劉麗虹，程曦，楊柳，張偉龍，夏冰，寇娜

(1.石家莊市農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心，石家莊 050000; 2.河北興柏農(nóng)業(yè)科技股份有限公司河北省阿維菌素生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，石家莊 051530)

阿維菌素是阿維鏈霉菌深層發(fā)酵而得的高效低毒生物農(nóng)藥和醫(yī)藥中間體，在農(nóng)業(yè)、畜牧業(yè)和醫(yī)藥領(lǐng)域都有廣泛的應(yīng)用[1]。21 世紀(jì)，隨著基因編輯、合成生物學(xué)等現(xiàn)代前沿生物技術(shù)在微生物育種上的應(yīng)用，構(gòu)建出主產(chǎn)阿維菌素B1a 工程菌的產(chǎn)業(yè)化，阿維菌素放罐效價(jià)達(dá)7～8 g/L[2-3]，同時(shí)大量發(fā)酵效價(jià)增長(zhǎng)的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，發(fā)酵培養(yǎng)的前4 d，日平均效價(jià)增長(zhǎng)量?jī)H為其后的1/2。這是由于阿維鏈霉菌菌體生長(zhǎng)與產(chǎn)物合成非偶聯(lián)，其發(fā)酵培養(yǎng)經(jīng)過生長(zhǎng)繁殖期、穩(wěn)定期和產(chǎn)素期，由于穩(wěn)定期的存在，阿維菌素生物合成所需的各種前體物質(zhì)和酶的積累有個(gè)過程，對(duì)前期效價(jià)增長(zhǎng)有一定程度的影響。為此，業(yè)界開展了前體物質(zhì)對(duì)效價(jià)影響的研究，來縮短穩(wěn)定期，提高發(fā)酵效價(jià)。陳海燕等[4]研究了在發(fā)酵培養(yǎng)過程中滴加丙酸鈉、乙酸鈉對(duì)效價(jià)的影響。王文亮等[5]研究了在培養(yǎng)基中添加纈氨酸、亮氨酸作為前體物質(zhì)對(duì)效價(jià)增長(zhǎng)的影響。程曦等[6]研究了在發(fā)酵前期補(bǔ)入產(chǎn)素期發(fā)酵液，誘導(dǎo)處于生長(zhǎng)繁殖期的阿維鏈霉菌生物合成阿維菌素。阿維菌素生物合成本質(zhì)是阿維鏈霉菌進(jìn)行復(fù)雜的生物化學(xué)反應(yīng)過程，其生化反應(yīng)總速度由相對(duì)較慢的步驟決定，添加一種或幾種前體物質(zhì)難以保證生化反應(yīng)速度的整體提高，嘗試開展在阿維菌素發(fā)酵培養(yǎng)基中添加阿維菌素廢菌渣作為前體混合物的工藝研究，在回收利用廢菌渣的同時(shí)，提高阿維菌素發(fā)酵效價(jià)。

阿維菌素廢菌渣是阿維菌素發(fā)酵液經(jīng)過濾、烘干、萃取、干燥后的固體物質(zhì)(以下通稱菌渣)，主要成分為阿維鏈霉菌菌絲體、助濾劑及其初級(jí)代謝產(chǎn)物，阿維菌素B1a 含量?jī)H為0.1%～0.2%。生態(tài)環(huán)境部出臺(tái)的《國(guó)家危險(xiǎn)廢物名錄(2021 年版)》規(guī)定，將抗生素菌渣按照危險(xiǎn)廢物處置和管理，限制其作為肥料和飼料的應(yīng)用。當(dāng)前主要的處置方式為焚燒[7]，既增加碳排放、浪費(fèi)能源和資源,又有悖于綠色低碳發(fā)展的理念。而生態(tài)環(huán)境部出臺(tái)的《制藥工業(yè)污染防治技術(shù)政策》鼓勵(lì)企業(yè)研究、開發(fā)、推廣發(fā)酵菌渣在生產(chǎn)工藝中的再利用技術(shù)。筆者就此在搖瓶及50 L 發(fā)酵罐上研究了培養(yǎng)基中添加菌渣對(duì)發(fā)酵效價(jià)及培養(yǎng)過程的影響，為循環(huán)利用菌渣和進(jìn)一步提高發(fā)酵效價(jià)提供思路、方法和相關(guān)數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

阿維鏈霉菌(Streptomyces avermitilis)AVX-33由河北興柏農(nóng)業(yè)科技股份有限公司菌種室提供。

1.1.2 設(shè)備

20 L 種子罐、50 L 發(fā)酵罐，配套有補(bǔ)料、DO和pH 等自動(dòng)控制系統(tǒng)和具有數(shù)據(jù)采集及分析功能的軟件系統(tǒng)(鎮(zhèn)江東方生物工程設(shè)備技術(shù)公司)；NDJ-1 型旋轉(zhuǎn)式黏度計(jì)(上海越平科學(xué)儀器有限公司)；TS-211B 臥式恒溫?fù)u床(無錫瑪瑞特科技有限公司)；Agilent 1260 高效液相色譜儀(安捷倫科技有限公司)。

