蔣亞奇，李啟艷，胡文岳，李俊婕，郭 瑩，高天陽，王小兵,2*

（1.山東省食品藥品檢驗(yàn)研究院，國(guó)家藥品監(jiān)督管理局化妝品原料質(zhì)量控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 濟(jì)南 250101；2.山東大學(xué)齊魯醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)院，山東 濟(jì)南 250012）

黃精被收錄于歷版《中國(guó)藥典》中，包含黃精Polygonatum sibiricumRed.、滇黃精Polygonatum kingianumColl.et Hemsl.和多花黃精Polygonatum cyrtonemaHua 三種基原[1]，在我國(guó)分布廣泛，主產(chǎn)于浙江、安徽、山東、云南等地[2]。黃精為常用的補(bǔ)益類中藥，具有補(bǔ)腎益精、養(yǎng)陰潤(rùn)肺之功效，主要用于治療脾胃氣虛、肺虛燥咳、精血不足等癥[3-5]。研究表明，黃精的主要功效成分為多糖、生物堿、黃酮、甾體皂苷等[6-8]，具有降血糖、增強(qiáng)免疫力、抗氧化等多種藥理活性[9-11]，因此被廣泛應(yīng)用于藥品、食品和保健食品中。

研究發(fā)現(xiàn)，無機(jī)元素在植物中普遍存在，是參與和調(diào)節(jié)代謝必需的物質(zhì)，無機(jī)元素的種類和含量也會(huì)影響中藥藥效的發(fā)揮和療效[12-14]，因此，中藥中無機(jī)元素的種類和含量成為中藥質(zhì)量控制中必不可少的一環(huán)。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，黃精中鉀（K）、鈉（Na）、鈣（Ca）、鎂（Mg）、鋁（Al）、鐵（Fe）等元素的含量很高，不適合與此29 種元素同時(shí)測(cè)定，更宜采用電感耦合等離子體發(fā)射質(zhì)譜法（ICPOES）測(cè)定。鑒于此，本研究擬采用靈敏度高、適合多元素同時(shí)測(cè)定的ICP-MS 法分析黃精藥材中29 種常見無機(jī)元素，結(jié)合化學(xué)模式識(shí)別中的聚類分析和主成分分析，研究不同產(chǎn)地黃精中元素種類和含量的相關(guān)性和差異性，以期為黃精藥材的質(zhì)量評(píng)價(jià)與控制提供參考。

1 材料

1.1 藥物與試劑

硝酸（優(yōu)級(jí)純，晶瑞電子材料股份有限公司）；30%過氧化氫（分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；水為經(jīng)Milli-Q 超純水儀制得的去離子水。

含有鈹（Be）、釩（V）、鉻（Cr）、鈷（Co）、鎳（Ni）、銅（Cu）、鎵（Ga）、砷（As）、硒（Se）、鎘（Cd）、銫（Cs）、鉈（Tl）、鉛（Pb）、鑭（La）、鈰（Ce）、鐠（Pr）、釹（Nd）、釤（Sm）、銪（Eu）、釓（Gd）、鏑（Dy）、鈥（Ho）、鉺（Er）、銩（Tm）、鐿（Yb）、镥（Lu）、鈾（U）、銀（Ag）多元素標(biāo)準(zhǔn)液（批號(hào)：R2-MEB695280，濃度：10 μg/mL，Inorganic Ventures）；鍺（Ge）單元素內(nèi)標(biāo)溶液（批號(hào)：P2-GE675320AA， 濃 度：1 000 μg/mL）、 銦（In）單元素內(nèi)標(biāo)溶液（批號(hào)：N2-IN664476，濃度：1 000 μg/mL）、鉍（Bi）單元素內(nèi)標(biāo)溶液（批號(hào)：N2-BI666938，濃度：1 000 μg/mL）、鈧（Sc）單元素內(nèi)標(biāo)溶液（批號(hào)：N2-SC671904AA，濃度：1 000 μg/mL）、銠（Rh）單元素內(nèi)標(biāo)溶液（批號(hào)：P2-RH684491，濃度：1 000 μg/mL），均購自Inorganic Ventures；汞（Hg）單元素標(biāo)準(zhǔn)液（批號(hào)：20022，濃度：1 000 μg/mL，中國(guó)計(jì)量科學(xué)研究院）。60 批黃精樣品經(jīng)山東省食品藥品檢驗(yàn)研究院李啟艷主任中藥師鑒定，均為2020 年版《中國(guó)藥典》（一部）收錄的黃精Polygonatum sibiricumRed.、滇黃精Polygonatum kingianumColl.et Hemsl.和多花黃精Polygonatum cyrtonemaHua 的干燥根莖。60 批黃精樣品信息見表1。

