呂永琴，蘇海佳，秦培勇，陳必強(qiáng)，譚天偉

(北京化工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院 北京市生物加工過程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 國家能源生物煉制研發(fā)中心,北京 100029)

化石燃料的過度利用導(dǎo)致人為CO2大量排放。每年釋放的CO2超過350億t，約為自然環(huán)境吸收速率的2倍[1-2]。預(yù)計到21世紀(jì)末，大量排放的CO2將導(dǎo)致全球地表溫度升高約2 ℃[3]。根據(jù)2015年簽訂的《巴黎協(xié)定》，世界上大多數(shù)國家同意采用不同方式進(jìn)行能源管理，以減少CO2的排放[4-8]。我國在2020年提出了2030年實(shí)現(xiàn)“碳達(dá)峰”，2060年實(shí)現(xiàn)“碳中和”的“雙碳”戰(zhàn)略目標(biāo)。同時，CO2也是儲量豐富的可再生碳源，可用于合成含碳燃料、材料和化學(xué)品。因此，實(shí)現(xiàn)對CO2的高效資源化利用是保障經(jīng)濟(jì)高質(zhì)量發(fā)展、助力實(shí)現(xiàn)全球“雙碳”目標(biāo)的一種有效策略。

CO2的催化轉(zhuǎn)化存在多種方法，主要包括熱催化加氫[9-10]、光催化轉(zhuǎn)化[11-12]、電催化轉(zhuǎn)化[13]和生物催化轉(zhuǎn)化[14]等(表1)。其中，電催化CO2還原具有反應(yīng)條件溫和、反應(yīng)速率快和便于大規(guī)模工業(yè)應(yīng)用等獨(dú)特優(yōu)勢而備受關(guān)注，被視為實(shí)現(xiàn)碳中和最有前景的策略之一[15-16]。然而，電催化CO2還原的產(chǎn)物多局限于一碳化合物，如CO、CH4、甲酸和甲醇等，并且產(chǎn)物的選擇性較低。生物催化轉(zhuǎn)化CO2是利用活細(xì)胞或酶作為催化劑，從CO2合成復(fù)雜有機(jī)分子的過程。與化學(xué)催化劑相比，生物酶催化劑具有選擇性高、操作條件綠色溫和以及易實(shí)現(xiàn)碳-碳偶聯(lián)、碳鏈延長等優(yōu)點(diǎn)，因此有助于將CO2轉(zhuǎn)化為高附加值長碳鏈產(chǎn)品[17]。根據(jù)目標(biāo)產(chǎn)物的不同，可以選擇利用單一酶或多酶作為催化劑。相對于單一酶催化劑，多酶催化劑系統(tǒng)對于生產(chǎn)高附加值產(chǎn)品更具優(yōu)勢。但由于CO2的高化學(xué)惰性，C=O鍵(750 kJ/mol)的斷裂需要輸入大量的能量，這使得CO2的活化和斷鍵成為一個難題。同時，CO2在液相反應(yīng)體系中的低溶解度嚴(yán)重影響了酶對底物的親和力和催化效率。

表1 用于CO2轉(zhuǎn)化的催化方法及各自特點(diǎn)

基于此，研究人員提出了電-酶偶聯(lián)催化轉(zhuǎn)化CO2策略，即在生物電化學(xué)體系中，利用電能驅(qū)動酶催化C=O斷鍵，進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)碳-碳偶聯(lián)和碳鏈的延長，以高能量效率合成高附加值和長碳鏈化合物。電-酶偶聯(lián)催化為轉(zhuǎn)化CO2生產(chǎn)附加值燃料、化學(xué)品和材料提供了一種新方法。因此，對這一新興領(lǐng)域的最新研究進(jìn)展及挑戰(zhàn)進(jìn)行系統(tǒng)性綜述是必要的。本文綜述了酶促電催化CO2還原的最新研究進(jìn)展，詳細(xì)介紹了NAD(P)H非依賴型和NAD(P)H依賴型氧化還原酶的電子傳遞機(jī)制，并重點(diǎn)闡述了酶與電極間的相互作用、電極的修飾與改性和新型電-酶耦合體系的構(gòu)建及研究動態(tài)。此外，對電-酶偶聯(lián)用于CO2催化轉(zhuǎn)化所面臨的主要挑戰(zhàn)和未來發(fā)展前景進(jìn)行了概述。

1 電子轉(zhuǎn)移機(jī)制

由于各類酶的催化機(jī)制不同，電-酶偶聯(lián)系統(tǒng)可以分為兩類：NAD(P)H依賴型和NAD(P)H非依賴型系統(tǒng)(圖1)。在NAD(P)H依賴型系統(tǒng)中，氧化型輔因子NAD(P)+接收電子再生為NAD(P)H，NAD(P)H作為電子和質(zhì)子的載體，輔助酶催化CO2還原，并重新轉(zhuǎn)變?yōu)檠趸瘧B(tài)的NAD(P)+。在NAD(P)H非依賴型的系統(tǒng)中，氧化還原酶可以通過直接電子轉(zhuǎn)移(direct electron transfer，DET)或間接電子轉(zhuǎn)移(mediated electron transfer，MET)兩種方式接受來自陰極的電子。

圖1 電-酶偶聯(lián)催化CO2轉(zhuǎn)化的電子轉(zhuǎn)移機(jī)制Fig.1 Mechanism of electron transfer in electrocatalytic-enzymatic hybrid systems for CO2 reduction