1.1.3 菌渣

來源于本公司提取車間(F622-20221127)，黑褐色粉末或顆粒狀，過40 目篩篩選。主要成分為粗蛋白、粗纖維和無氮浸出物(表1)及17 種氨基酸，其中谷氨酸1.61%、亮氨酸1.32%、甘氨酸1.22%、丙氨酸1.06%、脯氨酸1.03%、天門冬氨酸0.94%、纈氨酸0.90%等，含量最低的蛋氨酸0.050%。

表1 菌渣主要成分及含量 (%)

1.2 培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件

1.2.1 搖瓶種子培養(yǎng)基

質(zhì)量濃度分別為玉米淀粉25 g/L，熱軋黃豆餅粉8 g/L，花生餅粉10 g/L，酵母膏4 g/L，酵母粉5 g/L，氯化鈷10 mg/L，消前pH 8.0～8.5。

培養(yǎng)條件：搖床轉(zhuǎn)速220 r/min，溫度28～29 ℃，培養(yǎng)時(shí)間2～3 d。

1.2.2 搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基

質(zhì)量濃度分別為淀粉140g/L，熱軋黃豆餅粉21g/L，酵母粉8 g/L，菌渣8 g/L，輕質(zhì)碳酸鈣1.6 g/L，淀粉酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.025%；消前pH 7.5～8.0，搖瓶裝量50 mL/250mL，接種量5 mL。

培養(yǎng)條件：溫度27～28 ℃，轉(zhuǎn)速220 r/min，培養(yǎng)時(shí)間10～12 d。

1.2.3 種子罐(20 L)

原材料質(zhì)量濃度分別為淀粉22 g/L，熱軋黃豆餅粉6 g/L，酵母粉3g/L，花生粉6 g/L，酵母膏3 g/L，氯化鈷10 mg/L；計(jì)料體積12 L，消前pH 9.0～9.5、消后pH 7.3～7.8。

培養(yǎng)條件：溫度28～29 ℃，空氣流量10～25 L/min，攪拌轉(zhuǎn)速200～600 r/min，培養(yǎng)時(shí)間2～3 d。

1.2.4 發(fā)酵罐(50 L)

按接后體積計(jì)算投料量，原材料質(zhì)量濃度分別為淀粉140 g/L，熱軋黃豆餅粉21 g/L，酵母粉8 g/L，菌渣8 g/L，輕質(zhì)碳酸鈣1.6 g/L，淀粉酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.025%；消后體積33～35 L，接種量8%～10%。

培養(yǎng)條件：溫度27～28 ℃，攪拌轉(zhuǎn)速600 r/min，空氣流量30～45 L/min，培養(yǎng)時(shí)間10～12 d。

1.3 測(cè)定方法

1.3.1 黏度測(cè)定

取發(fā)酵液適量，選2#轉(zhuǎn)子，將黏度計(jì)的轉(zhuǎn)子沒于發(fā)酵液中，并使液面淹沒于轉(zhuǎn)子的凹槽刻度處，開啟黏度計(jì)，旋轉(zhuǎn)穩(wěn)定后讀取黏度值。

1.3.2 生物量測(cè)定

準(zhǔn)確量取50 mL 發(fā)酵液置于250 mL 三角瓶中，添加適量助濾劑。于水浴鍋中升溫至約95 ℃，維持3～5 min，抽濾得濾餅，適量熱水洗，102 ℃烘干至恒重，降溫稱量(W2)，計(jì)算生物量。

式中：20 為換算系數(shù)，W1為助濾劑質(zhì)量，W0為濾布質(zhì)量。

1.3.3 B1a 效價(jià)測(cè)定

精確稱取2 mL 發(fā)酵液，加入50 mL 容量瓶中，再添加適量甲醇至規(guī)定位置，超聲浸取10～20 min，甲醇定容、過濾待用。

HPLC 系統(tǒng)：色譜柱C18、4.6 mm×250 mm，柱溫30 ℃，流動(dòng)相甲醇∶水=9∶1 (體積比)，流量1.0 mL/min、測(cè)量用波長(zhǎng)246 nm，進(jìn)樣量20 μL，記錄測(cè)量的峰面積，外標(biāo)法計(jì)算B1a 效價(jià)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同質(zhì)量濃度菌渣對(duì)效價(jià)的影響

