李佳瑞，顧 潔，徐曉宇，聶 堯，徐 巖

(江南大學生物工程學院，江蘇 無錫 214122)

槲皮素是一種多羥基黃酮類化合物，化學名為3,3′,4′,5,7-五羥基黃酮，又名櫟精，槲皮黃素。槲皮素在自然界中主要存在于蔬菜、水果和草藥當中，如洋蔥、花椰菜、藍莓、皺葉芥藍和韭菜中含有豐富的槲皮素[1]。槲皮素具有廣泛的藥理作用，包括抗過敏、抗炎、抗癌、抗心血管保護、抗腫瘤、抗病毒、免疫調節(jié)、調節(jié)血糖、抗高血壓和胃保護等作用[1-3]，是一種藥用價值極高的天然產物。槲皮素結構的復雜性和在自然界中較低的豐富度給槲皮素的合成與提取帶來了阻礙[4]。目前，槲皮素多是從天然植物中提取或從植物中提取蘆丁，進而采用酸水解的方式制備槲皮素[5-7]。傳統(tǒng)方法涉及化學試劑的使用或需要提供高溫高壓環(huán)境，從而帶來環(huán)境污染及生產安全等問題。生物發(fā)酵法以其條件溫和、對環(huán)境污染小等優(yōu)勢越來越受到重視。李琦玲等[8]采用青霉菌固態(tài)發(fā)酵的方法，以桂被金槐槐米為原料發(fā)酵生產槲皮素，產量達33.67 mg/g。Tartik等[4]對酵母的生物合成途徑進行改造使其生產槲皮素，產量達930 mg/L。

曲克蘆丁是羥乙基蘆丁的混合物，可經蘆丁(槲皮素3-O-蕓香糖苷)羥乙基化得到[9]。工業(yè)上生產曲克蘆丁的廢液中仍有較多的羥乙基蘆丁殘留，且該殘留物主要為羥乙基蘆丁混合物，80%以上為三羥乙基蘆丁，同時還含有少量的單羥乙基蘆丁、二羥乙基蘆丁和四羥乙基蘆丁[10]。由于母液中的羥乙基蘆丁不易提取，因此造成生產原料的浪費。從羥乙基蘆丁的結構考慮(圖1)，若能在去除其羥乙基的同時，選用合適的β-糖苷酶去除蕓香糖苷，則能得到高價值的槲皮素，減少資源的浪費。

圖1 本文研究技術路線Fig.1 The reaction route studied in this work

圖2 蘆丁核磁共振鑒定結果Fig.2 Identification of rutin by NMR

將0.5 mmol曲克蘆丁與1.635 g[BMIM]Cl、2 mmol AlCl3在120 ℃及N2保護下進行反應，得到蘆丁粗品，再重結晶提純備用，反應收率為89.26%。產物經13C NMR、1H NMR鑒定為蘆丁(圖2)：13C NMR (101 MHz,DMSO)δ177.41、164.10、161.26、156.65、156.46、148.45、144.78、133.34、121.63、121.22、116.31、115.27、104.01、101.22、100.80、98.71、93.62、76.48、75.94、74.11、71.88、70.60、70.41、70.04、68.28、67.03和17.77;1H NMR (400 MHz,DMSO-d6)δ12.51 (s,1H)、10.75 (s,1H)、9.58 (s,1H)、9.09 (s,1H)、7.46 (d,J=7.5 Hz,2H)、6.76 (d,J=8.7 Hz,1H)、6.30 (d,J=2.0 Hz,1H)、6.11 (d,J=2.0 Hz,1H)、5.26 (d,J=7.3 Hz,1H)、5.20 (d,J=3.7 Hz,1H)、5.02 (d,J=3.2 Hz,1H)、4.99 (d,J=5.7 Hz,1H)、4.44 (d,J=4.8 Hz,1H)、4.36～4.19 (m,3H)、3.62 (d,J=10.4 Hz,1H)、3.18 (ddd,J=20.3,10.1,5.1 Hz,7H)、3.03～2.92 (m,2H)、0.91 (d,J=6.1 Hz,3H)。

蘆丁降解酶(rutin-degrading enzymes,RDEs，ATW 21594.1)是一種專一性酶，可在水溶液中將蘆丁降解為槲皮素和蕓香糖。研究表明，苦蕎中含有天然高活性的蘆丁降解酶[11]。苦蕎中的蘆丁被該酶降解為槲皮素，從而表現(xiàn)出苦味。Zhou等[12]的研究表明，蘆丁降解酶在含有水醇(ROH，R=甲基、乙基、丙基、異丙基和芐基)混合的溶液中也可以得到不同的蕓香糖苷衍生物(R-β-蕓香糖苷)。Jia等[13]從苦蕎中獲取RDE基因序列，成功實現(xiàn)在畢赤酵母中的異源表達，同時證明了蘆丁降解酶中催化關鍵殘基為2個谷氨酸(E171、E182)。