1.1 NAD(P)H依賴型系統(tǒng)

NAD(P)H是還原型輔因子煙酰胺二嘌呤核苷酸及其磷酸化形式的簡稱。在NAD(P)H依賴型的電-酶偶聯(lián)系統(tǒng)中，實(shí)現(xiàn)CO2還原通常需要經(jīng)歷多個電子轉(zhuǎn)移步驟，其中輔酶NAD(P)+向NAD(P)H的轉(zhuǎn)化是酶促CO2還原反應(yīng)發(fā)生的先決條件。通過向陰極施加一定的電壓(大于-0.32 VvsNHE[18])，氧化型的NAD(P)+可以從陰極上獲取電子，反應(yīng)所需的質(zhì)子則來源于陽極上發(fā)生的氧化反應(yīng)，通常為析氧反應(yīng)。NAD(P)H在金屬電極上直接催化再生的過電位較高，容易生成無活性的副產(chǎn)物[19]。為了解決這一問題，通常需要向電解液中添加更容易發(fā)生氧化還原反應(yīng)的水溶性電子介體，電子介體從陰極上獲取電子變?yōu)檫€原態(tài)，再擴(kuò)散到NAD(P)+附近，將電子傳遞給NAD(P)+，使之轉(zhuǎn)化為NAD(P)H，產(chǎn)生氧化態(tài)的電子介體擴(kuò)散回陰極繼續(xù)運(yùn)載電子，實(shí)現(xiàn)NAD(P)H的循環(huán)再生。使用游離的電子介體的缺點(diǎn)在于更換電解液時難以回收利用，且可能對酶產(chǎn)生一定的毒性[20-21]，將電子介體修飾在陰極上催化NAD(P)H再生是可行的解決方法之一。

NAD(P)H再生反應(yīng)的電子轉(zhuǎn)移過程復(fù)雜、副反應(yīng)多，會對電-酶偶聯(lián)還原CO2系統(tǒng)的長期運(yùn)行效率造成不利影響。在電-酶偶聯(lián)CO2還原系統(tǒng)中使用人工開發(fā)的輔因子類似物能使整體反應(yīng)的可控性更好，是引入NAD(P)H再生反應(yīng)的替代策略。常見的輔因子類似物為甲基紫精(methyl viologen，MV)及其衍生物，通過在分子兩端修飾不同的基團(tuán)，能夠調(diào)節(jié)輔因子類似物的還原電極電位，并改變其與不同酶之間的親和性[22-24]。

1.2 NAD(P)H非依賴型系統(tǒng)

部分CO2還原酶的分子表面含有鐵硫簇、核黃素和血紅素等“電子接收器”結(jié)構(gòu)，或具有暴露的氧化還原中心?；谶@種酶搭建的系統(tǒng)可以擺脫NAD(P)H的限制[25]，這類系統(tǒng)的電子轉(zhuǎn)移機(jī)制分為兩類：當(dāng)酶與電極之間的距離很近時，電極上的電子直接通過隧穿效應(yīng)到達(dá)酶的“電子接收器”或氧化還原中心部分，稱為直接電子轉(zhuǎn)移(DET)；當(dāng)酶與電極之間的距離較遠(yuǎn)時，使用人工電子介體在電極與酶的“電子接收器”或氧化還原中心之間穿梭遞送電子，稱為間接電子轉(zhuǎn)移(MET)。根據(jù)Marcus電荷轉(zhuǎn)移理論，為了保證酶的活性結(jié)構(gòu)與電極之間發(fā)生電子隧穿，二者距離應(yīng)小于1.4 nm[26]。因此，在直接電子轉(zhuǎn)移系統(tǒng)中，必須采用固定化手段將酶負(fù)載在電極表面，但酶的用量會受到電極面積的限制，同時,在DET體系中，界面電子轉(zhuǎn)移率通常較低。

電子介體(如2,2′-聯(lián)吡啶和4,4′-聯(lián)吡啶衍生物)能夠介導(dǎo)酶與陰極間的電子轉(zhuǎn)移，構(gòu)成MET系統(tǒng)。如，Choi等[27]利用甲基紫精在陰極和甲酸脫氫酶之間的穿梭電子，在5 h內(nèi)生產(chǎn)了6 mmol/L甲酸鹽。Sakai等[28]通過在炭黑修飾的電極上吸附來自Methylobacterium extorquensAM1的甲酸脫氫酶(FDH)MeFDH，以合成的1,1′-三亞甲基-2,2′-二溴聯(lián)吡啶(TQ)作為高效的電子傳遞介體，成功制備了氣體擴(kuò)散型生物陰極，用于CO2與甲酸的相互轉(zhuǎn)化;同時發(fā)現(xiàn)，電極的疏水性在構(gòu)建氣體擴(kuò)散型陰極系統(tǒng)中起關(guān)鍵作用，因?yàn)樗鼤绊懳降腇DH與可溶性TQ之間的相互作用。此外，典型的介體分子還包括有二茂鈷、醌類和吩噻嗪類等。

2 電-酶偶聯(lián)催化轉(zhuǎn)化CO2的研究進(jìn)展

目前，在酶促電催化系統(tǒng)中用于直接轉(zhuǎn)化CO2的酶包括碳酸酐酶(carbonic anhydrase，CA)、一氧化碳脫氫酶(carbon monoxide dehydrogenase，CODH)、甲酸脫氫酶(formate dehydrogenase，F(xiàn)DH)、氮酶以及巴豆酰輔酶A羧化酶/還原酶(crotonyl-CoA carboxylases/reductase，Ccr)等。這些酶系統(tǒng)還原CO2的反應(yīng)式見表2。此外，國內(nèi)外研究者還構(gòu)建了豐富的多酶級聯(lián)系統(tǒng)，以進(jìn)一步利用還原產(chǎn)品，生成更多高附加值化學(xué)品。常見的多酶級聯(lián)系統(tǒng)為FDH、甲醛脫氫酶(formaldehyde dehydrogenase，F(xiàn)aldDH)和醇脫氫酶(alcohol dehydrogenase，ADH)組成的三酶級聯(lián)系統(tǒng)，可將CO2催化轉(zhuǎn)化為甲醇。也有一些研究者致力于開發(fā)酶促電催化CO2還原的多酶級聯(lián)新途徑，將CO2還原的初級產(chǎn)品進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為C6藥物前體[29]和氨基酸[30]等。

