張倩茹,梁梅芳,權(quán) 靜,2*

(1.東華大學(xué)生物與醫(yī)學(xué)工程學(xué)院,上海納米生物材料與再生醫(yī)學(xué)工程技術(shù)研究中心,上海 201620;2.區(qū)域性高發(fā)腫瘤早期防治研究教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣西區(qū)域性高發(fā)腫瘤早期防治研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣西 南寧 530022)

金納米籠(AuNCs)具有中空多孔狀結(jié)構(gòu),不僅可吸收近紅外波段(700～1 200 nm)的光波使其具有高光熱轉(zhuǎn)換效率,而且金納米籠空心內(nèi)壁和多孔壁結(jié)構(gòu)有利于裝載小分子、酶及藥物等,在生物醫(yī)藥領(lǐng)域備受關(guān)注[1-7]。然而,裸金納米籠容易發(fā)生聚沉現(xiàn)象,不能穩(wěn)定分散,在其表面接枝基團(tuán)得到功能化金納米籠復(fù)合物可在改善其穩(wěn)定性的同時拓展其功能性,使其在醫(yī)藥領(lǐng)域具有更廣泛的應(yīng)用前景[8]。Hu等[9]將引發(fā)劑負(fù)載于金納米籠,利用其光熱效應(yīng)引起腫瘤細(xì)胞ROS升高,從而誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。Shi等[10]在金納米籠表面修飾 pH 響應(yīng)的熒光探針,用于指示腫瘤位置,從而通過化療和熱療促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡。

將靶向基團(tuán)修飾在金納米籠表面,可為金納米籠粒子的靶向光熱治療提供可能性。糖基聚合物是指一種通過不同化學(xué)反應(yīng)將糖基組分引入到聚合物側(cè)鏈或端基的功能性高分子材料[11],不僅保持了糖分子良好的生物相容性和可降解性,而且便于利用糖-蛋白的特異性識別將納米復(fù)合材料靶向運(yùn)輸?shù)浇o藥部位實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)給藥,提高藥物運(yùn)輸效率[12-18]。

作者在課題組前期研究[19]的基礎(chǔ)上,將糖基聚合物P(DEGMA-co-OVNGlu)接枝到金納米籠表面制備糖基化金納米籠復(fù)合物AuNCs@P(DEGMA-co-OVNGlu),采用紫外可見吸收光譜(UV-Vis)和透射電鏡(TEM)等對其進(jìn)行表征[20],系統(tǒng)研究其理化性質(zhì)和光熱轉(zhuǎn)換效率,并考察糖基化金納米籠復(fù)合物與凝集素ConA的特異性識別作用,為后續(xù)金納米籠復(fù)合物的腫瘤靶向治療提供納米平臺。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 試劑與儀器

2-甲基-2-丙烯酸-2-(2-甲氧基乙氧基)乙酯(DEGMA)、S-十二烷基-S′-(2-羧基異丙基)三硫酯(DDATC),美國西格碼奧德里奇公司;6-O-乙烯基己二酸-D-吡喃型葡萄糖(OVNGlu),自制;偶氮二環(huán)己基甲腈(ACCN),天津光復(fù)精細(xì)化工研究所;葡萄糖,阿拉丁生化科技有限公司;50 nm金納米籠,西安瑞禧生物科技有限公司;N,N-二甲基甲酰胺(DMF),上海凌峰化學(xué)試劑有限公司;硼氫化鈉(NaBH4),國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;實(shí)驗(yàn)用水為超純水。

AVANCE 400型核磁共振波譜儀,瑞士Bruker公司;JEM-2100型透射電子顯微鏡(TEM),日本JEOL公司;Lambda 35型紫外可見分光光度計,日本PerkinElmer公司;Nexus-670型傅立葉變換紅外光譜儀(FTIR),美國Thermo公司;DZF-6021型真空干燥箱,上海坦?jié)蓛x器設(shè)備有限公司;DT-8891E型熱電偶溫度計,華盛昌(深圳)公司;ADR-1860型激光器,熙隆光電科技有限公司;3-30KS型離心機(jī),美國Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 糖基化金納米籠復(fù)合物的制備

