何林鑫, 黃 榮, 田望軍, 靳振海, 趙 亮, 陳海雁, 張振粉

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院, 草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 中-美草地畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展研究中心, 甘肅 蘭州 730070)

梨火疫病(Fire blight)是薔薇科植物的毀滅性病害之一,該病在北美一直是梨(Pyrusspp.)、蘋(píng)果(MaluspumilaMill.)、櫻桃(Prunusspp.)等果樹(shù)的毀滅性細(xì)菌病害,也是最古老、研究最深入的植物病害之一[1]。由于受侵染的花、枝條和病葉會(huì)變成黑褐色并呈現(xiàn)出枯萎的癥狀,但是仍掛在樹(shù)上不脫落形似火燒一樣,故稱此病害為“火疫病”[2-3]。2016年5月梨火疫病在新疆伊犁州首次報(bào)道發(fā)生[4]。目前,梨火疫病已在我國(guó)新疆、甘肅2個(gè)省(自治區(qū))65個(gè)縣、市(區(qū))[5]發(fā)生并對(duì)果農(nóng)造成嚴(yán)重?fù)p失,其病菌幾乎能夠侵染寄主植物的所有組織[6];寄主植物的花被病菌感染后呈現(xiàn)整個(gè)花序呈黑色,干枯萎蔫下垂;葉片被感染后會(huì)出現(xiàn)葉脈褪綠黃化,最終失水變?yōu)楹稚玔7];果實(shí)被感染后果面開(kāi)始變黑、腐爛并出現(xiàn)乳白色的菌膿[8];枝干感病后呈現(xiàn)皮層收縮、下陷,形成較大的梭形紅褐色或黑褐色干腐狀病斑[9]。除此之外,還有許多研究證實(shí),梨火疫病菌會(huì)引起植物自身體內(nèi)存在的防御機(jī)制酶的變化,王宏等(2019)在對(duì)4種早熟梨葉片進(jìn)行抗病性鑒定時(shí),發(fā)現(xiàn)病原菌會(huì)誘導(dǎo)了過(guò)氧化物酶(Peroxidase,POD)、超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)活性的上升[10]。何臨梓(2022)在對(duì)4種梨砧木對(duì)梨火疫病進(jìn)行抗病相關(guān)酶活性變化分析時(shí),發(fā)現(xiàn)梨火疫病病原菌誘導(dǎo)了4種梨砧木過(guò)氧化氫酶(Catalase,CAT)、超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)、多酚氧化酶(Polyphenol oxidase,PPO)等五種酶活性的升高和丙二醛(Malondialdehyde,MDA)含量的增加[11]。因此,梨火疫病病菌對(duì)植物生長(zhǎng)的影響需要被高度關(guān)注。

甘肅是草地資源大省,同時(shí)也是我國(guó)草地畜牧業(yè)占重要地位的省份之一,全省草地總面積1 790萬(wàn)hm2,位居全國(guó)第6位[12],其中,紫花苜蓿(Medicagosativa)作為優(yōu)質(zhì)牧草是甘肅省的主要種植牧草,其在甘肅省的種植面積占全國(guó)種植面積的1/3,位居全國(guó)之首[13];草木犀(Melilotusofficinalis)對(duì)環(huán)境具有很強(qiáng)的適應(yīng)能力,作為重要的鹽堿地改良作物在甘肅大面積種植[14];沙打旺(Astragalusadsurgens)是我國(guó)重要的栽培豆科牧草,具有出色的抗風(fēng)沙能力,也是甘肅主要的種植牧草之一[15]。不可否認(rèn),病害也是牧草生產(chǎn)的主要限制因素之一,可直接影響牧草的生長(zhǎng),降低牧草產(chǎn)量、影響牧草品質(zhì),嚴(yán)重時(shí)導(dǎo)致植物死亡,從而引致草地早衰和退化,甚至導(dǎo)致家畜中毒,降低家畜生產(chǎn)性能[16]。更為重要的是,目前梨火疫病已經(jīng)傳入甘肅省武威市(涼州區(qū),民勤縣),張掖市(甘州區(qū),肅南縣,民樂(lè)縣,臨澤縣,高臺(tái)縣,山丹縣)[17]。由于受到地理、環(huán)境和氣候等因素影響,甘肅部分地區(qū)不適宜種植糧食作物,農(nóng)民為了提高收益選擇種植果樹(shù)并在林間種植牧草作為飼料來(lái)以飼養(yǎng)家畜[18],已經(jīng)形成了林草交錯(cuò)的生態(tài)群。然而,果樹(shù)感染梨火疫病,其感病組織脫落后掉入林間草地中,梨火疫病病菌直接與牧草接觸,是否會(huì)感染林下常見(jiàn)豆科牧草,進(jìn)而限制草地生產(chǎn)率,還缺少相關(guān)科學(xué)研究。一旦新發(fā)病原微生物進(jìn)入當(dāng)?shù)厣鷳B(tài)系統(tǒng),將嚴(yán)重威脅生態(tài)健康和限制農(nóng)牧業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。