表2 用于直接CO2轉(zhuǎn)化的酶及反應(yīng)式

2.1 單酶與電極間相互作用的解析

FDH和CODH是最早發(fā)現(xiàn)的能夠利用電能催化CO2和甲酸、CO2和CO可逆轉(zhuǎn)化的酶。在早期的工作中，研究人員通過向電解液中添加甲基紫精，使之穿梭于電極和酶的氧化還原中心之間傳遞電子[31-32]。循環(huán)伏安法(CV)是研究電極與酶之間電子傳輸機(jī)制的有效手段。2007年，Armstrong團(tuán)隊的Parkin等[33]發(fā)現(xiàn)，Carboxydothermus hydrogenform來源的Ni-CODH Ⅰ對CO/CO2之間相互轉(zhuǎn)化的氧化和還原反應(yīng)都表現(xiàn)出強(qiáng)烈的電催化活性;研究不同pH和溫度下的CV曲線后發(fā)現(xiàn)，Ni-CODH Ⅰ催化CO2/CO氧化還原循環(huán)具有電化學(xué)可逆特征。隨后Hirst團(tuán)隊先后建立起基于W-/Mo-FDH直接電子轉(zhuǎn)移的電-酶偶聯(lián)系統(tǒng)[34-35]，并提出酶與電極間的電子轉(zhuǎn)移可能是依靠鐵硫簇完成的。但在單個循環(huán)伏安實(shí)驗(yàn)中，由于酶的解吸或變性，電流隨著時間的延長而降低。

Sakai等[36]將FDH引入介孔碳電極的孔道中，通過循環(huán)伏安測試發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)DH同時表現(xiàn)出直接和間接電子轉(zhuǎn)移的特征，這是由于靠近酶表面的鐵硫簇與電極孔道發(fā)生相互作用，直接電子轉(zhuǎn)移通信增強(qiáng)，而間接電子轉(zhuǎn)移過程的氧化還原則由部分解離的黃素單核苷酸(flavin mononucleotide，F(xiàn)MN)介導(dǎo)，兩種過程共同促進(jìn)CO2的還原。

蛋白膜伏安法(protein-film voltammetry，PFV)是由Armstrong等[37]開發(fā)的專門研究蛋白質(zhì)氧化還原電化學(xué)的技術(shù)，該技術(shù)依賴于吸附在電極上的活性蛋白質(zhì)單層薄膜，且蛋白中應(yīng)至少有一處氧化還原輔因子與電極緊密結(jié)合，以使蛋白質(zhì)中的活性位點(diǎn)能夠與電極進(jìn)行電子交換[38]。通過向蛋白質(zhì)薄膜電極施加受控電極電勢，可以使用各種伏安技術(shù)表征蛋白質(zhì)的氧化還原特征，獲取目標(biāo)蛋白的多種熱力學(xué)和動力學(xué)信息，從而解析復(fù)雜的電子轉(zhuǎn)移機(jī)制[39]。Li等[25]通過蛋白質(zhì)膜伏安法首次明確了來源于Clostridium ljungdahlii的W-FDH中[4Fe-4S]2+/+簇的還原和氧化特征，穩(wěn)定的蛋白質(zhì)膜與快速的電子轉(zhuǎn)移使該系統(tǒng)的轉(zhuǎn)化頻率(TOF)達(dá)到了1 210 s-1。

將PFV與石英晶體微天平(quartz crystal microbalance，QCM)、原子力顯微鏡(atomic forcemicroscope，AFM)和衰減全反射紅外光譜(attenuated total refraction infrared spectroscopy，ATR-IR)等技術(shù)相結(jié)合，能夠更清晰地解析酶和電極之間的相互作用。Lacey團(tuán)隊的Alvarez-Malmagro等[40]通過酰胺鍵將來源于Desulfovibrio vulgarisHildenborough的甲酸脫氫酶(DvH-FDH)共價固定在金電極和低密度石墨電極表面，并通過修飾電極上的帶電基團(tuán)調(diào)節(jié)酶的取向(圖2)，經(jīng)AFM和QCM分析發(fā)現(xiàn)：DvH-FDHs在電極表面形成了緊密錨定的蛋白層；在電解液中加入芐基紫精后，電化學(xué)測試能夠同時檢測到直接和間接電子轉(zhuǎn)移的電流，其中基于間接電子轉(zhuǎn)移的催化電流明顯高于直接電子轉(zhuǎn)移的，因此他們認(rèn)為，除與電極直接接觸的單層酶以外，電極頂部仍有許多交聯(lián)酶分子，這些酶分子只能通過電子介體實(shí)現(xiàn)催化作用。以Lacey團(tuán)隊的研究為基礎(chǔ)，F(xiàn)era等[41]近期設(shè)計了4-氨基苯基修飾的多壁碳納米管電極，并將DvH-FDH通過靜電作用吸附在電極表面，形成了以利于電子傳輸?shù)娜∠?，同時進(jìn)一步使用聚乙烯亞胺穩(wěn)定了這種取向，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：多壁碳納米管的引入提高了電化學(xué)活性面積，PEI則通過保護(hù)酶和增加局部CO2濃度兩種效應(yīng)提高了催化電流，催化電流密度達(dá)-230 μA/cm2，能夠連續(xù)運(yùn)行11 h。

圖2 使用帶電基團(tuán)調(diào)節(jié)酶的取向[40]Fig.2 Using charged groups to modify the orientation of enzyme[40]