本文擬通過將蘆丁降解酶在畢赤酵母中異源表達，實現(xiàn)蘆丁到槲皮素的高效轉化，以實現(xiàn)羥乙基蘆丁的回收利用。

目前還沒有工業(yè)生產的曲克蘆丁母液回收利用并轉化為槲皮素的報道。本研究將以羥乙基蘆丁為底物，通過化學法去除羥乙基得到蘆丁，同時結合酶法將其轉化為槲皮素(圖1)，以利于生產曲克蘆丁母液的資源回收利用。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

大腸桿菌Top 10，江蘇賽索飛生物科技有限公司；感受態(tài)細胞SMD1168H畢赤酵母(Pichia pastoris)，上海瑞楚生物科技有限公司；質粒抽提試劑盒，天根生化科技(北京)有限公司；DNA純化試劑盒，康為世紀生物科技有限公司；酵母提取物、蛋白胨，Oxiod公司；限制性內切酶、DNA分子量標準、蛋白分子量標準，TaKaRa公司；無氨基酵母氮源(YNB)，北京索萊寶科技有限公司；[BMIM]Cl(1-丁基-3-甲基-咪唑氯鹽)，上海麥克林生化科技股份有限公司；博來霉素(Zecion)，賽默飛世爾科技公司；NaCl、葡萄糖和乙酸鈉等，國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 化學法制備蘆丁

在50 mL Schlenk管中加入0.5 mmol 羥乙基蘆丁、1.635 g[BMIM]Cl(1-丁基-3-甲基-咪唑氯鹽)和2 mmol AlCl3，N2保護下，120 ℃攪拌反應22 h，油浴120 ℃，反應22 h。反應完成后加入水，冷卻過夜，減壓抽濾并用去離子水沖洗濾餅2～3次，干燥后即得蘆丁粗品。取少量粗品于圓底燒瓶中，加熱至110 ℃回流，同時不斷加入乙醇至溶液澄清透明。室溫下靜置一夜，抽濾并自然晾干后即可得到精制的產物。

1.2.2 蘆丁與槲皮素的定量分析方法

配制不同濃度的蘆丁和槲皮素標品溶液，通過高效液相色譜(HPLC)方法檢測。色譜柱為Kromasil C18 (4.6 mm×250 mm,3.5 μm)；流動相為甲醇與水(體積比50∶50)；流速為1 mL/min；采用Waters 2998光電二極管陣列(PDA)檢測器檢測，檢測波長為370 nm；進樣量20 μL；柱溫維持在35 ℃。

1.2.3 密碼子的優(yōu)化與質粒的構建

密碼子優(yōu)化是基因工程中根據生物的密碼子偏好改變同義密碼子以提高基因表達的一種方法。對蘆丁降解酶基因以Pichia pastoris為宿主進行了密碼子優(yōu)化，并選擇穿梭質粒pPICZαA用于畢赤酵母分泌表達外源蛋白。

密碼子優(yōu)化后的RDE基因委托江蘇賽索飛生物科技有限公司合成。以畢赤酵母SMD1168H為表達宿主，參照文獻[14]方法完成載體的構建。構建的質粒參照SMD1168H Chemically Competent Cell(上海瑞楚生物科技有限公司)標準操作步驟，化學轉化至畢赤酵母SMD1168H中。

1.2.4 陽性菌株的鑒定

在平板上挑取單菌落分別加入裝有20 μL Lysis Buffer for Microorganism to Direct PCR的200 μL離心管，于80 ℃金屬浴保溫15 min。所得產物通過PCR得到大量目的片段。上游引物AOX - F：GAATTCATGGCCACTACCAAGTCCAGCTTCATCPCR；下游引物AOX - R：GTCGACGTTAGCCAGGAAGTTCTTGTACCAGTAG。產物通過瓊脂糖凝膠鑒定是否含有目標條帶。

1.2.5 畢赤酵母中RDE的誘導表達

選擇瓊脂糖檢測結果中含有目標條帶的菌落，挑菌至25 mL BMGY 培養(yǎng)基，30 ℃、200 r/min搖床培養(yǎng)16～18 h。培養(yǎng)完成后轉接至100 mL BMMY培養(yǎng)基中，于30 ℃、200 r/min搖床培養(yǎng)，每24 h加入1%純甲醇誘導一次，共誘導4次，同時進行取樣，通過SDS-PAGE檢測蛋白的表達。培養(yǎng)96 h后于4 ℃下離心，11 000 r/min離心10 min，收集上清液作為酶液冷藏備用。

