李雅娟，李 芳，李 凡，李莎莎，毛阿娟，陳 曦，韓 昕，王衛(wèi)鋒*

［1.樹蘭（安吉）醫(yī)院 科教科, 浙江 湖州 330523； 2.陜西省中醫(yī)藥研究院 中藥研究所, 陜西 西安710003； 3.陜西中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院 ，陜西 咸陽 712046］

菟絲子為旋花科植物南方菟絲子Cuscuta australisR.Br.或菟絲子Cuscuta chinensisLam.的干燥成熟種子，具有補(bǔ)益肝腎、固精縮尿、安胎、明目、止瀉之功效[1]。2020 年版《中國藥典》收錄菟絲子、鹽菟絲子兩種規(guī)格，其中臨床使用以鹽菟絲子為主。研究發(fā)現(xiàn)，菟絲子鹽炙后不溫不寒、平補(bǔ)陰陽，能引藥入腎，增強(qiáng)其補(bǔ)腎固澀的作用[2]。

菟絲子鹽制首載于宋代《圣濟(jì)總錄》，參照2020 年版《中國藥典》和部分地方飲片標(biāo)準(zhǔn)時發(fā)現(xiàn)，菟絲子鹽炙記載僅對炮制用鹽量、火候、食鹽溶解方法作了規(guī)定，沒有明確的鹽水用量、炒制溫度、炒制時間，具體工藝多以經(jīng)驗(yàn)控制為準(zhǔn)，缺乏規(guī)范的炮制工藝參數(shù)，且此前文獻(xiàn)鹽炙工藝優(yōu)選多采用正交實(shí)驗(yàn)的方法獲取[3]，評價指標(biāo)單一，設(shè)計(jì)簡單，試驗(yàn)精密度不高[4]。故本研究選鹽水量、炒制時間、炒制溫度為考察因素，以菟絲子中綠原酸、金絲桃苷、紫云英苷、山柰酚、總黃酮、浸出物及脂肪油的含量為指標(biāo)，結(jié)合響應(yīng)面法及綜合評分優(yōu)選菟絲子鹽炙工藝，為鹽菟絲子工業(yè)化大生產(chǎn)提供參考。

1 儀器與材料

ACQUITY 型超高效液相色譜儀（美國Waters 公司）；日立U-2910 型紫外可見分光光度計(jì)［日立科學(xué)儀器（北京）有限公司］。

紫云英苷（批號：PS011379，純度≥98%；成都普思生物科技股份有限公司），綠原酸（批號：HC021133， 純 度≥98 %）、 金 絲 桃 苷（ 批號：HH084345，純度≥98%）、山柰酚（批號：HK201888，純度≥98%）均購自寶雞市辰光生物科技有限公司。

甲醇、乙腈［色譜純，賽默飛世爾科技（中國）有限公司］；磷酸（色譜純，上海麥克林生化科技有限公司）；氫氧化鈉（粒）、亞硝酸鈉、硝酸鋁（分析純，天津市天力化學(xué)試劑有限公司）；食鹽（未加碘精制鹽，批號：202203，湖北長舟鹽化有限公司）。

實(shí)驗(yàn)選擇自采菟絲子（寧夏銀川通貴區(qū)，批號：20220425，寄主植物：大豆）為實(shí)驗(yàn)藥材，經(jīng)陜西省中醫(yī)藥研究院楊智峰研究員鑒定為旋花科植物南方菟絲子Cuscuta australisR.Br.的干燥成熟種子。

2 方法與結(jié)果

2.1 4 個指標(biāo)成分的含量測定

2.1.1 色譜條件 ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱（2.1 mm×50 mm,1.7 μm），乙腈（B）- 0.1%磷酸水（D）為流動相進(jìn)行梯度洗脫（0 ～ 10 min，10% →18% B；8 ～ 12 min，18%→30% B；12 ～ 15 min，30%→38% B；15 ～ 17 min，38%→10% B；17 ～ 20 min，10% B），進(jìn)樣量為1 μL，流速為0.3 mL/min，柱溫為30 ℃，檢測波長為350 nm，在該條件下進(jìn)樣，結(jié)果見圖1，各成分與相鄰峰均能有效分離。

圖1 UPLC 色譜圖Fig.1 UPLC chromatogram

2.1.2 對照品溶液的制備 精密稱取綠原酸、金絲桃苷、紫云英苷、山柰酚、對照品適量，分別置于10 mL 容量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，制成 濃 度 分 別 為300.0 μg/mL、318.2 μg/mL、282.1 μg/mL、350.0 μg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)對照品母液。分別取上述母液2.50 mL、3.30 mL、1.95 mL、0.50 mL 于同一10 mL 容量瓶中，制成每1 mL 分別含綠原酸、金絲桃苷、紫云英苷、山柰酚75 μg、105 μg、55 μg、