除了電子轉(zhuǎn)移方式外，酶與電極間的結(jié)合作用力也能通過PFV和QCM等方法聯(lián)合表征。Reisner團(tuán)隊的Miller 等[42]通過蛋白質(zhì)膜伏安法觀察到了固定在介孔摻銦氧化錫(ITO)和介孔TiO2電極上的DvH-FDH中[4Fe-4S]簇高效的電荷轉(zhuǎn)移；進(jìn)一步用QCM分析了酶與介孔TiO2在不同緩沖液離子強(qiáng)度下的相互作用強(qiáng)度后發(fā)現(xiàn)，隨著緩沖液離子強(qiáng)度的增加，仍有70%～60%的酶被吸附，證明了FDH與電極之間存在比靜電相互作用更強(qiáng)的親和力；同時，用ATR-IR驗(yàn)證了吸附態(tài)FDH骨架結(jié)構(gòu)的穩(wěn)態(tài)。2022年，Reisner團(tuán)隊的Badiani等[43]以一系列帶電和中性的自組裝單分子層來修飾金電極，賦予電極不同的氫鍵供體能力，并使用QCM分析蛋白質(zhì)膜在不同氫鍵作用力下的損失后發(fā)現(xiàn)，酶與電極之間DET活性下降的主要是由酶的解吸損失引起的，而僅靠靜電作用不足以防止這種損失；同時發(fā)現(xiàn)，如氫鍵作用力等靜電作用以外的非共價相互作用對穩(wěn)定蛋白質(zhì)膜有重要影響，該結(jié)果為建立酶-電極界面提供了理論支持(圖3)。此外，Badiani等[44]還構(gòu)建了具有正電(—NHMe2+)和負(fù)電(—COO-)基團(tuán)修飾的碳納米管/碳量子點(diǎn)材料，使得吸附在電極上的酶存在不同的取向，以研究材料表面工程對酶的結(jié)合和催化CO2還原的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：當(dāng)使用正電修飾的碳納米管時，CO2和甲酸可逆轉(zhuǎn)化的電流遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于使用帶負(fù)電的碳納米管；向溶液中添加甲基紫精后，后者才能檢測到催化電流，表明當(dāng)電極帶負(fù)電時，酶的鐵硫簇定位在電極的遠(yuǎn)端，二者之間的電子交換只能通過電子介體來完成。

圖3 酶與電極間的非共價相互作用[43]Fig.3 Non-covalent interaction between enzyme and electrode[43]

2.2 合理構(gòu)架電極，提升能量傳遞效率

NADH依賴型甲酸脫氫酶由于其來源廣泛并且高度耐氧而備受關(guān)注，然而受限于NADH的應(yīng)用成本，該類系統(tǒng)難以投入工業(yè)規(guī)模的長期生產(chǎn)。電化學(xué)催化是一種經(jīng)濟(jì)、綠色的NADH再生方法，在此過程中，具有催化活性位點(diǎn)的陰極材料在外加電位的驅(qū)動下，催化NAD+的煙酰胺部分加2e-和1H+，生成還原型的NADH。為了實(shí)現(xiàn)電催化NADH再生，常用的策略是在電極基底上修飾聚中性紅[45-48]、Rh復(fù)合物電子介體[49-51]，或向溶液中添加甲基紫精[52]、中性紅[53-54]等游離的電子介體。此外，Cu基材料也作為NADH再生的電催化劑應(yīng)用在電-酶偶聯(lián)CO2還原體系中。2018年，Barin等[55]使用泡沫銅電極還原NAD+，能夠在240 min內(nèi)將大部分NAD+還原為NADH。2019年，Song等[56]將Cu納米顆粒沉積在碳?xì)稚?，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：該電極催化NADH再生的性能高于泡沫Cu；為了提高NADH在電極與酶之間的穿梭效率，利用Cu納米顆粒與酶表面半胱氨酸殘基的配位作用將酶固定在電極上，同時連接聚乙二醇擺臂與NADH，以限制NADH的擴(kuò)散范圍(圖4(a))。

圖4 銅納米顆粒催化和FNR介導(dǎo)的NADH再生系統(tǒng)Fig.4 Cu nanoparticle catalyzed and FNR-mediated NADH regeneration system

鐵氧還原蛋白-NADP+還原酶(ferredoxin NADP+reductase，F(xiàn)NR)在天然光合作用中承擔(dān)著光反應(yīng)電子轉(zhuǎn)移的最后一步——將NADP+還原為NADPH[57]，通過將FNR固定在電極上，能夠介導(dǎo)NADPH的再生。Morello等[58]設(shè)計了具有納米孔道的ITO電極，在該電極上同時限域固定了FNR以及NADP-蘋果酸酶(NADP-ME)，其中FNR負(fù)責(zé)接收電子、催化NADPH再生，而ME則承擔(dān)著CO2同化的功能，最終將CO2和丙酮酸轉(zhuǎn)化為蘋果酸(圖4(b))。2021年，Castaeda-Losada等[59]在氧化還原水凝膠內(nèi)共固定FNR與巴豆酰輔酶A羧化酶/還原酶，實(shí)現(xiàn)了NADPH的循環(huán)再生和巴豆酰輔酶A分子β位的立體選擇性羧化，最終的法拉第效率高達(dá)92%±6%。

NAD(P)H非依賴型的酶通過鐵硫簇等輔因子基團(tuán)與電極交換電子，當(dāng)酶被固定化時，酶的氧化還原中心或電活性輔因子必須朝向電極才能發(fā)生有效電子傳遞[60]，為消除蛋白與電極間的非電活性接觸，研究人員開發(fā)了用于固定化酶的氧化還原活性聚合物。這種聚合物將酶包封在電極上，在蛋白四周形成緊密的三維電子傳導(dǎo)層，將電極上提供的電子運(yùn)送到酶的活性位點(diǎn)。