為考察菌渣對(duì)發(fā)酵效價(jià)的影響情況，對(duì)其設(shè)計(jì)了5 個(gè)質(zhì)量濃度：4、6、8、10、12 g/L。其中，每個(gè)質(zhì)量濃度接3 支三角瓶進(jìn)行搖瓶試驗(yàn)，圖1 數(shù)據(jù)(平均值±標(biāo)準(zhǔn)差)顯示，隨著菌渣質(zhì)量濃度的增加，放瓶效價(jià)逐漸提高，當(dāng)菌渣質(zhì)量濃度達(dá)8 g/L時(shí)，放瓶效價(jià)最高，達(dá)到8 053μg/mL，這是由于培養(yǎng)基中添加菌渣后，等效于發(fā)酵液中提前積累了阿維鏈霉菌的初級(jí)代謝產(chǎn)物，縮短了穩(wěn)定期，相對(duì)延長(zhǎng)了產(chǎn)素期，提高放瓶效價(jià)。而后又逐步下降，當(dāng)菌渣質(zhì)量濃度增至12 g/L，放瓶效價(jià)下降至7 432μg/mL，是由于菌渣中存在的某些限制性物質(zhì)過量，抑制了阿維菌素的生物合成。故以菌渣質(zhì)量濃度8 g/L，在50 L 發(fā)酵罐研究其對(duì)發(fā)酵效價(jià)、生物量和黏度等指標(biāo)的影響情況。

圖1 菌渣質(zhì)量濃度對(duì)效價(jià)的影響

2.2 菌渣對(duì)發(fā)酵效價(jià)的影響

將培養(yǎng)好的種子液按10%接種量分別轉(zhuǎn)入相同培養(yǎng)條件的試驗(yàn)組和對(duì)照組。圖2 為11 批次起步效價(jià)對(duì)比數(shù)據(jù)，培養(yǎng)基添加菌渣罐批平均起步效價(jià)(平均值±標(biāo)準(zhǔn)差)(479±81)μg/mL，較對(duì)照組(385±82)μg/mL 高94 μg/mL，增加24.0%，有顯著提高(P單尾=0.007)?？股刈鳛榇渭?jí)代謝產(chǎn)物，是由于初級(jí)代謝產(chǎn)物的過量積累和外界環(huán)境脅迫所產(chǎn)生的有利于其生產(chǎn)的代謝活動(dòng)[8]，在阿維菌素發(fā)酵培養(yǎng)基中加入適量菌渣相當(dāng)于提前積累了阿維鏈霉菌的初級(jí)代謝產(chǎn)物和添加合成阿維菌素所需的前體物質(zhì)，有利于初級(jí)代謝向次級(jí)代謝的轉(zhuǎn)化，縮短穩(wěn)定期，提高發(fā)酵起步效價(jià)。圖3 為11 批次放罐效價(jià)對(duì)比數(shù)據(jù)，試驗(yàn)組平均放罐效價(jià)(平均值±標(biāo)準(zhǔn)差)(8 042±716)μg/mL，較對(duì)照組(7 366±563)μg/mL 高676μg/mL，增加9.0%，有顯著提高(P單尾=0.011)。這是由于試驗(yàn)組添加菌渣后，有利于初級(jí)代謝向次級(jí)代謝的轉(zhuǎn)化，縮短了穩(wěn)定期，相對(duì)延長(zhǎng)了產(chǎn)素期，即增加了阿維鏈霉菌生物合成阿維菌素的時(shí)間，提高了放罐效價(jià)；試驗(yàn)組標(biāo)準(zhǔn)差716μg/mL，較對(duì)照組563 μg/mL 高153μg/mL，無顯著差異(P=0.46)。

