閆淑萍，王碩，陳濤，申誠，張永蘭，趙景陽,，馮斌，羅芳，李玉林*

（1.中國科學(xué)院西北高原生物研究所，青海西寧 810001）（2.中國科學(xué)院大學(xué)，北京 100049）（3.青海柴達(dá)木職業(yè)技術(shù)學(xué)院生物工程系，青海德令哈 817099）（4.青海金麥杞生物科技有限公司，青海西寧 810003）

黑果枸杞（Lycium ruthenicumMurr.）是茄科枸杞屬多棘刺落葉灌木，根系發(fā)達(dá)，耐旱耐鹽堿，可以防風(fēng)固沙，廣泛種植于我國青海、寧夏、新疆、內(nèi)蒙古等地[1]。《四部醫(yī)典》、《晶珠本草》等藏藥經(jīng)典中記載，黑果枸杞成熟果實可用于治療心臟病、心熱病、月經(jīng)不調(diào)、停經(jīng)等，民間認(rèn)為黑果枸杞有滋補(bǔ)強(qiáng)壯、明目、降壓等功效。黑果枸杞在我國西北地區(qū)有著悠久的使用歷史，是一種珍貴的藥食兩用資源。黑果枸杞果實富含花青素、原花青素、生物堿、多糖等活性成分[2]，其中總花青素鮮果含量高達(dá)6.38 mg/g，是天然花青素的豐富來源[3,4]?，F(xiàn)代藥理研究表明，花青素具有抗炎[5,6]、抗氧化[7]、抗疲勞[8]、調(diào)節(jié)血脂[9]、肥胖抑制[10]、抗衰老[11]、抗腫瘤[12,13]、改善神經(jīng)退行性疾病[14]等多種生物活性?；诨ㄇ嗨氐纳砘钚院捅＝∽饔?，黑果枸杞儼然已經(jīng)成為西北地區(qū)的特色經(jīng)濟(jì)植物。但目前對黑果枸杞花青素研究主要集中在提取純化工藝以及藥理活性方面，黑果枸杞花青素作為食品、保健品開發(fā)，缺乏明確的毒理安全評價資料[15]。

急性毒性試驗通過單次大劑量或24 h內(nèi)多次給予受試物后，在一定時間內(nèi)觀察動物所產(chǎn)生的毒性反應(yīng)和死亡過程，進(jìn)而測定引起動物急性中毒的劑量，揭示動物在中毒過程中出現(xiàn)的毒性反應(yīng)和可能作用的靶器官，一般采用半數(shù)致死量（LD50）、最小致死量（LD5）和最大給藥量（MTD）等方法測定供試品的毒性劑量。天然產(chǎn)物的毒副作用一般較小，常常無法測出LD50，因此天然產(chǎn)物的急性毒性試驗常采用最大劑量試驗或固定劑量試驗[16,17]。前期預(yù)實驗中無法測出LD50，故本文采用固定劑量法進(jìn)行小鼠經(jīng)口急性毒性試驗和大鼠30 d喂養(yǎng)毒性試驗，初步了解黑果枸杞花青素提取物（Anthocyanins Extract ofLycium ruthenicum，AEL）的食用安全性，以期為黑果枸杞功能性食品的深度挖掘和開發(fā)利用提供安全性理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黑果枸杞由青海金麥杞生物科技有限公司提供，經(jīng)提取后得到質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30.1%的深紫色黑果枸杞花青素提取物備用。烏拉坦，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；血液學(xué)檢查試劑、SIMENS ADVIA三合一正常值質(zhì)控全血，德國SIMENS公司；血清指標(biāo)測定試劑盒，北京中生北控生物科技股份有限公司；電解質(zhì)測定試劑，日本常光株式會社；凝血酶原時間（PT）、活化部分凝血酶原時間（APTT）測定試劑盒和質(zhì)控血漿，美國laboratory儀器公司；尿液檢測試紙，桂林優(yōu)利特醫(yī)療電子有限公司。

1.2 主要儀器

ADVIA2120型血液分析儀，西門子醫(yī)療診斷有限公司；ACL9000型凝血分析儀，Instrumentation Laboratory公司；7180型全自動生化分析儀，日本日立高新技術(shù)株式會社；EX-180型電解質(zhì)分析儀，日本常光株式會社；URITEST-500B型尿液分析儀，桂林優(yōu)利特電子集團(tuán)有限公司；ML6001/02、PL203、ML104/02型電子天平，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；E3000-0.5型天平，常熟市雙杰測試儀器廠；CTXNW-110B型循環(huán)超聲提取機(jī)，北京宏祥隆生物技術(shù)開發(fā)有限公司；GQ105B型管式離心機(jī)，上海浦東天本離心機(jī)械有限公司；GLZ-1B型冷凍干燥機(jī)，上海浦東冷凍干燥設(shè)備有限公司；SJN-150-00型雙效濃縮器，浙江溫兄機(jī)械閥業(yè)有限公司；BM-40型純水機(jī)，北京中盛茂源科技發(fā)展有限公司。