1.2.6 RDE活性鑒定

以化學法重結晶后所得蘆丁作為底物，鑒定RDE的活性。在1.5 mL 離心管中加入60 μL 甲醇溶解的蘆丁溶液(1 mg/mL)，45 μL上清液，195 μL 50 mmol/L乙酸-乙酸鈉緩沖液(pH=4)，混勻后在50 ℃溫育10 min。一個單位的酶活定義為在上述標準條件下催化形成 0.1 nmol 槲皮素所需的酶量。反應完成后加入800 μL甲醇停止反應。反應液通過HPLC檢測有無槲皮素生成。

1.2.7 RDE反應體系的優(yōu)化

1.2.7.1 底物濃度與酶添加量的優(yōu)化

取60 μL不同濃度的蘆丁溶液(反應體系終濃度為1、2、3、4、5和6 mmol/L)，同時改變反應體系中酶的添加量(5%、10%、15%和20%)，加50 mmol/L乙酸-乙酸鈉緩沖液(pH=4)補足體積至300 μL，反應10 min后加入800 μL甲醇終止反應，通過HPLC測定槲皮素的產率。

1.2.7.2 pH對RDE催化活性的影響

選擇不同pH的緩沖液(pH 3.0～8.0),配制反應體系，反應10 min后加入800 μL甲醇終止反應。通過HPLC測定槲皮素的產率。

1.2.7.3 溫度對RDE催化活性的影響

按照RDE活性鑒定的方法配制反應體系，置于25、30、35、40、45、50、55、60、65和70 ℃環(huán)境下進行反應，反應10 min后加入800 μL甲醇終止反應。通過HPLC測定槲皮素的產率。

1.2.8 化學酶法轉化羥乙基蘆丁合成槲皮素

按照體系優(yōu)化的反應條件，以化學法合成的蘆丁為底物，通過RDE合成槲皮素。產物通過HPLC和核磁共振(NMR)來鑒定。

2 結果與討論

2.1 蘆丁的制備與鑒定

2.2 重組大腸桿菌E.coli Top 10、pPICZαA-RDE的構建

2.2.1 重組質粒的構建

質粒pPICZαA含有畢赤酵母表達系統(tǒng)中常用的強啟動子AOX，可通過甲醇誘導來實現(xiàn)嚴格的調控。同時該質粒還含有博來霉素抗性基因(BleoR)，可用于轉化子的篩選。重組后的質粒pPICZαA-RDE圖譜如圖3所示。

圖3 pPICZαA-RDE質粒圖譜Fig.3 Plasmid map of pPICZαA-RDE

2.2.2 重組大腸桿菌的構建與驗證

將上述構建好的重組質粒pPICZαA-RDE 轉化入E.coliTop 10得到含有目的基因的重組菌株。利用上下游引物分別對空質粒pPICZαA、重組質粒pPICZαA-RDE與單菌落E.coliTop 10/pPICZαA-RDE進行PCR，并對擴增后的特異性產物進行核酸膠電泳驗證，結果如圖4所示。由圖4可知，重組菌中存在與目的基因片段大小一致的基因。

1—空質粒pPICZαA;2—pPICZαA-RDE;3—轉入pPICZαA-RDE的E.coli Top 10圖4 核酸凝膠電泳Fig.4 Nucleic acid gel electrophoresis

2.2.3 重組菌株P.pastorisSMD1168H/pPICZαA-RDE的構建與鑒定

培養(yǎng)重組大腸桿菌后提取質粒，并對其線性化、純化和濃縮，通過化學轉化法轉入P.pastorisSMD1168H，于Zeocin抗性的YPD固體平板上培養(yǎng)。再挑取轉化得到的陽性轉化子進行PCR擴增，然后通過1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定目標質粒pPICZαA-RDE是否成功轉入P.pastorisSMD1168H中，結果見圖5。由圖5可知，在挑取的菌落中檢測到1 500 bp的目標條帶(條帶2)，說明重組菌株構建成功。

1—DL2000 DNA Marker；2—PCR產物圖5 PCR擴增產物檢測Fig.5 Detection of PCR amplification product

2.3 畢赤酵母中RDE的表達

選取通過瓊脂糖凝膠鑒定為陽性的菌株，在BMGY和BMMY培養(yǎng)基中培養(yǎng)96 h，每24 h用1%純甲醇誘導，在48、72和96 h時分別取樣，樣品離心后通過SDS-PAGE分析上清液中是否含有目標蛋白，結果見圖6。由圖6可知，6.6×104附近有清晰的目標條帶，表明RDE成功表達。