Milton團(tuán)隊的Yuan等[20]設(shè)計了一種含有二茂鈷(cobaltocene，Cc)結(jié)構(gòu)的低電位氧化還原聚合物用于固定Escherichia coli來源的Mo-FDH,結(jié)果發(fā)現(xiàn)：通過對聚合物施加-0.66 VvsSHE的電壓，Mo-FDH無須利用電子介體就能保持連續(xù)的CO2還原活性，在經(jīng)過500次連續(xù)CV掃描之后，還原峰電流下降幅度不到5%。Kuk等[61]則采用了無金屬離子的導(dǎo)電聚苯胺水凝膠固定Clostridium ljungdahlii來源的 W-FDH，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：聚苯胺水凝膠電極連續(xù)分層的大表面積納米纖維網(wǎng)絡(luò)賦予該電極較短的電子擴(kuò)散長度和納米尺度的開放通道，在提升酶載量的同時保證了電子遞送和底物產(chǎn)物擴(kuò)散；體系將CO2轉(zhuǎn)化為甲酸的過電位低至40 mV，法拉第效率為92.7%。

由于CO2還原過程通常伴隨著質(zhì)子的快速消耗，電極局部pH與主體相pH往往會產(chǎn)生巨大差異。因此，在設(shè)計電-酶偶聯(lián)CO2還原系統(tǒng)時，應(yīng)當(dāng)考慮電極局部微環(huán)境的快速變化對酶活的影響。設(shè)計合適的緩沖策略，可使酶在電解池中催化作用更高效。最近，Reisner團(tuán)隊的Edwardes Moore等[62]基于生物電催化的有限元模擬(finite element model，F(xiàn)EM)對多孔電極內(nèi)的局部微環(huán)境進(jìn)行了深度研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：通過調(diào)整電解液、pH和pKa，可獲得酶催化的最佳孔內(nèi)局部pH；大孔電極具有利于H+傳質(zhì)的優(yōu)點(diǎn)，將電-酶偶聯(lián)生成甲酸的催化活性提高了18倍。遵循這一思路，該團(tuán)隊的Cobb等[63]構(gòu)建FDH@介孔電極體系，通過研究碳酸酐酶催化密閉環(huán)境中CO2的水合動力學(xué)，輔以有限元分析和電化學(xué)測定確定了共固定化碳酸酐酶在該體系中發(fā)揮的作用：①通過催化CO2和HCO-3的相互轉(zhuǎn)化緩沖局部pH；②調(diào)節(jié)CO2和HCO-3的濃度。近期，Cobb等[64]基于上述成果設(shè)計了模擬藍(lán)藻羧化體的碳酸酐酶-甲酸脫氫酶共固定化系統(tǒng)，通過使用Good′s緩沖液做電解液來替代碳酸酐酶緩沖局部pH的作用，使所有溶解的碳都能被轉(zhuǎn)化為電-酶催化的底物CO2，而處在最佳局部pH微環(huán)境中的甲酸脫氫酶則將CO2完全還原為甲酸。該體系最終實(shí)現(xiàn)了大氣濃度CO2(12 μmol/L)的直接轉(zhuǎn)化。

最近，Moreno等[65]從工作電壓、電解液溶解O2量和系統(tǒng)pH穩(wěn)定性3個方面進(jìn)行優(yōu)化，使電-FDH酶偶聯(lián)催化轉(zhuǎn)化CO2系統(tǒng)達(dá)到最佳工作狀態(tài)：首先，優(yōu)化了電解池的整體電壓以實(shí)現(xiàn)最高的庫倫效率；然后，引入O2清除劑Na2S2O3以減少由于O2還原產(chǎn)生的額外電流；最后，搭建了pH反饋回路，通過引入pH泵緩沖反應(yīng)過程中的pH變化，實(shí)現(xiàn)了整體系統(tǒng)性能最大化，在-0.85 VvsAg/AgCl電壓條件下，甲酸生產(chǎn)強(qiáng)度率達(dá)5 mol/(L·h)。

由于電催化CO2還原反應(yīng)的底物常以氣體形式通入電解池，某些產(chǎn)物(如CO和乙烯等)也以氣體形式擴(kuò)散，所以可使用氣體擴(kuò)散層來增強(qiáng)傳質(zhì)有利于氣-液-固三相界面接觸，增強(qiáng)催化電流[66-67]。如，Szczesny等[68]設(shè)計了一種低電位紫精基氧化還原聚合物，該聚合物將W-FDH固定在電極上，而聚合物/酶層則裝載在氣體擴(kuò)散層上，這種設(shè)計保證了酶與電極間的電子傳遞，并且在運(yùn)行長達(dá)45 h后仍保留了80%以上的活性；同時，氣體擴(kuò)散層的引入使氣態(tài)CO2直接作為酶催化的底物，有效克服了氣-液-固界面?zhèn)髻|(zhì)阻礙，電流明顯高于直接鼓泡的情況。同樣，Becker等[69]針對基于CODH的電-酶偶聯(lián)系統(tǒng)設(shè)計了氣體擴(kuò)散電極，利用二茂鈷基低電位氧化還原聚合物固定來源于Carboxydothermus hydrogenoformans的CODH Ⅱ，催化電流密度高達(dá)-5.5 mA/cm2，電極活性的半衰期超過20 h(圖5(a))。

圖5 氣體擴(kuò)散電極固定化酶及其對應(yīng)體系的CV曲線Fig.5 Schematic diagram of immobilized enzyme with gas diffusion electrode and its CV curve of corresponding system