1.3 實驗動物

SPF級ICR小鼠20只，雌雄各半，實驗動物質(zhì)量合格證號為：11400700321072，用于急性毒性實驗。SPF級SD大鼠36只，雌雄各半，7～8周齡，實驗動物質(zhì)量合格證號：11400700322000，用于30 d喂養(yǎng)實驗。實驗動物均由北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供，生產(chǎn)許可證號：SCXK（京）2016-0006。實驗動物飼養(yǎng)于屏障環(huán)境，12 h光照模擬晝夜循環(huán)，光照時間，6:00～18:00。自由進(jìn)食飲水，飼料為60Co輻照滅菌飼料，飲水瓶和水每天更換，使用后飲水瓶經(jīng)脈動真空滅菌器高壓消毒后再次使用。動物適應(yīng)性飼養(yǎng)一周后用于實驗。

1.4 實驗方法

1.4.1 黑果枸杞花青素提取物樣品的制備

稱取10 kg黑果枸杞干果去梗、破碎，過60目篩，置于超聲提取機(jī)中，加150 L去離子水提取30 min，重復(fù)兩次，合并水提液，2 000 r/min離心5 min，收集上清液。上清液以100 L/h流量泵入大孔樹脂柱（樹脂柱規(guī)格：100 L，樹脂型號：AB-8，樹脂量：35 kg），用100 L去離子水洗脫后，再用300 L體積分?jǐn)?shù)為50%乙醇洗脫，收集乙醇洗脫組分，在45 ℃、-0.07 MPa條件下用雙效濃縮器減壓濃縮得到濃縮液10 L，冷凍干燥得到黑果枸杞花青素提取物595.2 g，經(jīng)鑒定該組分花青素質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30.1%[18]。

1.4.2 急性毒性試驗

SPF級ICR小鼠20只，雄性體質(zhì)量23.6～25.5 g，雌性體質(zhì)量21.4～23.1 g，根據(jù)受試樣品特點，采用固定劑量法進(jìn)行急性毒性試驗[19]，設(shè)置對照組和實驗組，每組10只，雌雄各半。一次灌胃給予AEL 8 000 mg/kg，灌胃體積40 mL/kg，溶媒為超純水，對照組給予等量超純水。小鼠灌胃前禁食4 h，自由飲水。灌胃后持續(xù)觀察小鼠的一般狀況，包括自主行為、精神狀況、飲食飲水、呼吸、口鼻分泌物、排泄物等。灌胃當(dāng)天持續(xù)觀察2 h，以后每天觀察一次，記錄動物一般狀況、死亡情況、體質(zhì)量，連續(xù)觀察14 d。第14天處死小鼠作大體觀察。

1.4.3 30 d喂養(yǎng)試驗

1.4.3.1 實驗動物分組與處理

SPF級SD大鼠36只，雄性172～190 g，雌性186～212 g，按體質(zhì)量隨機(jī)分為對照組和AEL低劑量組（500 mg/kg）、AEL高劑量組（2 000 mg/kg），每組12只，雌雄各半。連續(xù)灌胃30 d，灌胃體積均為10 mL/kg，對照組給予等量去離子水。

1.4.3.2 實驗觀察

實驗期間，每天觀察動物死亡數(shù)和一般癥狀，包括大鼠在灌胃后的外觀體征、行為活動、腺體分泌、呼吸、眼睛等。在灌胃1、8、15、22、25、29 d稱量大鼠體質(zhì)量及飼料消耗量，并在剖殺前稱取待剖殺動物的空腹體質(zhì)量。計算大鼠平均進(jìn)食量，見式（1）。

式中：

Fm——為平均食料量，g；

F0——為加料量，g；

F1——為預(yù)料量，g；

n——為每籠動物只數(shù)，只。

1.4.3.3 樣本收集及指標(biāo)檢測

實驗第30天，動物禁食12 h。采集新鮮尿液，用自動尿液分析儀檢測大鼠尿液指標(biāo)。各組動物用20%烏拉坦4 mL/kg腹腔注射麻醉，腹主動脈采血。取新鮮的EDTA-K2抗凝血，4 h內(nèi)采用多物種血液分析儀測定血液學(xué)常規(guī)指標(biāo)。將新鮮血液置入帶分離膠和促凝劑的真空采血管，兩小時內(nèi)分離血清，進(jìn)行血清生化分析及電解質(zhì)分析。采血結(jié)束后進(jìn)行剖檢，取心、肝、脾、腎、腦、腎上腺、胸腺、睪丸和附睪/子宮和卵巢等臟器組織稱質(zhì)量，計算臟體系數(shù)（mg/g）和臟腦系數(shù)（g/g），并進(jìn)行組織病理學(xué)觀察。