17.5 μg 的混合對照品溶液。

2.1.3 供試品溶液的制備 取菟絲子粉末（過4號篩）1.0 g，精密稱定，置100 mL 錐形瓶中，精密加入80%甲醇溶液50 mL，稱重，超聲30 min，取出，搖勻，靜置，用80%甲醇溶液補(bǔ)足失重，經(jīng)0.22 μm 微孔濾膜濾過，即得。

2.2 方法學(xué)考察

2.2.1 線性關(guān)系考察 精密吸取“2.1”項(xiàng)下混合對照品溶液1、2、4、6、8、10 mL 分別置于6 個10 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，搖勻，制成不同質(zhì)量濃度的混合對照品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣1 μL 進(jìn)行色譜分析。以各成分峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度（X，μg/mL）為橫坐標(biāo)，對數(shù)值進(jìn)行線性回歸，可見各成分在相應(yīng)線性范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系。將混合對照品逐級稀釋，分別以S/N=3 和S/N=10時計(jì)算檢測限和定量限，結(jié)果見表1。

表1 各成分線性關(guān)系Tab.1 Linear relationship of each component

2.2.2 精密度實(shí)驗(yàn) 取“2.1.2”項(xiàng)下混合對照品溶液，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣6 次，計(jì)錄4 種成分峰面積，計(jì)算得1 ～ 4 各成分峰面積RSD 分別為1.65%、0.54%、0.75%、0.58%，表明儀器精密度良好。

2.2.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取“2.1.3”項(xiàng)下供試品溶液適量，室溫下放置0、2、4、6、8、10、12 h，在“2.1.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣，測得1 ～ 4 各成分峰面積RSD 分別為1.08%、1.23%、1.48%、1.32%，表明供試品溶液在12 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.4 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取同一供試樣品，按“2.1.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，平行6 份，在“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件測定，計(jì)算得1 ～ 4 各成分平均含量分別為0.078 7%、0.118 1%、0.112 1%、0.038 0%，RSD 分別為0.48%、0.77%、0.77%、1.22%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.2.5 加樣回收率試驗(yàn) 稱取同一批菟絲子藥材粉末約0.5 g，精密稱定，平行取6 份，分別精密加入已知濃度的各對照品溶液（與菟絲子藥材粉末中各成分含量相近），按“2.1.3”項(xiàng)下方法平行制備6 份供試品溶液，在“2.1.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣，進(jìn)行測定，計(jì)算各成分加樣回收率及RSD，結(jié)果見表2。

表2 加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果（n = 6）Tab.2 Results of dosing recovery (n = 6)

2.3 菟絲子總黃酮含量測定

參照楊頌等[5]的方法，制備金絲桃苷對照品溶液、菟絲子供試品溶液，在500 nm 波長下測定吸光度。結(jié)果顯示回歸方程為A= 0.014 7C- 0.014 3（C為金絲桃苷濃度，A為吸光度值），r= 0.999 8，金絲桃苷在5.31 ～ 53.1 μg/mL 范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系；精密度試驗(yàn)RSD 值為0.94%，表明儀器精密度良好；穩(wěn)定性試驗(yàn)RSD 值為2.76%，表明供試品溶液在90 min 內(nèi)穩(wěn)定性良好；重復(fù)性試驗(yàn)RSD 值為0.82%，表明方法重復(fù)性良好；加樣回收率結(jié)果見表3，平均回收率為98.62%，RSD 值為1.79%。

表3 總黃酮加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n = 6）Tab.3 Total flavonoid dosing recovery results (n = 6)

2.4 浸出物含量測定

參照2020 年版《中國藥典》（四部）通則2201浸出物測定項(xiàng)下的熱浸法測定[6]。其中醇溶性浸出物測定時選擇60%乙醇為溶劑。

2.5 脂肪油含量測定

參照文獻(xiàn)[7]的測定方法。

2.6 綜合評分計(jì)算公式的確定

根據(jù)各部分對菟絲子及鹽菟絲子藥效發(fā)揮的貢獻(xiàn)及各成分的含有量多少，分別賦予各指標(biāo)成分權(quán)重系數(shù)[8-9]。采用綜合加權(quán)評分法評估菟絲子鹽炙工藝。將總黃酮、水溶性浸出物、醇溶性浸出物、脂肪油的權(quán)重系數(shù)設(shè)為0.2、0.2、0.2、0.1，4 個指標(biāo)成分權(quán)重系數(shù)分別設(shè)為0.06、0.12、0.06、0.06。即綜合評分=（綠原酸含量/綠原酸最大含量）×100×0.06 +（金絲桃苷含量/金絲桃苷最大含量）×100×0.12 +（紫云英苷含量/紫云英苷最大含量）×100×0.06 +（山柰酚含量/山柰酚最大含量）×100×0.06 +（總黃酮含量/總黃酮最大含量）×100×0.2 +（水溶性浸出物含量/水溶性浸出物最大含量）×100×0.2 +（醇溶性浸出物含量/醇溶性浸出物最大含量）×100×0.2 +（脂肪油含量/脂肪油最大含量）×100×0.1。