以DEGMA、OVNGlu為原料,參照文獻(xiàn)[19]采用酶促可逆加成-斷裂鏈轉(zhuǎn)移(RAFT)聚合法制備糖基聚合物P(DEGMA-co-OVNGlu)。在避光條件下將2 mL 0.05 mg·mL-1金納米籠溶液和5 mL 0.1 mg·mL-1糖基聚合物溶液充分混合,每隔30 min加入0.5 mL 0.01 mol·L-1NaBH4溶液;連續(xù)5次后室溫避光,攪拌過夜;9 000 r·min-1離心10 min,重復(fù)2次,即得糖基化金納米籠復(fù)合物AuNCs@P(DEGMA-co-OVNGlu)。

1.2.2 分子量的測定

室溫下,保持流速為1 mL·min-1,將含糖量不同的糖基聚合物分別溶解于DMF中,得到濃度約5 mg·mL-1的待測溶液,經(jīng)0.45 μm的有機(jī)相針式過濾器過濾,濾液注射到樣品瓶中,采用凝膠滲透色譜法(GPC)測定分子量。

1.2.3 低臨界溶解溫度(LCST)的測定

在20～60 ℃范圍內(nèi)分別測定0.5 mg·mL-1糖基聚合物溶液和0.1 mg·mL-1糖基化金納米籠復(fù)合物溶液在500 nm處的吸光度;樣品池按0.5 ℃·min-1的升溫速率進(jìn)行升溫。LCST指通過變溫紫外測定溫敏聚合物達(dá)到溶液最大吸光度的50%時所對應(yīng)的溫度。

1.2.4 紫外可見吸收光譜分析

配制Au濃度相同的金納米籠溶液和糖基化金納米籠復(fù)合物溶液,在400～1 000 nm范圍內(nèi)進(jìn)行全波長掃描,繪制吸光度變化曲線。

1.2.5 光熱性能評價

取200 μL不同Au濃度(4、8、12、16、20,μg·mL-1)的糖基化金納米籠復(fù)合物溶液,在不同強(qiáng)度(0.8、1.0、1.2、1.4、1.6,W·cm-2)的808 nm激光下照射 300 s,利用熱電偶溫度計實(shí)時記錄溶液溫度,繪制T-t的變化曲線,并按下式計算糖基化金納米籠復(fù)合物的光熱轉(zhuǎn)換效率(η):

(1)

(2)

(3)

式中:Qdis為光熱光譜分析的材料系數(shù),mW;m和C分別為水的質(zhì)量(mg)和比熱容(J·kg-1·℃-1);ΔT為溫差,℃;t為激光照射時間,s;h為傳熱系數(shù),W·m-2·℃-1;S為表面積,m2;mi和Cp,i分別為溶液中不同物質(zhì)的質(zhì)量(mg)和比熱容(J·kg-1·℃-1);τ為傳熱時間常數(shù),s;Tmax和Tamb分別為溶液最高溫度和初始溫度,℃;I為激光的功率,W·m-2;A808為材料在808 nm處的特征吸收峰強(qiáng)度值。

1.2.6 凝集素ConA的識別測定

在37.0 ℃恒溫水浴鍋中,于0.05 mg·mL-1糖基化金納米籠復(fù)合物溶液中加入等體積的0.02 mg·mL-1的凝集素ConA,利用紫外濁度法與納米粒度儀分別測定糖基化金納米籠復(fù)合物溶液在與ConA識別前后的吸光度及粒徑。

2 結(jié)果與討論

2.1 分子量及LCST分析

當(dāng)OVNGlu在糖基聚合物P(DEGMA-co-OVNGlu)中的含量n(OVNGlu)∶n[P(DEGMA-co-OVNGlu)]為2.89∶1時,糖基聚合物的Mn為3.49×104,Mw為4.76×104,分散性指數(shù)(PDI)為1.36,LCST可達(dá)40.3 ℃。

2.2 糖基聚合物和糖基化金納米籠復(fù)合物的溫敏性(圖1)

圖1 0.5 mg·mL-1糖基聚合物溶液(a)及0.1 mg·mL-1糖基化金納米籠復(fù)合物溶液(b)的吸光度隨溫度的變化曲線Fig.1 Change curves of absorbance of 0.5 mg·mL-1 glycosylation polymer solution(a) and 0.1 mg·mL-1 AuNCs@P(DEGMA-co-OVNGlu) solution(b) with temperature