1.5 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 20.0分析軟件，以平均值和標(biāo)準(zhǔn)差（ˉx±s）表示各計量結(jié)果，單因素方差分析（ANOVA）、Dunnett檢驗、K樣本非參數(shù)檢驗進(jìn)行結(jié)果的比較與分析。因性別差異對各項指標(biāo)影響較大，雌性大鼠和雄性大鼠分開計算。

2 結(jié)果與討論

2.1 急性毒性試驗

急性毒性試驗過程中，小鼠以AEL 8 000 mg/kg劑量灌胃后連續(xù)觀察2 h，小鼠無閉目、蜷縮、抽搐、震顫、流涎等明顯中毒反應(yīng)。14 d觀察期內(nèi)，小鼠飲食飲水正常，被毛光滑，精神狀態(tài)良好，活動、行為無明顯異常，口、鼻、眼分泌物、排泄物（尿液、糞便）等情況正常，觀察期內(nèi)未出現(xiàn)小鼠死亡。小鼠體質(zhì)量變化如圖1所示，與對照組比較，14 d內(nèi)小鼠體質(zhì)量正常增長，生長狀況良好。實驗結(jié)束對小鼠進(jìn)行大體解剖，觀察小鼠的心、肝、脾、肺、腎、胃、腸、腦、子宮及卵巢（睪丸及附睪）等臟器，實驗組所有動物臟器顏色、形態(tài)均未見明顯異常改變。結(jié)果顯示：本試驗狀態(tài)下，小鼠單次灌胃AEL的最大耐受劑量不小于8 000 mg/kg。

圖1 黑果枸杞花青素提取物灌胃給藥對小鼠體質(zhì)量的影響Fig.1 Effects of AEL on body weight of mice

2.2 30 d喂養(yǎng)試驗

實驗期間動物健康狀況良好，被毛順滑有光澤、活動正常、精神狀況良好、體質(zhì)量持續(xù)增長，口、鼻眼、分泌物、排泄物（尿液、糞便）等情況正常，AEL高、低劑量組均無動物死亡或瀕死。AEL高劑量組動物糞便呈黑紫色，與供試品顏色相近，可能與供試品顏色較深有關(guān)。

2.2.1 黑果枸杞花青素提取物對大鼠進(jìn)食量、體質(zhì)量的影響

AEL灌胃30 d，每周對大鼠進(jìn)行一次進(jìn)食量、體質(zhì)量稱量。如圖2和圖3所示，與對照組比較，各組動物每周進(jìn)食、體質(zhì)量均無顯著差異（P＞0.05），表明AEL對大鼠的一般生長狀況無明顯影響。

圖2 黑果枸杞花青素提取物對大鼠進(jìn)食量的影響Fig.2 Effects of AEL on food intake in rats

圖3 黑果枸杞花青素提取物對大鼠體質(zhì)量的影響Fig.3 Effects of AEL on body weight of rats

2.2.2 尿液生化檢查

實驗結(jié)束時采集大鼠新鮮尿液，觀察尿液外觀并檢測各項尿液生化指標(biāo)，結(jié)果見表1。檢測結(jié)果顯示除高劑量組動物尿液呈淡藍(lán)色外，實驗組其他各項指標(biāo)與對照組比較無明顯異常（P＞0.05）。綜合分析尿液呈淡藍(lán)色可能與供試品顏色較深有關(guān)，但對大鼠其他尿液生化指標(biāo)無影響。

表1 黑果枸杞花青素提取物對大鼠尿液生化指標(biāo)的影響Table 1 Effect of AEL on urine biochemical indexes of rats

2.2.3 血液學(xué)常規(guī)檢查

血液系統(tǒng)是診斷個體生理和病理狀態(tài)最敏感的指標(biāo)，可用于判定受試物對動物血液系統(tǒng)、營養(yǎng)代謝及健康狀況的影響[20]。大鼠血液學(xué)常規(guī)檢查結(jié)果見表2。結(jié)果顯示，高劑量組雌性動物單核細(xì)胞百分比（M%）較對照組顯著升高（P＜0.05），但與之相關(guān)的白細(xì)胞計數(shù)（WBC）、中性粒細(xì)胞（N%）、淋巴細(xì)胞（L%）、嗜酸性粒細(xì)胞（E%）與對照組比較無顯著差異；高劑量組雄性動物M%較對照組升高，但未顯示出統(tǒng)計學(xué)意義。與對照組比較，各實驗組大鼠的凝血酶原時間（PT）、部分活化凝血酶原時間（APTT）無明顯變化，表明黑果枸杞花青素對大鼠的凝血功能無影響。血液學(xué)常規(guī)檢查結(jié)果顯示AEL連續(xù)灌胃30 d，對大鼠血液常規(guī)指標(biāo)無明顯不良影響。