3 單因素考察

3.1 鹽水用量考察

綜合文獻(xiàn)及預(yù)實(shí)驗(yàn)實(shí)際測定，稱取生品菟絲子五份，每份100 g，置密閉容器中，分別加入30、40、50、60、70 mL 鹽水（均含食鹽2 g），拌勻，悶潤2 h，待炒制容器內(nèi)溫度達(dá)到120℃時倒入，炒制4 min。取出晾涼晾干，篩去碎屑，粉碎，備用。依據(jù)總黃酮、浸出物、脂肪油及金絲桃苷、綠原酸、紫云英苷、山柰酚含量測定結(jié)果，計(jì)算綜合評分，結(jié)果見表4、圖2。根據(jù)評分結(jié)果選擇后續(xù)鹽水用量30 ～ 50 mL。

表4 菟絲子鹽炙工藝單因素考察結(jié)果Tab.4 Results of single-factor investigation of Cuscutae Semen salt burning process

圖2 鹽水用量（A）、炒制溫度（B）和炒制時間（C）對綜合評分的影響Fig.2 Effects of brine dosage (A), stir-frying temperature (B) and stir-frying timeon (C) the overall score

3.2 炒制溫度考察

稱取生品菟絲子五份，每份100 g，置密閉容器中，加入40 mL 鹽水（含食鹽2 g），拌勻，悶潤2 h，待炒制容器內(nèi)溫度分別達(dá)到100、110、120、130、140℃時倒入（每個數(shù)值代表溫度范圍的下限，即100℃代表100 ～ 110℃的溫度范圍），炒制4 min。取出晾涼晾干，篩去碎屑，粉碎，備用。依次測定各指標(biāo)，計(jì)算綜合評分，結(jié)果見表4、圖2。根據(jù)評分結(jié)果選擇炒制溫度100 ～ 140℃。

3.3 炒制時間考察

稱取生品菟絲子五份，每份100 g，置密閉容器中，加入40 mL 鹽水（含食鹽2 g），拌勻，悶潤2 h，待炒制容器內(nèi)溫度達(dá)到120℃時倒入，分別炒制3、4、5、6、7 min。取出晾涼晾干，篩去碎屑，粉碎，備用。依次測定各指標(biāo)，計(jì)算綜合評分，結(jié)果見表4、圖2。根據(jù)評分結(jié)果選擇炒制時間3 ～ 7 min。

4 響應(yīng)面法優(yōu)化鹽炙工藝試驗(yàn)

4.1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

同樣以綜合評分為評價指標(biāo)，考察鹽水用量、炒制溫度、炒制時間對菟絲子鹽炙工藝的影響，基于單因素設(shè)計(jì)Box-Behnken 響應(yīng)面試驗(yàn)，試驗(yàn)因素與水平見表5。取同一批菟絲子飲片17 份，每份100 g，依據(jù)各指標(biāo)成分、總黃酮、水溶性浸出物、醇溶性浸出物、脂肪油含量測定結(jié)果，計(jì)算綜合評分，結(jié)果見表6。

表5 鹽炙菟絲子響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平表Tab.5 Level table of experimental design factors of salt burning Cuscutae Semen response surface

表6 鹽炙菟絲子響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Tab.6 Experimental design and results of salt burnt Cuscutae Semen response surface

4.2 結(jié)果分析

利用Design Expert 10 軟件對實(shí)驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合分析，得二次多項(xiàng)式方程為Y= 88.62 + 0.43A-0.47B+ 0.48C+ 0.39AB+ 0.96AC- 0.73BC- 2.55A2-3.27B2- 2.82C2。方差分析結(jié)果見表7，擬合得到二項(xiàng)式模型P＜0.000 1，極具顯著性，失擬項(xiàng)P= 0.498 2（＞0.05）不顯著。說明在研究范圍內(nèi)所建模型具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。單因素B（炒制時間）、C（炒制溫度）均極具顯著性。根據(jù)F值可知各因素貢獻(xiàn)率為C＞B＞A。模型相關(guān)系數(shù)R2= 0.985 7，決定系數(shù)R2Adj= 0.965 4，可預(yù)測89.22%響應(yīng)值。說明該模型擬合良好，可用于菟絲子鹽炙工藝優(yōu)化。

表7 回歸模型方差分析結(jié)果Tab.7 Results of ANOVA of regression models

繪制個各因素對鹽炙菟絲子綜合評分的影響的響應(yīng)曲面圖及單因素兩兩交互作用圖，結(jié)果見圖3。其中，曲面越陡峭，等高線越密集，說明該因素對綜合評分的影響越顯著[10]。