綜上所示,本試驗(yàn)以紫花苜蓿、草木犀、沙打旺為供試豆科牧草,以本實(shí)驗(yàn)室已分離鑒定的梨火疫病優(yōu)勢(shì)致病菌株歐文氏菌DE2(Erwiniasp.DE2)為供試病原細(xì)菌菌株,通過(guò)生長(zhǎng)瓶[19]萌發(fā)試驗(yàn)測(cè)定DE2接種后對(duì)3種牧草種子的苗期生長(zhǎng)及體內(nèi)相關(guān)酶活性的影響,分析接種DE2后的3種牧草苗期生長(zhǎng)和生理指標(biāo),來(lái)確定梨火疫病的優(yōu)勢(shì)致病菌對(duì)我國(guó)主要栽培草地的豆科牧草的潛在危害,以期為評(píng)估和綜合防控林草系統(tǒng)中新發(fā)病原微細(xì)菌提供科學(xué)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試種子:草木犀、紫花苜蓿、沙打旺,由甘肅省農(nóng)科院提供,并保存在4℃冰箱。

供試菌株:梨火疫病的優(yōu)勢(shì)致病菌——?dú)W文氏菌DE2,由本實(shí)驗(yàn)室分離鑒定并保存,該菌GenBank注冊(cè)號(hào)為:OQ608623。

供試培養(yǎng)基:大豆酪蛋白瓊脂培養(yǎng)基(Tryptose soya agar,TSA/TSB)[20],主要用于菌株純化。

1.2 菌株培養(yǎng)

參照劉華威[21]的細(xì)菌培養(yǎng)方法稍作改動(dòng)。首先將供試菌株接種于TSA培養(yǎng)皿上,放入28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后進(jìn)行活化,再挑取單菌落利用平板劃線法接種于TSA培養(yǎng)皿上放入28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h,然后挑選單菌落接種于TSB培養(yǎng)液中,放入恒溫培養(yǎng)箱中,設(shè)置溫度為28.5℃,轉(zhuǎn)速為160 r·min-1培養(yǎng)24 h,將菌液離心后棄置上清液,加入無(wú)菌水震蕩搖勻,將其懸浮為濃度108cfu·mL-1的菌懸液[22]。