圖2 菌渣對(duì)起步效價(jià)的影響

圖3 菌渣對(duì)放罐效價(jià)的影響

2.3 菌渣對(duì)生物量、黏度的影響

生物量表示單位體積發(fā)酵液中菌絲體的數(shù)量，與其他理化指標(biāo)一樣對(duì)發(fā)酵效價(jià)有重要影響，其濃度大小與培養(yǎng)基特別是其中氮源含量密切相關(guān)[9]。將培養(yǎng)好的種子液依次接入試驗(yàn)罐和對(duì)照罐，29 h開始取樣檢測(cè)試驗(yàn)罐和對(duì)照罐的生物量(圖4)。結(jié)果表明：29 h 生物量分別快速達(dá)到36.3、28.8 g/L，這期間主要表現(xiàn)為阿維鏈霉菌的生長(zhǎng)繁殖期，隨后生物量的增加相對(duì)較慢，增加機(jī)理主要表現(xiàn)為發(fā)酵液的蒸發(fā)作用，至281 h 放罐生物量分別為52.8、42.3 g/L，且全程表現(xiàn)為試驗(yàn)罐生物量高于對(duì)照罐，原因在于試驗(yàn)罐培養(yǎng)基加入了8 g/L 的菌渣。但在發(fā)酵培養(yǎng)的后期增加的更多，是由于隨著發(fā)酵的進(jìn)行，阿維鏈霉菌自身產(chǎn)生了某些蛋白酶，酶解并利用菌渣中的粗蛋白引起一定程度的二次生長(zhǎng)繁殖，但此時(shí)的阿維鏈霉菌已經(jīng)具有次級(jí)代謝能力，表現(xiàn)出菌體生長(zhǎng)繁殖與產(chǎn)物合成同時(shí)進(jìn)行的混合型發(fā)酵特征，所以并未對(duì)效價(jià)增長(zhǎng)造成影響。此現(xiàn)象有別于傳統(tǒng)的阿維鏈霉菌菌體生長(zhǎng)與產(chǎn)物合成非偶聯(lián)特征。

圖4 菌渣對(duì)生物量的影響

黏度作為發(fā)酵控制的重要指標(biāo)，對(duì)發(fā)酵液中氧的傳遞有重大影響。其高低除了與生物量有關(guān)外，還與菌絲形態(tài)、代謝過程密切相關(guān)。圖5 表明：發(fā)酵培養(yǎng)29、41 h 試驗(yàn)罐生物量明顯高于對(duì)照罐，但黏度(69.6、74.2 mPa·s)與對(duì)照罐(71.4、73.8 mPa·s)相當(dāng)，這是由于試驗(yàn)罐生物量高，與加入了質(zhì)量濃度8 g/L菌渣有關(guān)。但隨著發(fā)酵培養(yǎng)的深度進(jìn)行，發(fā)酵后期試驗(yàn)罐(88.4 mPa·s)黏度明顯高于對(duì)照罐(81.7 mPa·s)，這是由于發(fā)酵后期，試驗(yàn)罐菌渣中粗蛋白的酶解導(dǎo)致菌體二次生長(zhǎng)繁殖，菌體細(xì)胞原生質(zhì)飽滿，菌絲剛性增加所致[10]，且以后的多次試驗(yàn)，重復(fù)了這一現(xiàn)象。

圖5 菌渣對(duì)黏度的影響

3 結(jié)論

長(zhǎng)期以來，抗生素菌渣的處置技術(shù)限于政策困境，一方面嚴(yán)格限制其作為肥料、飼料的使用，而采取焚燒的處置方式，又有悖于低碳經(jīng)濟(jì)和科學(xué)發(fā)展觀，使菌渣的處置進(jìn)入兩難境地。開展菌渣無害化處理或循環(huán)利用菌渣的研究成為必然，以消除或減輕菌渣對(duì)環(huán)境污染的影響。張廣志等[11]在菌渣中分離出嗜熱脂肪芽孢桿菌，并進(jìn)行堆料發(fā)酵，以降解其中的阿維菌素，減輕菌渣中殘留阿維菌素對(duì)環(huán)境影響。劉小鵬等[12]研究了阿維菌素菌渣經(jīng)微生物發(fā)酵改性后替代其他氮源在阿維菌素發(fā)酵培養(yǎng)中的應(yīng)用技術(shù)，以降低阿維菌素生產(chǎn)費(fèi)用。由于阿維菌素是阿維鏈霉菌生長(zhǎng)繁殖到一定階段開始生物合成，本研究基于菌渣混合物的初級(jí)代謝產(chǎn)物特性，加入培養(yǎng)基后，等效于提前積累初級(jí)代謝產(chǎn)物和合成阿維菌素所需的基質(zhì)、前體和誘導(dǎo)物，有利于加快初級(jí)代謝向次級(jí)代謝的轉(zhuǎn)化進(jìn)程，提高起步效價(jià)；縮短穩(wěn)定期，即相對(duì)延長(zhǎng)產(chǎn)素期，提高放罐效價(jià)。

研究結(jié)果表明：在培養(yǎng)基中添加8 g/L 菌渣，能夠加快阿維鏈霉菌由初級(jí)代謝向次級(jí)代謝的轉(zhuǎn)化進(jìn)程，縮短阿維菌素發(fā)酵培養(yǎng)的穩(wěn)定期，提高發(fā)酵效價(jià)。其中，阿維菌素發(fā)酵起步效價(jià)增加24.0%、放罐效價(jià)增加9.0%，為進(jìn)一步工業(yè)化應(yīng)用提供數(shù)據(jù)和理論支撐。同時(shí)，該研究對(duì)其他菌體生長(zhǎng)繁殖與產(chǎn)物合成非偶聯(lián)型次級(jí)代謝發(fā)酵菌渣的再利用有借鑒價(jià)值。