圖3 鹽水用量、炒制時間、炒制溫度兩兩交互對鹽菟絲子綜合評分的影響Fig.3 Effects of salt water dosage, stir-frying time and stir-frying temperature on the comprehensive score of salt Cuscutae Semen

從圖3 結(jié)合方差分析可知，炒制時間（B）和炒制溫度（C）所對應(yīng)的曲面最陡峭，表明兩者對菟絲子鹽炙工藝影響最顯著，且兩者交互影響最顯著。根據(jù)回歸模型預(yù)測，菟絲子最佳鹽炙工藝為：每100 g菟絲子加鹽水41 mL，炒制時間為4.84 min，炒制溫度為122.27℃。根據(jù)實(shí)際操作，將預(yù)測所得最佳進(jìn)行調(diào)整，即：每100 g 菟絲子加鹽水40 mL,炒制溫度為120 ～ 130℃，炒制時間為5 min。

4.3 工藝驗(yàn)證

按最佳條件進(jìn)行3 次驗(yàn)證試驗(yàn)，同樣測定各指標(biāo)成分的含量，計(jì)算綜合評分，結(jié)果見表8。驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)平均綜合評分為90.270 1，與預(yù)測值88.683 3 之間的相對誤差為1.76%，與預(yù)測結(jié)果相近，表明本實(shí)驗(yàn)所建模型預(yù)測能力較強(qiáng)，形成的鹽炙工藝穩(wěn)定性較好。

表8 鹽菟絲子最優(yōu)工藝驗(yàn)證（n = 3）Tab.8 Verification of optimal process of salt Cuscutae Semen（n = 3）

5 討論

研究發(fā)現(xiàn)，菟絲子中金絲桃苷、山柰酚、紫云英苷具有促進(jìn)免疫調(diào)節(jié)[11]、促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞增殖[12]、成骨細(xì)胞分化等作用；綠原酸具有增強(qiáng)免疫力、抗菌抗病毒的作用[13]；其總黃酮對人體生殖系統(tǒng)、心腦血管系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)等均具有調(diào)節(jié)作用[14]；水溶性浸出物符合中醫(yī)臨床應(yīng)用習(xí)慣；醇提物具有抗氧化、抗衰老、抗癌等作用[15-16]；且菟絲子含有一定量的脂肪油，研究表明脂肪酸有抗動脈硬化、預(yù)防心血管疾病的作用[7]。實(shí)驗(yàn)將其作為菟絲子鹽炙工藝的評價指標(biāo)，使優(yōu)化所得工藝更加貼合臨床。

實(shí)驗(yàn)前期對菟絲子總黃酮含量進(jìn)行測定時，因菟絲子中基本不含蘆丁，選用金絲桃苷為對照品，使總黃酮含量測定結(jié)果更為合理。在優(yōu)化菟絲子鹽炙工藝時，加入炮制輔料食用鹽的考察，對不同來源食鹽對鹽菟絲子中各部分含量的影響作了比較研究，結(jié)果顯示不同來源食鹽其綜合評分相近，但實(shí)驗(yàn)并未對鹽菟絲子中食鹽進(jìn)行測定，后續(xù)將對炮制用鹽的選擇進(jìn)行更為細(xì)致的研究。

炒制時間考察實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，鹽菟絲子綜合評分在7 min 時急劇下降，其可能原因有，菟絲子種子細(xì)小，炒制時間過長，容易炒僵，受熱過長導(dǎo)致有效成分破壞，含量降低，且種皮大面積破裂，將導(dǎo)致菟絲子脂肪油含量流失嚴(yán)重，綜合評分降低。且響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，鹽炙過程中，炒制溫度和炒制時間對菟絲子鹽炙方法影響較大，可能是菟絲子經(jīng)加熱處理后，質(zhì)地酥脆，其黃酮類成分溶出增加，含量升高。這與張穎等[17]實(shí)驗(yàn)結(jié)果較為一致，可互為印證。

6 結(jié)論

本研究通過單因素結(jié)合響應(yīng)面，多指標(biāo)綜合評分評估優(yōu)化菟絲子鹽炙工藝，經(jīng)驗(yàn)證優(yōu)選工藝穩(wěn)定可行，可為規(guī)范化生產(chǎn)鹽菟絲子提供參考。但工藝還存在缺少中試放大的問題，有待進(jìn)一步驗(yàn)證完善，后續(xù)還會從菟絲子鹽炙前后化學(xué)成分含量及藥理作用差異方面，進(jìn)一步驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)優(yōu)選炮制工藝的可行性。以期為鹽菟絲子炮制工藝的參數(shù)具體化提供理論依據(jù)，為后續(xù)鹽菟絲子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)建立及炮制機(jī)理探討奠定基礎(chǔ)。