周 靜,閆林林,薛 超,宋曉寧,劉靖麗,張炳燭*

(1.陜西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院,陜西 咸陽(yáng) 712046;2.河北化工醫(yī)藥職業(yè)技術(shù)學(xué)院,河北 石家莊 050026;3.西安近代化學(xué)研究所,陜西 西安 710065;4.河北工業(yè)大學(xué)化工學(xué)院,天津 300401)

異噻唑啉酮類(lèi)化合物具有高效、易降解、環(huán)境友好等特點(diǎn)[1],其對(duì)細(xì)菌[2]、真菌[2]、藻類(lèi)[3]都具有很高的抑制活性,還具有抗炎、止痛、解熱[4]、解痙[5]、抗血小板凝集[6]等生理活性,被廣泛應(yīng)用于涂料、造紙、皮革、工業(yè)循環(huán)水、農(nóng)藥、海洋防污及化妝品等領(lǐng)域[7]。亞砜結(jié)構(gòu)具有重要的生理活性,在醫(yī)藥和農(nóng)藥領(lǐng)域被廣泛應(yīng)用[8]。為了尋找抑菌活性更高、抑菌范圍更廣、毒性更低的抑菌劑,作者所在研究團(tuán)隊(duì)[9]在五元環(huán)雙鍵上引入不同取代基,并引入2個(gè)羰基,以增加分子與靶點(diǎn)形成氫鍵的可能性,進(jìn)而增強(qiáng)分子與靶點(diǎn)的結(jié)合度,合成了21個(gè)帶有亞砜結(jié)構(gòu)的多羰基新型異噻唑啉酮衍生物1a～1q、2、3、4(圖1)。

圖1 異噻唑啉酮衍生物Fig.1 Isothiazolinone derivatives

葡糖胺-6-磷酸合成酶(G-6-P合酶)催化D-果糖-6-磷酸和L-谷氨酰胺分別生成葡糖胺-6-磷酸和谷氨酸,是己糖胺代謝和細(xì)胞壁合成反應(yīng)的第一步,終產(chǎn)物N-乙酰葡糖胺是細(xì)菌細(xì)胞壁構(gòu)建的基本模塊。因此,G-6-P合酶是抑菌劑的重要靶點(diǎn)[10]。

基于此,作者以金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、蠟狀芽孢桿菌(Bacilluscereus)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、煙草青枯病菌(Ralstoniasolanacearum)和大腸桿菌(Escherichiacoli)為供試菌,采用濾紙片擴(kuò)散法測(cè)定20個(gè)新型異噻唑啉酮衍生物的抑菌活性;選取高抑菌活性衍生物,使用AutoDock軟件進(jìn)行分子對(duì)接,分析其與G-6-P合酶的相互作用模式;運(yùn)用密度泛函(DFT)方法對(duì)高抑菌活性衍生物的分子靜電勢(shì)進(jìn)行理論計(jì)算,揭示化合物結(jié)構(gòu)與活性之間的關(guān)系。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 供試菌、培養(yǎng)基與試劑

金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、蠟狀芽孢桿菌(Bacilluscereus)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、煙草青枯病菌(Ralstoniasolanacearum)、大腸桿菌(Escherichiacoli),均由西北農(nóng)林科技大學(xué)農(nóng)藥研究所提供。

牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基:牛肉膏5.0 g,蛋白胨10.0 g,氯化鈉15.0 g,蒸餾水800 mL,瓊脂15.0 g。

所用試劑均為市售分析純;液體試劑用前均按照標(biāo)準(zhǔn)操作進(jìn)行純化處理。

1.2 方法

1.2.1 抑菌活性測(cè)定

采用濾紙片擴(kuò)散法測(cè)定抑菌活性。將提前活化好的細(xì)菌用無(wú)菌水刷下來(lái),制成菌懸液,然后和牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基混勻,取3 mL于直徑9 mm的培養(yǎng)皿中,制成帶菌培養(yǎng)基。將20個(gè)新型異噻唑啉酮衍生物分別溶于丙酮,配制成1 000 μg·mL-1的衍生物溶液;吸取5 μL衍生物溶液,涂在直徑5 mm的濾紙片上,晾干,以相同濃度的鏈霉素為陽(yáng)性對(duì)照、丙酮為空白對(duì)照,每組設(shè)置3個(gè)平行實(shí)驗(yàn);將晾干的濾紙片貼在帶菌培養(yǎng)基上,每皿貼3片,并確保濾紙片完全貼敷于培養(yǎng)基上,置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)一定時(shí)間(4～10 h),用十字交叉法測(cè)量抑菌圈直徑,觀察抑菌圈透明度。