1—Premixed Protein Marker (Low)；2～4—分別為48、72和96 h取樣的結果圖6 SDS-PAGE分析鑒定RDE表達Fig.6 RDE expression by SDS-PAGE analysis

圖7 槲皮素核磁共振鑒定結果Fig.7 Identification of quercetin by NMR

2.4 RDE活性驗證

由蘆丁、乙酸-乙酸鈉緩沖液和發(fā)酵上清液構成的300 μL反應體系，在50 ℃溫育3 min，反應結束后加入800 μL甲醇終止反應，利用半制備HPLC在370 nm檢測波長下檢測并收集反應液。產物通過13C NMR、1H NMR鑒定為槲皮素(圖7)：13C NMR (101 MHz,DMSO)δ176.30、164.34、161.18、156.60、148.16、147.26、145.51、136.19、122.42、120.44、116.07、115.53、103.48、98.64和93.81;1H NMR(400 MHz,DMSO-d6)δ12.39 (s,1H)、10.67 (s,1H)、9.48 (s,1H)、9.22 (d,J=18.6 Hz,2H)、7.58 (d,J=2.2 Hz,1H),7.44 (dd,J=8.5,2.2 Hz,1H),6.79 (d,J=8.5 Hz,1H)、6.31 (d,J=2.0 Hz,1H)、6.09 (d,J=2.0 Hz,1H)。這表明重組菌株P.pastorisSMD1168H能夠實現(xiàn)胞外表達RDE，轉化蘆丁生成槲皮素，轉化率為32.63%。在該條件下，酶活為522.08 U/mL。

2.5 RDE 反應體系優(yōu)化結果

2.5.1 底物濃度與酶添加量的優(yōu)化

改變反應體系的底物濃度與酶添加比例，通過HPLC測定槲皮素產率，比較不同底物濃度與酶添加比例對槲皮素產率的影響，結果如圖8所示。由圖8可知：隨著底物濃度的增加，槲皮素產率呈下降趨勢；酶的添加比例為15%(體積分數(shù))時整體產率相對較高。綜合考慮兩因素對產率的影響，采用2 mmol/L底物濃度與15%酶添加比例進行后續(xù)實驗。

圖8 不同底物濃度與酶比例對槲皮素產率的影響Fig.8 Effects of different substrate concentrations and enzyme ratios on quercetin yield

2.5.2 不同pH對產率的影響

考察不同pH下RDE催化蘆丁反應的產率，結果如圖9所示。由圖9可知：當反應的pH為4.0～6.0時，RDE呈現(xiàn)較好的催化活性，但當pH超過6.0時，產物產率快速下降?？梢?，在pH為5.0時，RDE反應產率最高，達49.15%。

圖9 pH對RDE催化蘆丁轉化為槲皮素反應體系的影響Fig.9 Effect of pH on RDE catalyzed conversion of rutin to quercetin

2.5.3 不同溫度對產率的影響

考察不同溫度下RDE催化蘆丁反應的產率，結果如圖10所示。由圖10可知：在25～55 ℃條件下，RDE都呈現(xiàn)催化活性，但當溫度超過55 ℃時，產物產率快速下降，而且當溫度達70 ℃時RDE產量極低?？梢姡敺磻獪囟葹?5 ℃時，RDE的反應產率最高，達到53.96%。

圖10 溫度對RDE催化蘆丁轉化為槲皮素反應體系的影響Fig.10 Effect of temperature on the reaction system of rutin to Quercetin catalyzed by RDE

2.6 化學酶法轉化羥乙基蘆丁合成槲皮素

以化學法得到的蘆丁作為酶反應的底物，在優(yōu)化后的條件下(溫度為55 ℃、pH=5.0)進行脫糖苷的反應，產物通過HPLC檢測，結果如圖11所示。由圖11數(shù)據測算，化學-酶法總轉化率為47.17%。

圖11 HPLC檢測RDE催化蘆丁結果Fig.11 Results of RDE catalyzed rutin by HPLC

3 結論

以羥乙基蘆丁為原料，利用化學法合成了槲皮素，收率為89.26%。以質粒pPICZαA為載體，實現(xiàn)了蘆丁降解酶在畢赤酵母SMD1168H中的異源表達。通過對底物濃度、酶添加量、反應pH與溫度的優(yōu)化，蘆丁降解酶轉化蘆丁合成槲皮素的產率為53.96%。最終實現(xiàn)了化學-酶法轉化羥乙基蘆丁合成槲皮素，總轉化率為47.17%。