1.3 確定菌懸液濃度建立DE2的標(biāo)準(zhǔn)曲線方法

參照朱艷靜[23]的方法,有改動(dòng)。取6支無(wú)菌試管,取培養(yǎng)好的菌懸液,按照不同的設(shè)定稀釋倍數(shù)(5,10,20,50,100,200倍),加入無(wú)菌水依次進(jìn)行稀釋,用分光光度計(jì)在600 nm標(biāo)準(zhǔn)波長(zhǎng)下測(cè)得一組不同濃度菌懸液的吸光度,測(cè)試前用無(wú)菌水進(jìn)行調(diào)零,在無(wú)菌工作臺(tái)上吸取上述稀釋得到的不同濃度梯度的菌懸液,分別用無(wú)菌水按10倍比例稀釋成不同濃度的菌懸液。取稀釋倍數(shù)在10-4～10-8每個(gè)濃度的菌懸液吸取1 mL注入TSA培養(yǎng)皿上進(jìn)行平板涂布,放置28℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后用肉眼觀察,點(diǎn)出菌落數(shù)后記錄,挑選菌落數(shù)在30～300個(gè)的平板作為菌落總數(shù)測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn),并乘以其對(duì)應(yīng)的稀釋倍數(shù),最終計(jì)算出不同濃度菌懸液的菌液濃度。以吸光度ABS值為橫坐標(biāo),菌懸液濃度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.4 發(fā)芽試驗(yàn)和接種方法

采用生長(zhǎng)瓶(高度12.0 cm,直徑8.0 cm)用高壓滅菌鍋進(jìn)行滅菌(121℃,26 min)后進(jìn)行接種。參照《牧草種子檢驗(yàn)規(guī)程GB/T2930.4-2001》[24]挑選干凈的種子,在無(wú)菌工作臺(tái)中用75%酒精振蕩消毒2 min,無(wú)菌水沖洗2次;1% 次氯酸鈉(NaClO)浸泡5 min,無(wú)菌水沖洗3～4次,用無(wú)菌濾紙瀝干種子表面水分。在無(wú)菌工作臺(tái)中以200 mL的OD600為1.0左右的DE2菌液為培養(yǎng)基質(zhì)加入生長(zhǎng)瓶中,每種牧草取25粒種子,保持一定距離、整齊的擺放于生長(zhǎng)瓶發(fā)芽床,設(shè)置4個(gè)重復(fù),對(duì)照用無(wú)菌水代替菌液。在溫度23℃、濕度45%、光照+黑暗(18 h+6 h)的組培室進(jìn)行培養(yǎng),觀察14 d后取樣。

1.5取樣方法

接種后的14 d,每個(gè)生長(zhǎng)瓶取10株幼苗測(cè)定其生長(zhǎng)指標(biāo);采集每個(gè)處理組和對(duì)照組的幼苗整株各1.0 g左右,測(cè)定其生理指標(biāo),設(shè)置3次重復(fù)。

1.6 指標(biāo)的測(cè)定及方法

1.6.1測(cè)定發(fā)芽指標(biāo) 根據(jù)《草種子檢驗(yàn)規(guī)程發(fā)芽試驗(yàn)GB/T2930.4-2017》[25],草木犀種子在種植后第4 d進(jìn)行初次計(jì)數(shù)(發(fā)芽勢(shì)),在第7 d進(jìn)行末次計(jì)數(shù)(發(fā)芽率);紫花苜蓿種子在種植后第4 d天進(jìn)行初次計(jì)數(shù),在第10 d進(jìn)行末次計(jì)數(shù);沙打旺種子在種植后第4 d進(jìn)行初次計(jì)數(shù),在第14 d進(jìn)行末次計(jì)數(shù)。

1.6.2測(cè)定生長(zhǎng)指標(biāo) 根長(zhǎng)(Root length,RL)和苗長(zhǎng)(Seedling length,SL):隨機(jī)從各處理取出10株幼苗,測(cè)量幼苗由植株最高部到根基部為苗長(zhǎng),根基部到根尖為根長(zhǎng)。

鮮重(Fresh weight,FW)和干重(Dry weight,DW):隨機(jī)從各處理取出10株幼苗,用吸水紙吸干幼苗表面水分測(cè)定其鮮重,用錫紙包裹幼苗放入烘箱,75℃烘48 h至恒重后稱重即為干重。