1.2.2 分子對(duì)接模擬

從PDB數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.rcsb.org)中選取Mouilleron等[11]報(bào)道的G-6-P合酶(PDB ID:2VF5)作為受體,選取高抑菌活性衍生物作為配體,使用AutoDock 4.2軟件進(jìn)行分子對(duì)接研究,使用ChemDraw Ultra 19.0軟件進(jìn)行三維定向繪制和優(yōu)化,并使衍生物能量最小化,使用PyMOL軟件對(duì)配體-蛋白質(zhì)相互作用進(jìn)行可視化分析。

1.2.3 分子靜電勢(shì)計(jì)算

選取高抑菌活性衍生物為研究對(duì)象,采用DFT方法,在B3LYP/6-311++G**水平上進(jìn)行結(jié)構(gòu)優(yōu)化和頻率計(jì)算。最優(yōu)結(jié)構(gòu)均無(wú)虛頻,說(shuō)明優(yōu)化得到的是能量極小的穩(wěn)定結(jié)構(gòu)。在此基礎(chǔ)上計(jì)算衍生物的分子靜電勢(shì)和NBO(natural bond orbital)電荷。所有計(jì)算均由Gaussian 16程序完成。

2 結(jié)果與討論

2.1 新型異噻唑啉酮衍生物的抑菌活性

采用濾紙片擴(kuò)散法測(cè)定了20個(gè)新型異噻唑啉酮衍生物對(duì)5種供試菌的抑菌活性,結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 20個(gè)新型異噻唑啉酮衍生物對(duì)5種供試菌的抑菌活性Tab.1 Antibacterial activities of 20 novel isothiazolinone derivatives to 5 tested bacteria

由表1可知:與鏈霉素相比,11個(gè)衍生物(1a、1c、1d、1f、1g、1i、1j、1k、1l、1q、4)對(duì)蠟狀芽孢桿菌具有一定的抑制作用,說(shuō)明衍生物分子空間結(jié)構(gòu)對(duì)抑菌活性有一定影響,且R2不宜為強(qiáng)吸電子基團(tuán);3個(gè)衍生物(1c、1g、1i)對(duì)枯草芽孢桿菌具有一定的抑制作用,說(shuō)明當(dāng)五元環(huán)氮原子上連有苯環(huán)且苯環(huán)上沒(méi)有吸電子基團(tuán)時(shí),抑菌活性較高;3個(gè)衍生物(1a、1c、1h)對(duì)煙草青枯病菌具有一定的抑制作用,說(shuō)明當(dāng)R1為苯或取代苯、五元雜環(huán)上有甲基酮時(shí),抑菌活性較高;3個(gè)衍生物(1a、1c、1i)對(duì)大腸桿菌具有一定的抑制作用,說(shuō)明當(dāng)五元環(huán)氮原子上連有苯環(huán)且苯環(huán)上為弱給電子基團(tuán)、五元雜環(huán)上有甲基酮時(shí),抑菌活性較高;衍生物1a和1c對(duì)蠟狀芽孢桿菌、煙草青枯病菌和大腸桿菌的抑制作用尤為突出;衍生物1g對(duì)5種供試菌均具有一定的抑制作用,尤其是對(duì)蠟狀芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌的抑制作用較強(qiáng);衍生物1h、1i對(duì)蠟狀芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、煙草青枯病菌和大腸桿菌均具有一定的抑制作用,其中1i對(duì)蠟狀芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌和大腸桿菌的抑制作用均高于鏈霉素。