1.2 主要儀器

NexION 2000 型電感耦合等離子體質(zhì)譜儀（美國(guó)Perkin Elmer 公司）；CEM MARS 5 型微波消解儀（美國(guó)CEM 公司）；MS105DU 型電子天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；Milli-Q 型超純水儀（美國(guó)Millipore 公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 ICP-MS 測(cè)定條件

射頻功率：1 600 W；等離子體氣體流速：15 L/min；輔助氣流速：1.2 L/min，霧化器氣體流速：0.98 L/min，霧化室溫度：2 ℃；掃描模式：跳峰；測(cè)定模式：碰撞模式；碰撞氣：He；流速：3.5 L/min；重復(fù)次數(shù)：3 次。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備

分別取多元素標(biāo)準(zhǔn)液和汞單元素標(biāo)準(zhǔn)液適量，用3%的硝酸溶液稀釋配制成標(biāo)準(zhǔn)系列溶液，其中，汞的系列濃度分別為0.1、0.5、1、2、3、4、5 ng/mL，鈹?shù)绕渌?8 種元素的系列濃度分別為1、5、10、30、50、100、300 ng/mL。內(nèi)標(biāo)溶液：分別取鍺、銦、鉍、鈧、銠單元素內(nèi)標(biāo)溶液適量，用3%硝酸溶液稀釋配制成濃度為25 ng/mL 混合內(nèi)標(biāo)溶液。

2.3 供試品溶液的制備

取樣品粉末（過50 目篩）0.5 g，精密稱定，于聚四氟乙烯消解管中，置于通風(fēng)櫥，加硝酸7.0 mL，靜置浸泡過夜，加雙氧水2.0 mL，置電熱板中于100 ℃加熱預(yù)消解0.5 h，放冷，加蓋密塞，移入微波消解儀中，按表2 設(shè)定的程序進(jìn)行微波消解。消解完畢后取出，冷卻，用去離子水將消解液轉(zhuǎn)移至25 mL 塑料容量瓶中，定容后搖勻，作為供試品溶液。

表2 微波消解程序Tab.2 Working parameters for microwave digestion

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制和檢出限的測(cè)定 取標(biāo)準(zhǔn)系列溶液，同時(shí)吸入內(nèi)標(biāo)溶液，按“2.1 ”項(xiàng)下條件上機(jī)測(cè)定，以待測(cè)元素標(biāo)準(zhǔn)系列的質(zhì)量濃度（X，ng/mL）為橫坐標(biāo)，以目標(biāo)峰強(qiáng)度值與內(nèi)標(biāo)元素峰強(qiáng)度值的比值（Y）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。同時(shí)測(cè)定11 份樣品空白，以3 倍濃度值的標(biāo)準(zhǔn)偏差計(jì)算檢出限。測(cè)得的方程、相關(guān)系數(shù)、線性范圍和檢出限結(jié)果見表3，結(jié)果顯示，各待測(cè)元素的相關(guān)系數(shù)在0.996 0 ～ 0.999 9 之間，表明各待測(cè)元素在其線性范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表3 29 種元素的線性關(guān)系和檢出限Tab.3 Linear relations and detection limits of 29 kinds of elements

2.4.2 精密度試驗(yàn) 取同一含29 種元素的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按“2.1 ”項(xiàng)下條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6 次，計(jì)算29 種無機(jī)元素濃度值的RSD 值為1.0% ～ 4.9%，表明儀器具有良好的精密度。

2.4.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一含29 種元素的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別于室溫下放置0、2、4、8、12、24 h，按“2.1”項(xiàng)下條件進(jìn)樣分析，計(jì)算29 種無機(jī)元素濃度值的RSD 值為0.8% ～ 5.4%，表明含目標(biāo)元素的標(biāo)準(zhǔn)溶液在24 h 內(nèi)具有良好的穩(wěn)定性。

2.4.4 重復(fù)性試驗(yàn) 取樣品編號(hào)為S41 的同一黃精供試品6 份，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下條件測(cè)定，得到6 份黃精供試品溶液中29 種元素的濃度值，計(jì)算其RSD 值為0.7% ～7.3%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.4.5 加樣回收率試驗(yàn) 取已知含量的同一黃精樣品（S42）的9 份，每份0.5 g，精密稱定，分別按低、中、高濃度梯度精密加入一定量的各元素標(biāo)準(zhǔn)溶液，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下條件測(cè)定，計(jì)算回收率和RSD，見表4。結(jié)果表明，各元素的平均回收率在88.8% ～ 116.3%之間，RSD值為1.4% ～ 8.9%，均符合《中國(guó)藥典》中“分析方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則”的要求，表明該方法的準(zhǔn)確度能滿足檢測(cè)需要。