1.7 數(shù)據(jù)分析

運(yùn)用Excel與Origin pro 2021進(jìn)行數(shù)據(jù)整理并繪圖,利用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 13.0對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 建立DE2標(biāo)準(zhǔn)曲線及確定菌懸液濃度

如圖1所示,以吸光度ABS值為橫坐標(biāo),菌懸液濃度為縱坐標(biāo)繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線,其建立的回歸方程為y=1E+08x-6E+06(R2=0.999 7),標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸系數(shù)可達(dá)0.99以上,準(zhǔn)確度很高。根據(jù)曲線可確定后續(xù)接種試驗(yàn)中所采用的DE2菌懸液濃度為108cfu·mL-1時(shí)其OD600為1.0。

圖1 歐文氏菌DE2菌株的標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 DE2對(duì)3種牧草種子的發(fā)芽的影響

由表1所示,沙打旺、草木犀與紫花苜蓿在接種DE2后發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽率和發(fā)芽指數(shù)相比對(duì)照都有降低。其中草木犀分別降低了28.48%,18.99%,28.57%,差異顯著(P<0.05);紫花苜蓿分別降低了22.73%,20.01%,22.51%,差異顯著(P<0.05);沙打旺的發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽率下降不明顯,但發(fā)芽指數(shù)相比對(duì)照顯著降低(P<0.05)。表明DE2抑制了3種牧草種子的發(fā)芽。

表1 DE2對(duì)3種牧草種子萌發(fā)的影響

2.3 DE2對(duì)3種牧草幼苗生長(zhǎng)指標(biāo)的影響

2.3.1DE2對(duì)3種牧草幼苗鮮重、干重、根長(zhǎng)和苗長(zhǎng)的影響 由圖2所示,接種后的3種牧草相比于對(duì)照的鮮重和苗長(zhǎng)都無(wú)顯著變化,干重相比于對(duì)照3種牧草都有減少但是不顯著,根長(zhǎng)都明顯降低,分別降低了89.50%,92.69%,93.46%,差異顯著(P<0.05)。表明DE2對(duì)3種牧草幼苗的根系生長(zhǎng)有明顯抑制作用。

圖2 接種DE2后3種牧草的鮮重、干重、根長(zhǎng)和苗長(zhǎng)

2.4 DE2對(duì)3種牧草幼苗生理指標(biāo)的影響

圖3 3種牧草接種DE2后SOD活性與含量的變化

2.4.2DE2對(duì)3種牧草CAT與GSH-Px活性與H2O2含量的影響 由圖4所示,草木犀、紫花苜蓿、沙打旺的CAT活性與對(duì)照相比明顯增加,分別增長(zhǎng)了138.14%,32.36%,73.67%,差異顯著(P<0.05);草木犀、紫花苜蓿的GPX活性相較于對(duì)照降低,分別降低了12.55%,26.33%(P<0.05),而沙打旺的GPX活性增加了38.11%(P<0.05);草木犀與沙打旺的H2O2含量相較與對(duì)照有所增加,分別增加了43.29%,35.56%,差異顯著(P<0.05),紫花苜蓿的H2O2含量無(wú)明顯變化。

圖4 3種牧草接種DE2后CAT與GSH-Px活性與H2O2含量的變化

2.4.3DE2對(duì)3種牧草MDA與可溶性蛋白含量的變化 由圖5所示,接種后草木犀、紫花苜蓿的MDA含量相較于對(duì)照均有增加,分別增加了8.65%,6.35%,差異顯著(P<0.05),而沙打旺的MDA含量降低了37.17%(P<0.05);接種后草木犀、紫花苜蓿、沙打旺的可溶性蛋白含量相較與對(duì)照組均有所降低,分別降低了12.01%,31.90%,17.12%,差異顯著(P<0.05)。