2.2 新型異噻唑啉酮衍生物的抑菌機(jī)制

為了研究新型異噻唑啉酮衍生物的抑菌機(jī)制,驗(yàn)證配體-受體結(jié)合,選取高抑制活性的異噻唑啉酮衍生物1a、1c、1g、1h、1i作為配體,分別與受體G-6-P合酶進(jìn)行分子對(duì)接,其對(duì)接結(jié)合能與氫鍵見(jiàn)表2,作用模式見(jiàn)圖2。

圖2 分子對(duì)接作用模式Fig.2 Action mode of molecular docking

由表2和圖2可知,5個(gè)高抑菌活性衍生物與G-6-P合酶口袋中的不同氨基酸均有較好的結(jié)合。其中抑菌活性最高的衍生物1c與G-6-P合酶的結(jié)合模式三維圖如圖3所示。

由圖3可知,衍生物1c通過(guò)氫鍵、π-烷基、π-S、碳?xì)湎嗷プ饔玫榷喾N方式與受體G-6-P合酶很好地對(duì)接。衍生物1c分別與受體G-6-P合酶的Gln348(d=2.0 ?)、Ser303(d=1.8 ?)、Thr302(d=2.1 ?、2.7 ?)形成4個(gè)氫鍵,這些氫鍵的形成使得它們的結(jié)合更緊密;此外,各種疏水作用力也使得衍生物1c能以較小的能量穩(wěn)定結(jié)合在G-6-P合酶口袋中。表明,新型異噻唑啉酮衍生物尤其是1c可以與G-6-P合酶很好地結(jié)合,其抑菌機(jī)制可能是新型異噻唑啉酮衍生物很好地抑制了G-6-P合酶活性。

2.3 新型異噻唑啉酮衍生物的分子靜電勢(shì)

分子的靜電勢(shì)可以預(yù)測(cè)藥物分子的活性位點(diǎn),揭示藥物分子與受體蛋白之間的相互作用,闡明藥物分子的結(jié)構(gòu)與藥理活性之間的關(guān)系。在B3LYP/6-311++G**水平上計(jì)算5個(gè)高抑菌活性異噻唑啉酮衍生物的分子靜電勢(shì),結(jié)果如圖4所示。

注:深色區(qū)域代表負(fù)的靜電勢(shì)區(qū)域,是衍生物親電反應(yīng)的活性位點(diǎn);淺色區(qū)域代表正的靜電勢(shì)區(qū)域,是衍生物親核反應(yīng)的活性位點(diǎn)。圖4 5種高抑菌活性異噻唑啉酮衍生物的分子靜電勢(shì)Fig.4 Molecular electrostatic potential of 5 isothiazolinone derivatives with high antibacterial activity

藥物分子周?chē)撵o電勢(shì)映射的差異反映其活性位點(diǎn)與受體結(jié)合的強(qiáng)弱。由圖4可知,負(fù)的靜電勢(shì)區(qū)域(深色區(qū)域)分布在衍生物的羰基和亞砜基團(tuán)上,正的靜電勢(shì)區(qū)域(淺色區(qū)域)分布在苯環(huán)上,表明這些區(qū)域是衍生物的活性位點(diǎn),可以與受體G-6-P合酶發(fā)生相互作用。這一結(jié)論與分子對(duì)接結(jié)果一致。

3 結(jié)論

采用濾紙片擴(kuò)散法測(cè)定了20個(gè)新型異噻唑啉酮衍生物對(duì)5種常見(jiàn)細(xì)菌的抑菌活性,篩選到5個(gè)高抑菌活性衍生物,這5個(gè)衍生物均能通過(guò)氫鍵、π-烷基、π-S和碳?xì)湎嗷プ饔玫榷喾N方式與G-6-P合酶較好地結(jié)合,多個(gè)羰基和亞砜結(jié)構(gòu)的存在起到了關(guān)鍵作用。分子靜電勢(shì)分析表明,負(fù)靜電勢(shì)的羰基和亞砜基團(tuán)區(qū)域是衍生物的活性位點(diǎn),可以與受體G-6-P合酶發(fā)生相互作用。新型異噻唑啉酮衍生物的抑菌機(jī)制可能是很好地抑制了G-6-P合酶活性。該類(lèi)多羰基含亞砜結(jié)構(gòu)的異噻唑啉酮衍生物具有進(jìn)一步研究的意義和潛在的應(yīng)用價(jià)值。