由圖1a可知,糖基聚合物的LCST為40.3 ℃。當(dāng)溫度較低時,DEGMA的醚鍵結(jié)構(gòu)與水分子間的氫鍵作用力相持平,糖基聚合物呈水溶性狀態(tài),溶液表現(xiàn)為澄清透明;當(dāng)溫度逐漸升高時,DEGMA中的醚鍵結(jié)構(gòu)與水分子間的氫鍵作用逐漸被破壞,糖基聚合物由親水狀態(tài)逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)槭杷疇顟B(tài),溶液逐漸變?yōu)椴煌该魅榘咨?當(dāng)溫度降低時,溶液又能變回澄清透明,表明糖基聚合物的相轉(zhuǎn)變過程是可逆的,具有良好的溫敏性。

由圖1b可知,糖基化金納米籠復(fù)合物的LCST為42.6 ℃。當(dāng)溫度較低時,糖基化金納米籠復(fù)合物溶液呈澄清透明的淺藍(lán)色;當(dāng)溫度逐漸升高時,糖基化金納米籠復(fù)合物由親水狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)槭杷疇顟B(tài),使其溶解度降低,溶液逐漸變成渾濁半透明狀態(tài),故糖基化金納米籠復(fù)合物表現(xiàn)出與糖基聚合物相似的溫敏性。

2.3 紫外可見吸收光譜分析(圖2)

圖2 Au濃度相同的金納米籠溶液和糖基化金納米籠復(fù)合物溶液的紫外可見吸收光譜Fig.2 UV-Vis absorption spectra of AuNCs solution and AuNCs@P(DEGMA-co-OVNGlu) solution with same Au concentration

由圖2可知,金納米籠和糖基化金納米籠復(fù)合物在波長700 nm左右有較明顯的LSPR吸收峰,兩者的吸收峰型相似,表明在金納米籠表面接枝聚合物沒有改變本身的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)。相較于金納米籠,糖基化金納米籠復(fù)合物的吸收峰強(qiáng)度變?nèi)?這是由于,糖基聚合物包裹在金納米籠表面,使材料的光敏感度和光響應(yīng)度降低,從而使吸光度下降,證明糖基聚合物成功接枝到金納米籠表面。

2.4 TEM分析(圖3)

圖3 金納米籠(a)和糖基化金納米籠復(fù)合物(b～d)的TEM照片F(xiàn)ig.3 TEM images of AuNCs(a) and AuNCs@P(DEGMA-co-OVNGlu)(b-d)

由圖3可知,金納米籠的粒徑為50 nm;經(jīng)糖基聚合物修飾后金納米籠的分散性較好,糖基化金納米籠復(fù)合物的粒徑在60 nm左右,且仍具有中空多孔的形態(tài)。金納米籠表面有一層淡淡的暈,進(jìn)一步證明糖基聚合物成功接枝到金納米籠表面。

2.5 糖基化金納米籠復(fù)合物的光熱轉(zhuǎn)換作用(圖4)

圖4 Au濃度為20 μg·mL-1的糖基化金納米籠復(fù)合物溶液在不同強(qiáng)度的808 nm激光照射300 s的體系(a)、不同Au濃度的糖基化金納米籠復(fù)合物溶液在808 nm激光(強(qiáng)度1.0 W·cm-2)照射300 s的體系(b)、Au濃度為20 μg·mL-1的糖基化金納米籠復(fù)合物溶液在808 nm激光(強(qiáng)度1.0 W·cm-2)照射300 s后自然冷卻至室溫的體系(c)的溫度變化曲線及Au濃度為20 μg·mL-1的糖基化金納米籠復(fù)合物溶液在冷卻過程中-lnθ-t的關(guān)系曲線(d)Fig.4 Temperature change curves of AuNCs@P(DEGMA-co-OVNGlu) solution with Au concentration of 20 μg·mL-1 irradiated for 300 s by 808 nm laser with different intensities(a),AuNCs@P(DEGMA-co-OVNGlu) solution with different Au concentrations irradiated for 300 s by 808 nm laser(intensity of 1.0 W·cm-2)(b),AuNCs@P(DEGMA-co-OVNGlu) solution with Au concentration of 20 μg·mL-1 naturally cooling to room temperature after 300 s irradiation by 808 nm laser(intensity of 1.0 W·cm-2)(c),and -lnθ-t relationship curve of AuNCs@P(DEGMA-co-OVNGlu) solution with Au concentration of 20 μg·mL-1 during cooling process