使用一氧化碳脫氫酶時，引入氣體擴(kuò)散電極依然十分有利。Contaldo等[70]將Rhodospirillum rubrum中RrCODH的結(jié)構(gòu)基因cooS、cooC、cooT和cooJ在E.coli中重組表達(dá)，并通過聚丙烯酰胺凝膠電泳一步純化得到高純度的RrCODH，在實(shí)驗(yàn)環(huán)境條件下，RrCODH具有顯著的活性；然后通過疏水相互作用將RrCODH固定在1-芘丁酸金剛烷酰胺修飾的多壁碳納米管電極上，在專門設(shè)計的CO2/CO氣體擴(kuò)散電解池中，可實(shí)現(xiàn)選擇性CO2/CO相互轉(zhuǎn)換，轉(zhuǎn)化數(shù)(TON)超過80萬，并能穩(wěn)定運(yùn)行1 h以上。為了進(jìn)一步穩(wěn)定酶與電極的結(jié)合，Contaldo等[71]合成了一種含有Ni中心的固定分子，使用His-tag將重組RrCODH固定在碳納米管上，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：在氣體擴(kuò)散生物電極上，生物催化電流達(dá)到毫安級，實(shí)現(xiàn)了高度穩(wěn)定的CO2還原(圖5(b))，這種設(shè)計使RrCODH在催化過程中對氧的耐受性有所提高，在接近零過電位的情況下，TON超過了60萬。

2.3 固定化酶技術(shù)提高催化穩(wěn)定性

電-酶偶聯(lián)系統(tǒng)的另一個挑戰(zhàn)在于生物酶蛋白本身的脆弱性，為了保證系統(tǒng)的穩(wěn)定運(yùn)行，采用固定化酶技術(shù)能夠最大程度保持酶的原有結(jié)構(gòu)，減弱局部電場和外界有害物質(zhì)對酶造成的損傷。

晶態(tài)多孔材料(crystalline porous material，CPM)主要包括沸石、金屬有機(jī)骨架(MOF)和共價有機(jī)骨架(COF)等材料[72]。由于晶態(tài)多孔材料結(jié)構(gòu)的多樣性、均勻可控的孔徑和超高的孔隙率，在固定化酶領(lǐng)域擁有巨大的應(yīng)用潛力[73-74]。

Liu等[53]設(shè)計了基于NADH再生的電酶偶聯(lián)CO2還原體系，NADH再生過程由中性紅介導(dǎo)，F(xiàn)DH則固定在聚乙烯亞胺修飾的有序介孔分子篩SBA-15孔道中，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：經(jīng)固定化的酶催化3 h后的甲酸產(chǎn)量是游離酶的3.7倍；在12個循環(huán)后，體系仍保留了80%以上的活性。NU-1006是一種大孔Zr基金屬有機(jī)骨架材料，其孔徑高達(dá)6.2 nm，足以容納甲酸脫氫酶[75]。Farha團(tuán)隊的Chen等[51]使用NU-1006來固定酶，通過結(jié)合Rh復(fù)合物修飾的電極以循環(huán)再生NADH，甲酸的產(chǎn)量與運(yùn)行穩(wěn)定性都有了很大的提升。

金屬有機(jī)骨架UiO-66-NH2具有大比表面積和微孔結(jié)構(gòu)，其孔徑更接近CO2的動力學(xué)分子直徑(0.35 ～0.51 nm)，常常被用于CO2的分離和捕集[76-77]，所以使用UiO-66-NH2來固定酶，有助于在酶催化之前預(yù)先富集CO2底物分子，從而提高底物濃度。然而，UiO-66-NH2的孔徑較小，無法直接將酶吸附在孔道內(nèi)。Jiang團(tuán)隊的Yan等[52]使用合成后配體替代(post-synthetic ligand substitution,PSLS)策略，利用末端配體取代橋接配體向UiO-66-NH2中引入了介孔，并保留原來的部分微孔，形成分級結(jié)構(gòu)，同時保證了MOF將酶固定化和CO2捕集的功能。該系統(tǒng)可利用甲基紫精傳遞來自陰極的電子為固定化的FDH循環(huán)提供NADH，經(jīng)優(yōu)化后體系反應(yīng)3 h的甲酸產(chǎn)量為游離酶的5.57倍，而且72 h后殘余酶活保持為初始酶活的70%以上；隨后，該團(tuán)隊開發(fā)了另一種用于電-酶偶聯(lián)系統(tǒng)的FDH固定化策略，通過靜電作用將FDH預(yù)先吸附在聚乙烯亞胺修飾的SiO2納米花載體上，再進(jìn)一步包覆ZIF-8形成核殼狀結(jié)構(gòu)，這不僅有效防止酶從載體中泄漏，而且ZIF-8的咪唑基團(tuán)同樣對CO2有親和力，起到預(yù)先富集的作用。

Jiang團(tuán)隊的工作為MOF材料在甲酸脫氫酶固定化中的應(yīng)用提供了有價值的參考，但是MOF材料提升電-酶偶聯(lián)酶催化效率的機(jī)制尚未被解析出來。最近，Yang團(tuán)隊的Jia等[78]使用ZIF-8將來源于Candida boidinii的FDH包封在電極上(圖6)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：ZIF-8的存在增加了電極的疏水性和CO2親和力，最終使甲酸的生產(chǎn)速率比僅使用酶的組別高28倍；原位衰減全反射表面增強(qiáng)紅外吸收光譜(attenuated total reflectance surface-enhanced infrared absorption spectroscopy，ATR-SEIRAS)揭示了反應(yīng)過程中的關(guān)鍵中間體OCHO*(圖6(e))，理論模擬表明，ZIF-8中的2-甲基咪唑基團(tuán)起著類似于輔酶的作用，能夠有效調(diào)節(jié)酶催化位點(diǎn)中纈氨酸的活性，降低基于OCHO*過程的過電位，在-1.1 VvsAg/AgCl的外加電壓條件下，復(fù)合體系的甲酸產(chǎn)量高達(dá)103.9 mmol/(L·h)，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于僅使用ZIF-8和僅使用FDH的組別(圖6(d))。

圖6 ZIF-8包封的FDH電-酶偶聯(lián)系統(tǒng)、表征及甲酸產(chǎn)量[78]Fig.6 Schematic diagram of ZIF-8 encapsulated FDH characterization and formic acid production[78]