表4 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果(n = 9)Tab.4 Test results of sample recovery (n = 9)

2.5 樣品測(cè)定結(jié)果

分別稱取60 批黃精樣品，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下工作條件測(cè)定，計(jì)算樣品中29 種無機(jī)元素的含量，結(jié)果見表5 ～ 7。

表5 黃精樣品中29 種無機(jī)元素測(cè)定結(jié)果（Ⅰ）（mg/kg， n = 3）Tab.5 Determination of 29 kinds of inorganic elements (Ⅰ) (mg/kg， n = 3)

表6 黃精樣品中29 種無機(jī)元素測(cè)定結(jié)果（Ⅱ）（mg/kg， n = 3）Tab.6 Determination of 29 kinds of inorganic elements (Ⅱ) (mg/kg， n = 3)

表7 黃精樣品中29 種無機(jī)元素測(cè)定結(jié)果（Ⅲ）（mg/kg， n = 3）Tab.7 Determination of 29 kinds of inorganic elements (Ⅲ)(mg/kg， n = 3)

2.6 化學(xué)模式識(shí)別分析

2.6.1 聚類分析 以60 批黃精樣品的29 種元素含量為原始數(shù)據(jù)，導(dǎo)入SPSS 26.0 軟件，以樣品編號(hào)為個(gè)案、各元素含量為變量進(jìn)行系統(tǒng)聚類分析，算法采用組間聯(lián)接法，測(cè)度選擇平方歐式距離，聚類結(jié)果見圖1。結(jié)果顯示，當(dāng)平方歐式距離較小時(shí)，各產(chǎn)地樣品表現(xiàn)的聚類趨勢(shì)相對(duì)明顯；當(dāng)平方歐式距離為25時(shí)，所有樣品可大致聚為2 類，來自安徽的樣品聚為一類，其他產(chǎn)地的樣品聚為一類；當(dāng)平方歐式距離為5 時(shí)，來自安徽的樣品呈現(xiàn)一定的聚類性，來自湖北的樣品具有一定的聚類性，來自貴州、四川的樣品具有一定的聚類性，其他產(chǎn)地的樣品聚類不顯著。

圖1 60 批樣品聚類分析樹狀圖Fig.1 Dendrogram of cluster analysis of 60 batches of samples

2.6.2 主成分分析 通過上述測(cè)定，獲得了60批黃精樣品中29 種元素的含量信息，由于數(shù)據(jù)量大，不利于分析各元素含量與產(chǎn)地之間的關(guān)系，因此引入了降維的思想，對(duì)元素含量測(cè)定結(jié)果進(jìn)行主成分分析。由于不同元素的含量差異太大，為降低數(shù)值差異大對(duì)PCA 結(jié)果的影響，先對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，再導(dǎo)入SPSS 26.0 軟件進(jìn)行PCA。首先，進(jìn)行KMO 適合度檢驗(yàn)和巴特利特球形檢驗(yàn)，結(jié)果KMO 值為0.838，巴特利特球形檢驗(yàn)結(jié)果P值為0，當(dāng)0.8 ＜KMO ＜0.9、P ＜0.05 時(shí)，說明數(shù)據(jù)適合提取公共因子，可進(jìn)行主成分分析[15]。經(jīng)主成分分析，計(jì)算特征值和方差貢獻(xiàn)率，以特征值＞1、累計(jì)方差貢獻(xiàn)率＞80%為依據(jù)確定主成分因子，得到 主 成 分 因 子1（F1）、2（F2）、3（F3）、4（F4）的特征值分別為17.440、2.659、2,000、1.235，累計(jì)方差貢獻(xiàn)率為80.461%（見表8）。同時(shí)結(jié)合主成分因子碎石圖（見圖2），可以更直觀的看出在主成分因子2 處有明顯拐點(diǎn)，主成分因子4 后曲線變得平緩，說明F1、F2、F3、F4 是影響黃精質(zhì)量評(píng)價(jià)指標(biāo)的主要因子。因此，選擇前4 個(gè)主成分因子對(duì)60 批黃精樣品進(jìn)行評(píng)分，以各主成分因子得分與方差貢獻(xiàn)率乘積之和計(jì)算各批樣品的綜合得分（S），計(jì)算公式為S= 0.601 37×F1+0.091 68×F2+0.068 97×F3+0.042 58×F4，并對(duì)綜合得分進(jìn)行排序（見表9）。由表9 可見，S1 ～S6（采自安徽九華山）綜合得分較高，從無機(jī)元素指標(biāo)評(píng)價(jià)，安徽的黃精整體質(zhì)量較好。