由圖4a可知,當(dāng)Au濃度為20 μg·mL-1的糖基化金納米籠復(fù)合物溶液在強(qiáng)度分別為0.8 W·cm-2、1.0 W·cm-2、1.2 W·cm-2、1.4 W·cm-2和1.6 W·cm-2的808 nm激光照射300 s后,溶液溫度分別為28.0 ℃、34.6 ℃、36.0 ℃、40.2 ℃和44.2 ℃,即激光強(qiáng)度越強(qiáng),溶液升溫越快。表明金納米籠接枝糖基聚合物后仍具有較好的光熱性能。由圖4b可知,當(dāng)Au濃度分別為4 μg·mL-1、8 μg·mL-1、12 μg·mL-1、16 μg·mL-1和20 μg·mL-1的糖基化金納米籠復(fù)合物溶液在808 nm激光(強(qiáng)度1.0 W·cm-2)照射300 s后,溶液溫度分別為26.0 ℃、27.7 ℃、30.2 ℃、33.1 ℃和34.6 ℃,即Au濃度越大,溶液升溫越快。表明糖基化金納米籠復(fù)合物的光熱轉(zhuǎn)換效率取決于激光強(qiáng)度及Au濃度,溶液的最終溫度與激光強(qiáng)度及Au濃度呈正相關(guān)。

超純水對照組的溫差ΔT=0.4 ℃,由于水的比熱容C為4.2×103J·kg-1·℃-1,計算得到Qdis=0.112 mW;由擬合曲線計算得到τ為69.24 s(圖4d)。

由于糖基化金納米籠復(fù)合物溶解在0.2 mL水中,根據(jù)式(2)計算得到hS=12.13 mW·℃-1。由式(3)計算得到Au濃度為20 μg·L-1的糖基化金納米籠復(fù)合物在808 nm激光(強(qiáng)度1.0 W·cm-2)照射下(A808=0.137)的光熱轉(zhuǎn)換效率為43.01%。

2.6 糖基化金納米籠復(fù)合物的光熱穩(wěn)定性(圖5)

圖5 Au濃度為20 μg·mL-1的糖基化金納米籠復(fù)合物溶液在808 nm激光(強(qiáng)度1.0 W·cm-2)照射下的光熱穩(wěn)定性Fig.5 Photothermal stability of AuNCs@P(DEGMA-co-OVNGlu) solution with Au concentration of 20 μg·mL-1 after irradiation by 808 nm laser(intensity of 1.0 W·cm-2)

由圖5可知,當(dāng)循環(huán)次數(shù)增加時,體系最高溫度逐漸升高,在4次循環(huán)中,體系最高溫度分別達(dá)到34.6 ℃、34.9 ℃、35.1 ℃和35.3 ℃。這是因?yàn)?升溫會導(dǎo)致溶液水分揮發(fā),增加Au濃度,而激光強(qiáng)度不變,則體系最高溫度升高。說明糖基化金納米籠復(fù)合物仍具有良好的光熱穩(wěn)定性。

2.7 糖基化金納米籠復(fù)合物與凝集素ConA的特異性識別作用

利用紫外濁度法分析糖基化金納米籠復(fù)合物識別ConA后溶液的吸光度變化,發(fā)現(xiàn)加入ConA后約20 min,溶液的吸光度趨于穩(wěn)定,最終透光率達(dá)到57%。說明糖基聚合物接枝到金納米籠表面并沒有改變糖基聚合物對凝集素ConA的特異性識別能力。另外,糖基化金納米籠復(fù)合物與凝集素ConA識別后粒徑由62.8 nm增大到80.2 nm,表明糖基化金納米籠復(fù)合物與ConA發(fā)生了識別。

3 結(jié)論

通過酶促可逆加成-斷裂鏈轉(zhuǎn)移聚合-原位還原法制備了溫敏性糖基化金納米籠復(fù)合物。紫外可見吸收光譜表明,糖基化金納米籠復(fù)合物具有良好的溫敏性,其LCST為42.6 ℃;經(jīng)激光照射后,糖基化金納米籠復(fù)合物溶液升溫快,光熱轉(zhuǎn)換效率高,達(dá)到43.01%;糖基化金納米籠復(fù)合物保留了對凝集素ConA的特異性識別作用,表明糖基化金納米籠載藥體系對腫瘤靶向治療具有潛在的應(yīng)用價值。