2.4 設(shè)計電-酶偶聯(lián)新途徑，合成高價值產(chǎn)品

除甲酸脫氫酶、一氧化碳脫氫酶和巴豆酰輔酶A羧化酶/還原酶外，尋找和開發(fā)新型生物酶催化劑將為CO2催化轉(zhuǎn)化開拓新方向，進(jìn)一步提升催化體系的工業(yè)應(yīng)用價值。氮酶的生理功能是將N2還原為NH3，該過程的活化能壘與某些CO2還原反應(yīng)的能壘相似，故而在特定的非生理?xiàng)l件下，氮酶也能用于催化CO2的還原[79]。2012年，Yang等[80]發(fā)現(xiàn)，MoFe-氮酶的雙突變體(α-70Val→Ala、α-195His→Gln)具有催化CO2生成甲烷以及還原偶聯(lián)催化CO2和乙炔生成丙烯的能力。2016年，該團(tuán)隊的Khadka等[81]進(jìn)一步揭示了氮酶催化CO2還原為甲酸、CO和甲烷的3種作用途徑：通過Fe-H的直接氫化物轉(zhuǎn)移，CO2更容易生成甲酸，而當(dāng)CO2中的C原子直接吸附在Fe位點(diǎn)上時，則更容易生成CO和CH4。2018年，Seefeldt團(tuán)隊的Hu等[82]構(gòu)建了基于氮酶的電-酶偶聯(lián)CO2轉(zhuǎn)化系統(tǒng)，使用茂鈷基聚合物介導(dǎo)電極向MoFe-或FeFe-氮酶的電子轉(zhuǎn)移，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，二者催化CO2轉(zhuǎn)化為甲酸的法拉第效率分別為9%和32%。Minteer團(tuán)隊的Cai等[83]則發(fā)現(xiàn)，在以二茂鈷衍生物為電子介體的條件下，來源于Azotobacter vinelandii的VFe-氮酶能夠催化C—C鍵偶聯(lián)，將CO2轉(zhuǎn)化為乙烯和丙烯，并且催化過程不需要ATP的參與。

Li等[84]通過改變氫鍵網(wǎng)絡(luò)和[4Fe-4S]簇的溶劑暴露來調(diào)節(jié)Hydrogenobacter thermophilus中鐵氧還原蛋白的還原電位，并以改造的鐵氧還原蛋白作為電子介體向2-氧代酸：鐵氧還蛋白氧化還原酶(2-oxoacid：ferredoxin oxidoreductase，OFOR)遞送電子，催化乙酰輔酶A和1分子CO2轉(zhuǎn)化為丙酮酸和輔酶A，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：當(dāng)降低鐵氧還蛋白的還原電位降低時，CO2的還原反應(yīng)在一定程度上能獲得更大的驅(qū)動力，TOF最大為81.3 min-1，CO2還原活性相當(dāng)于625 nmol/(min·mg)。

進(jìn)一步挖掘和改造CO2還原酶，擴(kuò)展電-酶偶聯(lián)CO2還原系統(tǒng)的蛋白庫是未來的研究方向之一。引入多酶級聯(lián)系統(tǒng)直接合成高附加值化學(xué)品是人們一直以來的熱點(diǎn)。用于CO2催化轉(zhuǎn)化最常見的多酶途徑為甲酸脫氫酶-甲醛脫氫酶-醇脫氫酶(FDH-FaldDH-ADH)組成的三酶級聯(lián)系統(tǒng)。CO2在級聯(lián)反應(yīng)中經(jīng)歷了由甲酸到甲醛再到甲醇的三步變化。然而，由于三酶級聯(lián)反應(yīng)的復(fù)雜性以及該體系對NADH的高度依賴，使催化效率不高。為了提升電-酶偶聯(lián)催化效率，不同的科學(xué)家開發(fā)了不同手段。如，Addo等[47]發(fā)現(xiàn)，加入碳酸酐酶能夠加速甲醇生成。Zhang等[50]將3種酶共包封在ZIF-8中，實(shí)現(xiàn)了CO2和NADH的預(yù)濃縮，并提升了酶催化的穩(wěn)定性。Zhang等[85]采用另加入天然深共晶溶劑作為電-酶偶聯(lián)CO2轉(zhuǎn)化的共電解質(zhì)策略，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該方法有助于提高CO2溶解度、改善酶的活性。

同時發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)DH-FaldDH-ADH三酶級聯(lián)在大表面積電極上可以擺脫對NADH的依賴，通過直接攝取電子的方式催化CO2轉(zhuǎn)化為甲醇。Schlager等[86]利用海藻酸鹽-硅酸鹽水凝膠將酶固定在碳?xì)蛛姌O上，首次實(shí)現(xiàn)了無NADH的三酶級聯(lián)催化CO2制甲醇，法拉第效率約為10%，然而電子從電極到酶的傳遞機(jī)制尚不清楚。2020年，Seelajaroen等[87]利用羧基化石墨烯共價固定FDH-FaldDH-ADH三酶級聯(lián)系統(tǒng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：在-1.2 VvsAg/AgCl的電壓條件下，該系統(tǒng)催化CO2還原時同樣不需要NADH的參與，法拉第效率為12%。

開發(fā)新型多酶途徑，或?qū)⒚复俜磻?yīng)與其他反應(yīng)級聯(lián)提升CO2還原體系配置的靈活性，生產(chǎn)更豐富、更高價值的產(chǎn)品，是構(gòu)建電-酶偶聯(lián)催化轉(zhuǎn)化CO2系統(tǒng)的發(fā)展趨勢之一，包括：①電催化CO2還原-多酶催化偶聯(lián)；②電-酶催化CO2還原-微生物發(fā)酵偶聯(lián)；③復(fù)雜多酶電催化CO2還原系統(tǒng)。