表2 黑果枸杞花青素提取物對大鼠血液指標(biāo)的影響Table 2 Effects of AEL on hematological indexes in rats

2.2.4 血清生化指標(biāo)檢查

肝、腎是動物生物轉(zhuǎn)化的重要場所，也是物質(zhì)代謝的主要器官，肝臟功能可由其特異酶（ALT、AST、ALP、T-BIL）、總蛋白（TP）、白蛋白（ALB）、甘油三酯（TG）、總膽固醇（TCHO）等來檢測[21,22]；腎臟是體內(nèi)最大的過濾器官，血清肌酐（Cr）、尿素氮（BUN）是檢測腎功能常見的指標(biāo)[23]。灌胃30 d后大鼠血清生化指標(biāo)檢查結(jié)果見表3。高劑量組雌性大鼠AST與ALT的比值低于對照組（P＜0.05），但AST和ALT檢查結(jié)果與對照組比較無顯著差異。

表3 黑果枸杞花青素提取物對大鼠血清生化指標(biāo)的影響Table 3 Effects of AEL on serum biochemical indices of rats

電解質(zhì)檢查結(jié)果顯示高劑量組雄性動物Cl-較對照組升高（P＜0.05，改變率為2.9%），其他各項指標(biāo)與對照組相比無顯著差異。血清生化檢查結(jié)果說明在此實驗條件下，AEL對大鼠的血清生化指標(biāo)無不良影響。

2.2.5 大體解剖及病理學(xué)檢查

臟器質(zhì)量和臟器系數(shù)可以幫助判斷外源受試物對動物特定臟器的影響，有時候受試物會影響動物的攝食量、消化吸收能力從而影響受試動物的體質(zhì)量，導(dǎo)致臟體系數(shù)偏差，但通常成年動物的腦質(zhì)量是基本不變的，因此可以用臟腦系數(shù)綜合判斷受試物的毒性作用[24,25]。實驗結(jié)束后，各組大鼠剖檢可見胸、腹膜光滑，胸、腹腔內(nèi)未見積液、粘連，心、肝、脾、肺、腎、胃、腸、腦、睪丸及附睪/子宮及卵巢等臟器形態(tài)、顏色、位置等未見可見病理改變。稱取臟器質(zhì)量，計算主要臟器系數(shù)及臟腦系數(shù)。由表4可見，與對照組比較，高劑量組雄性大鼠脾臟系數(shù)升高（P＜0.05），其余臟器無明顯改變。由表5可見各組大鼠臟腦系數(shù)與對照組比較無顯著差異。臟體系數(shù)檢查和臟腦系數(shù)檢查結(jié)果顯示連續(xù)灌胃30 d，AEL對大鼠的臟器發(fā)育無不良影響。

表4 黑果枸杞花青素提取物對大鼠臟體系數(shù)的影響Table 4 Effects of AEL on viscera coefficient in rats

表5 黑果枸杞花青素提取物對大鼠臟腦系數(shù)的影響Table 5 Effects of AEL on viscera brain coefficient in rats

3 結(jié)論

急性毒性試驗中，給予小鼠8 000 mg/kg AEL，實驗組動物灌胃當(dāng)天及隨后的一般觀察中，均未出現(xiàn)明顯的毒性反應(yīng)，體質(zhì)量正常增長；14 d觀察期結(jié)束后，實驗組所有動物均未見明顯異常，解剖臟器未見明顯生理變化，說明小鼠對黑果枸杞花青素提取物的單次灌胃最大耐受劑量不低于8 000 mg/kg。

連續(xù)灌胃30 d，實驗組大鼠未見明顯異常反應(yīng)，體質(zhì)量、攝食量與對照組比較無顯著差異。高劑量組動物出現(xiàn)的糞便和尿液顏色改變，可能與受試物較深的顏色有關(guān)，或與機(jī)體隨之激發(fā)的吞噬功能增強(qiáng)相關(guān)，為機(jī)體的適應(yīng)性反應(yīng)。

綜合分析，在本實驗條件下，黑果枸杞花青素提取物對實驗動物無急性、亞急性毒性，具有較高的安全性。本實驗結(jié)果可以為黑果枸杞花青素功能性食品的開發(fā)利用提供一定的實驗基礎(chǔ)和理論依據(jù)。