圖5 3種牧草接種DE2后MDA與可溶性蛋白含量的變化

2.5 接種DE2后3種牧草各生理指標(biāo)的增長(zhǎng)率與降低率

圖6 接種DE2后3種牧草各生理指標(biāo)的增長(zhǎng)率與降低率

2.6 接種DE2后3種牧草幼苗各自指標(biāo)間的相關(guān)性分析

圖7 接種DE2后草木犀各指標(biāo)間的相關(guān)性分析

圖8 接種DE2后紫花苜蓿各指標(biāo)間的相關(guān)性分析

圖9 接種DE2后沙打旺各指標(biāo)間的相關(guān)性分析

3 討論

3.1 DE2對(duì)3種豆科牧草幼苗生長(zhǎng)的影響

植物病害可影響植株生長(zhǎng)的各個(gè)階段,研究表明,植物病害可以通過(guò)侵染植株葉片影響植株光合和呼吸作用植物病害,還可以通過(guò)侵染植物根部和莖部,使植株根、莖腐爛,水分和養(yǎng)分運(yùn)輸受阻,從而使植株產(chǎn)量下降,品質(zhì)降低[26-27]。在種子外部的病原菌則會(huì)直接侵染種子使其壞死或者產(chǎn)生一些有毒的代謝物質(zhì),影響種子的萌發(fā),進(jìn)而影響植物生長(zhǎng)[28]。本試驗(yàn)表明,接種DE2后3種牧草種子的發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)均有降低,其中紫花苜蓿與草木犀的各發(fā)芽指標(biāo)顯著降低,與安調(diào)過(guò)[29]、邢小萍[30]對(duì)于黑胚病致病菌會(huì)抑制小麥(Triticumaestivum)種子的發(fā)芽結(jié)果一致。此外本研究還發(fā)現(xiàn)接種DE2后各牧草幼苗的鮮重、干重和苗長(zhǎng)與對(duì)照無(wú)顯著差異,但各牧草的根長(zhǎng)均顯著低于對(duì)照,表明該菌具有從豆科牧草根部侵入的能力,而侵入位點(diǎn)可能位于根毛生長(zhǎng)的部位或者根尖區(qū)域[31]。還有研究表明,植物病原菌突破根表皮后,首先會(huì)對(duì)寄主根的皮層區(qū)域的細(xì)胞造成損傷,且病原菌感染蒺藜苜蓿的根部后造成的主要癥狀便是根生長(zhǎng)的停滯[32]。根據(jù)汪建軍[33]的報(bào)道,接種燕麥(Avenasativa)細(xì)菌性葉枯病致病菌后,燕麥根冠比顯著低于對(duì)照,這與本試驗(yàn)結(jié)果相一致。說(shuō)明DE2具有很強(qiáng)的致病性與破壞性,明顯抑制了草木犀、紫花苜蓿與沙打旺種子的萌發(fā)和幼苗根系的生長(zhǎng)。