Ren團(tuán)隊的Jack等[29]構(gòu)建了由CO2到乙醇再到C6藥物前體的轉(zhuǎn)化系統(tǒng)：第一步反應(yīng)由Cu基電催化劑實(shí)現(xiàn)催化還原CO2，生成的乙醇經(jīng)過精餾純化被輸送到多酶反應(yīng)器中；在酶反應(yīng)器中，醇脫氫酶首先將乙醇轉(zhuǎn)化為乙醛，隨后3分子乙醛被2-脫氧核糖-5-磷酸醛縮酶(2-deoxyribose-5-phosphate aldolase，DERA)利用，合成2,4-二脫氧己糖衍生物；反應(yīng)24 h后，目標(biāo)產(chǎn)品高達(dá)632～712 mg/L，平均轉(zhuǎn)化率為38%(圖7(a))。Chen等[88]驗(yàn)證了電-酶催化CO2還原-微生物發(fā)酵偶聯(lián)的可行性(圖7(b))：利用中性紅(NR)介導(dǎo)NADH再生，輔助甲酸脫氫酶(FDH)將CO2轉(zhuǎn)化為甲酸，并在電解池中共培養(yǎng)了工程菌Ralstonia eutropha，利用甲酸和CO2生產(chǎn)聚(3-羥基丁酸酯)(PHB)；在-0.6 VvsAg/AgCl的條件下，該系統(tǒng)可生成(485±13) mg/L PHB，是對照組(不添加FDH和NR)的3倍。由此可見，中性紅在體系中不僅作為催化NADH再生的電子介體，還作為細(xì)菌的跨膜電子穿梭載體，將電子直接傳遞到微生物細(xì)胞中，增加胞內(nèi)還原力。

圖7 電-酶偶聯(lián)催化轉(zhuǎn)化CO2還原系統(tǒng)Fig.7 Electrocatalytic-enzymatic hybrid systems for CO2 reduction

近期，Zhu團(tuán)隊的Wu等[30]利用CO2和NH3為唯一碳源和氮源合成甘氨酸的體外復(fù)雜多酶電催化CO2還原系統(tǒng)(圖7(c))。該系統(tǒng)依據(jù)反應(yīng)過程中所需的NAD(P)H由Cu基電極再生，并且加入了多磷酸激酶，通過犧牲多磷酸(poly P)再生ATP。整個過程主要包括3個模塊的酶促反應(yīng)：①FDH還原CO2為甲酸；②甲酸依次被甲酸-四氫葉酸連接酶、甲基四氫葉酸環(huán)水解酶和亞甲基四氫葉酸脫氫酶催化轉(zhuǎn)化為5,10-亞甲基四氫葉酸；③甘氨酸裂解系統(tǒng)的4種內(nèi)源酶將5,10-亞甲基四氫葉酸與外源的CO2和NH3縮合生成甘氨酸，四氫葉酸被釋放出來。由于電能主要用于NAD(P)H的再生，該系統(tǒng)的法拉第最高可達(dá)到96.8%，甘氨酸的生產(chǎn)強(qiáng)度達(dá)8.69 mg/(L·h)。

3 結(jié)論與展望

電-酶偶聯(lián)催化CO2還原系統(tǒng)利用可再生的電能為酶促CO2還原反應(yīng)提供能量，可實(shí)現(xiàn)由電能向化學(xué)能的轉(zhuǎn)化，從而獲得更高的效率和多樣化的產(chǎn)品。根據(jù)電子轉(zhuǎn)移方式的不同，電-酶偶聯(lián)CO2還原系統(tǒng)可以分為NAD(P)H非依賴型和NAD(P)H依賴型系統(tǒng)。前者的酶通過直接或間接的方式與電極交換電子，而后者則通過電催化NAD(P)H再生反應(yīng)為酶提供還原力。本文從電極與酶的互作、電極的理性設(shè)計以及新型電-酶偶聯(lián)系統(tǒng)三個方面對該領(lǐng)域的研究進(jìn)展進(jìn)行了系統(tǒng)總結(jié)，但該類體系仍處于基礎(chǔ)研究階段，面臨著許多挑戰(zhàn)。

1)不管是單酶還是多酶系統(tǒng)，在投入電解池之前都需要經(jīng)過繁瑣的分離純化過程，開發(fā)更加簡易、系統(tǒng)性的目標(biāo)酶分離純化方法對于降低成本、達(dá)到規(guī)?；a(chǎn)非常重要。

2)目前應(yīng)用于電-酶偶聯(lián)催化CO2還原的酶種類較少，在通過蛋白質(zhì)工程手段優(yōu)化已知酶的催化效率、氧耐受性和催化穩(wěn)定性的同時，還需要探索新的生物酶催化劑，建立和拓展CO2還原酶庫。

3)由于CO2的溶解度較低，不利于酶催化反應(yīng)，因此，需要設(shè)計新型的電極和反應(yīng)器，以實(shí)現(xiàn)CO2的原位富集，為CO2的高效轉(zhuǎn)化提供保障。

4)人工電催化系統(tǒng)與酶之間存在相容性差的問題，酶在電解液中容易失活，并且存在動力學(xué)不匹配的挑戰(zhàn)。因此，應(yīng)進(jìn)一步改善電解池配置，采用分池設(shè)計等方法，優(yōu)化兩者之間的耦合適配。

總之，隨著新型電-酶偶聯(lián)CO2還原系統(tǒng)的不斷優(yōu)化以及新型多酶途徑的開發(fā)，有望實(shí)現(xiàn)以CO2為原料合成各類化學(xué)品，這將在能源、化工、醫(yī)藥和食品等多個領(lǐng)域多個層次上拓展第三代生物制造的應(yīng)用，為實(shí)現(xiàn)“碳達(dá)峰”“碳中和”的戰(zhàn)略目標(biāo)提供助力。

僅以此文獻(xiàn)給尊敬的歐陽平凱院士！