表8 4 個(gè)主成分因子的特征值和方差貢獻(xiàn)率Tab.8 Eigen values and variance contribution rates of 4 principal components

表9 60 批樣品的綜合得分及排序Tab.9 Comprehensive scores and sorting of principal components of 60 batches of samples

為探索黃精中無機(jī)元素與產(chǎn)地的關(guān)聯(lián)性，選取影響較大的F1、F2 進(jìn)行分析。分別以各樣品的F1 值為X 軸、F2 值為Y 軸，將60 個(gè)樣品點(diǎn)標(biāo)入二維坐標(biāo)系中，結(jié)合產(chǎn)地分析各樣品點(diǎn)的離散程度，見圖3。

圖3 不同產(chǎn)地黃精的主成分得分散點(diǎn)圖Fig.3 Scatter plot of Polygonati Rhizoma from different producing areas based on principal components scores

由圖3 可見，當(dāng)剔除個(gè)別偏離較大的樣品點(diǎn)后，來自安徽的樣品呈現(xiàn)一定的聚類性，來自湖南的樣品呈現(xiàn)一定的聚類性，來自湖北、貴州、四川的樣品具有一定的聚類性，其他產(chǎn)地的樣品聚類不顯著，主成分分析和聚類分析結(jié)果基本一致。因此，黃精樣品中的無機(jī)元素含量差異可能與產(chǎn)地有一定的相關(guān)性。

3 討論

綜合考慮各元素的響應(yīng)值、干擾及穩(wěn)定性，對(duì)ICP-MS 工作條件進(jìn)行優(yōu)化，最終確定了“2.1”項(xiàng)的優(yōu)選條件。ICP-MS 法測(cè)定時(shí)的主要干擾有質(zhì)譜干擾和物理干擾，研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)測(cè)定模式為標(biāo)準(zhǔn)模式時(shí)，會(huì)干擾As 的測(cè)定，而選擇He 碰撞模式時(shí)，會(huì)減少質(zhì)譜干擾，29 種元素均有較好的峰形和響應(yīng)。為克服基體效應(yīng)等物理干擾帶來的影響，以內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行測(cè)定，采用質(zhì)量數(shù)就近的原則選擇內(nèi)標(biāo)，最終確定以25 ng/mL 的Ge、In、Bi、Sc、Rh 為內(nèi)標(biāo)元素進(jìn)行測(cè)定。

60 批黃精中29 種無機(jī)元素的含量測(cè)定結(jié)果顯示，不同產(chǎn)地的黃精中無機(jī)元素的組成基本一致，但含量差異較大。在測(cè)定的29 種元素中，Cr、Cu、Ni、Ga 含量整體相對(duì)較高，其他無機(jī)元素含量整體相對(duì)較低。2020 年版《中國(guó)藥典》（一部）中規(guī)定了黃精中5 種重金屬及有害元素的限量，Pb、As、Hg、Cu、Cd 分 別 不 得 過5、2、0.2、20、1 mg/kg，測(cè)定的60 批黃精中此5 種元素的含量均低于藥典規(guī)定的限值，說明黃精在重金屬及有害元素方面的安全性整體較好。

本研究采購的黃精來自9 個(gè)不同的產(chǎn)地，基本涵蓋了黃精的主要產(chǎn)區(qū)。聚類分析和主成分分析結(jié)果表明，不同產(chǎn)地的黃精樣品有一定的聚類性，由此推斷，黃精中無機(jī)元素的含量差異與產(chǎn)地、生長(zhǎng)環(huán)境等因素有一定的相關(guān)性；主成分綜合得分的高低可間接反映藥材的質(zhì)量，可從無機(jī)元素的角度評(píng)價(jià)不同產(chǎn)地黃精的質(zhì)量。

4 結(jié)論

本研究建立了ICP-MS 法同時(shí)測(cè)定黃精中29 種無機(jī)元素的方法，該方法準(zhǔn)確度和精密度較好，靈敏度高，可用于黃精中29 種無機(jī)元素的質(zhì)量控制。對(duì)9 個(gè)產(chǎn)區(qū)60 批黃精樣品進(jìn)行含量分析，可反映黃精中無機(jī)元素的整體情況，結(jié)合化學(xué)模式識(shí)別分析，發(fā)現(xiàn)黃精中無機(jī)元素的含量差異與產(chǎn)地具有一定的相關(guān)性，本研究可為黃精藥材質(zhì)量評(píng)價(jià)和質(zhì)量控制提供參考。