3.2 DE2對(duì)3種牧草幼苗生理指標(biāo)的影響

CAT也是生物防御系統(tǒng)的關(guān)鍵酶之一,生物學(xué)功能是催化細(xì)胞內(nèi)H2O2的分解防止過(guò)氧化[40],如陶明福[41]報(bào)道檳榔受到黃化病病原菌的侵染后,染病植株體內(nèi)CAT活性總體增大,增加了對(duì)H2O2的降解,從而有利于檳榔植株體內(nèi)H2O2含量的降低,本研究表明3種豆科牧草接種DE2后CAT活性均顯著增加,而接種后的草木犀與沙打旺的H2O2含量也顯著增加,紫花苜蓿的H2O2含量相比于對(duì)照組無(wú)明顯變化,說(shuō)明草木犀與沙打旺幼苗產(chǎn)生的CAT不足以分解來(lái)自DE2造成的氧化損失而產(chǎn)生的H2O2,草木犀與沙打旺CAT活性顯著升高可能與其限制病菌擴(kuò)展能力有關(guān)[42]。GPX是一種含巰基的過(guò)氧化物酶,可以清除機(jī)體內(nèi)的H2O2、有機(jī)氫過(guò)氧化物及脂質(zhì)過(guò)氧化物,阻斷ROS自由基對(duì)機(jī)體的進(jìn)一步損傷[43]。本試驗(yàn)中接種后的草木犀與紫花苜蓿的GPX活性相比對(duì)照都降低,沙打旺的GPX活性顯著增加而接種后的沙打旺的H2O2濃度也顯著增加,說(shuō)明沙打旺對(duì)DE2的抗性弱,當(dāng)植物收到脅迫時(shí),多數(shù)GPX的表達(dá)及活性會(huì)增強(qiáng),但也有表達(dá)活性降低的情況[44],例如,在滲透或甲基紫精誘導(dǎo)脅迫條件下,大麥(Hordeumvulgare)的2個(gè)GPX同工酶活性增強(qiáng),而第3個(gè)同工酶(HvGPX3)的活性下調(diào)[45],雖然在逆境脅迫下,GPX的表達(dá)增強(qiáng),但也有表達(dá)下調(diào),因此植物同一物種中的相同亞細(xì)胞器來(lái)源的不同GPX,或不同亞細(xì)胞來(lái)源的同一種GPX,其具體的作用機(jī)制都需要進(jìn)一步比較研究[46]。

MDA是膜脂過(guò)氧化最重要的產(chǎn)物之一,它的產(chǎn)生還能加劇膜的損傷,因此在植物衰老生理和抗性生理研究中,MDA含量是一個(gè)常用指標(biāo),可通過(guò)MDA了解膜脂過(guò)氧化的程度,從而間接測(cè)定膜系統(tǒng)受損程度以及植物的抗逆性[47]。可溶性蛋白是重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),他們的增加和積累能提高細(xì)胞的保水能力,對(duì)細(xì)胞的生命物質(zhì)及生物膜起到保護(hù)作用,因此經(jīng)常用作篩選抗性的指標(biāo)之一[48]。本試驗(yàn)中,接種DE2后草木犀與紫花苜蓿的MDA含量相比于對(duì)照顯著增加,說(shuō)明草木犀與紫花苜蓿在受到DE2侵染時(shí)脂膜過(guò)氧化而丙二醛不斷地積累,使得蛋白質(zhì)變性,細(xì)胞膜的通透性不斷增大,從而導(dǎo)致電解質(zhì)大量的外滲,使植物細(xì)胞破壞。這與蔣學(xué)飛[49]的報(bào)道中植株在受到病菌侵害MDA大量增加相一致。本試驗(yàn)中,接種后的草木犀、紫花苜蓿與沙打旺的可溶性蛋白含量相比對(duì)照都有所下降,可能是隨著DE2侵染脅迫的加重,植株體內(nèi)積累的ROS可以攻擊某些蛋白質(zhì)的氨基酸殘基,尤其是半胱氨酸(Cys)、酪氨酸(Tyr)、色氨酸(Tpr)、甲硫氨酸(Met)和苯丙氨酸(Phe),使之形成羰基衍生物;ROS還能夠引起分子內(nèi)和分子間交聯(lián),如形成二硫鍵等,導(dǎo)致體內(nèi)可溶性蛋白含量有所下降[50]。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)確定梨火疫病優(yōu)勢(shì)致病菌歐文氏菌DE2在人工接種條件下,均能危害3種供試豆科牧草的幼苗階段,具體表現(xiàn)為:歐文氏菌DE2抑制草木犀與紫花苜蓿的發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù),以及沙打旺的發(fā)芽指數(shù);接種DE2后3種牧草的根部生長(zhǎng)受到的抑制尤其明顯,且不同程度的影響其幼苗生理抗氧化指標(biāo)。本試驗(yàn)確定梨火疫病的優(yōu)勢(shì)致病菌對(duì)我國(guó)主要栽培草地的豆科牧草具有潛在危害,為評(píng)估和綜合防控林草系統(tǒng)中新發(fā)病原微細(xì)菌提供科學(xué)基礎(chǔ)。