻率呈正相關(guān)關(guān)系，雖然耦合系統(tǒng)的主要營養(yǎng)類型為化能自養(yǎng)型，但AnAOB所分泌的物質(zhì)或死亡的微生物可作為部分異養(yǎng)反硝化菌能量或碳源物質(zhì)，AnAOB與異養(yǎng)反硝化菌之間也可以進行氮交換。典型的硫酸鹽還原菌Desulfurivibrio與硫酸鹽濃度呈較強的正相關(guān)關(guān)系。降解體系中功能微生物群落的獨特性與多樣化表明，廢水水質(zhì)特征和環(huán)境參數(shù)決定了微生物群落的組成，所出現(xiàn)的微生物功能網(wǎng)絡(luò)，極大增強了生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定性，而微生物結(jié)構(gòu)與功能穩(wěn)定性同時受到污/廢水溶液性質(zhì)與環(huán)境條件的保護。

3 結(jié)論

（1）在Anammox與AuDen耦合的系統(tǒng)中，NO2-積累（ρ(NO2-)/ρ(NH4+)=0－1.50）的環(huán)境可明顯降低AuDen反應副產(chǎn)物SO42-的產(chǎn)生量，同時顯著提高Anammox的反應活性和總氮去除效率，證明了NO2-能夠加強AnAOB與SOB之間的協(xié)同作用。

（2）NO2-積累的水質(zhì)條件能夠優(yōu)化群落結(jié)構(gòu)與功能，誘導耦合系統(tǒng)脫氮能力的提高。隨著NO2-濃度的增加，主要功能微生物（Thiobacillus、Ca.kuenenia及Desulfurivibrio等）相對豐度穩(wěn)定或上升，水解菌（SM1A02、1013-28-CG33、SC-I-84等）相對豐度升高，而其他功能微生物相對豐度降低。

（3）相關(guān)性分析表明，NO2-濃度與耦合系統(tǒng)中SOB、AnAOB的主要優(yōu)勢菌屬分別呈正、負相關(guān)關(guān)系，且與Anammox、AuDen對總氮去除的貢獻都成正相關(guān)關(guān)系，NO2-是Anammox耦合系統(tǒng)的微生物群落結(jié)構(gòu)與廢水理化指標的主控環(huán)境化學因子。

（4）NO2-存在的濃度-誘導-適應機制成為影響Anammox與AuDen耦合系統(tǒng)脫氮的驅(qū)動力，即環(huán)境決定了微生物種群的結(jié)構(gòu)與功能，相反，微生物種群也會通過結(jié)構(gòu)調(diào)整來適應影響它們的環(huán)境。