龔雨 馬零 趙春光 徐慶陽

摘要：為實(shí)現(xiàn)L-酪氨酸的大規(guī)模生產(chǎn)，提高L-酪氨酸的產(chǎn)量和糖酸轉(zhuǎn)化率，供試菌株為大腸桿菌TYR-05，通過單因素實(shí)驗(yàn)、正交實(shí)驗(yàn)、流加發(fā)酵優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，以菌體密度、L-酪氨酸產(chǎn)量、糖酸轉(zhuǎn)化率及代謝副產(chǎn)物為指標(biāo)，探究MgSO4·7H2O、磷酸二氫鉀、谷氨酰胺、甲硫氨酸、維生素B12、維生素H、磷酸吡哆醛對(duì)L-酪氨酸發(fā)酵的影響，最后確定適合L-酪氨酸發(fā)酵的培養(yǎng)基為MgSO4·7H2O 2.0 g/L、KH2PO4 2.5 g/L、維生素B12 2.0×10-3 g/L、PLP 1.0×10-3 g/L、維生素H 0.8×10-3 g/L，利用5 L發(fā)酵罐進(jìn)行流加發(fā)酵生產(chǎn)，在初始發(fā)酵工藝的基礎(chǔ)上，采用從10 h持續(xù)流加發(fā)酵的優(yōu)化策略。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，最高菌體密度達(dá)到65.0 g/L，L-酪氨酸產(chǎn)量為56.2 g/L，糖酸轉(zhuǎn)化率為23.1%，乙酸作為副產(chǎn)物積累量減少到1.0 g/L，驗(yàn)證了L-酪氨酸高密度流加發(fā)酵策略的可行性，為L(zhǎng)-酪氨酸及其他芳香族氨基酸的低成本、高效率工業(yè)化生產(chǎn)提供了一定的依據(jù)。

關(guān)鍵詞：L-酪氨酸；高密度發(fā)酵；大腸桿菌；發(fā)酵優(yōu)化；連續(xù)流加發(fā)酵

中圖分類號(hào)：TS205.5文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1000-9973（2023）10-0122-06

Study on High-Density Fed-Batch Fermentation Process of L-Tyrosine

GONG Yu1， MA Ling1， ZHAO Chun-guang2， XU Qing-yang1，3，4*

（1.College of Bioengineering， Tianjin University of Science and Technology， Tianjin 300457， China; 2.Ningxia Eppen Biotechnology Co.， Ltd.， Yinchuan 750100， China; 3.National and Local United Engineering Laboratory of Metabolic Control Fermentation Technology， Tianjin 300457， China; 4.Tianjin Engineering Laboratory of Efficient and Green Amino Acid Manufacture， Tianjin 300457， China）

Abstract： In order to realize the large-scale production of L-tyrosine and improve the yield of L-tyrosine and the conversion rate of glucose and acid， with Escherichia coli TYR-05 as the test strain， the effects of MgSO4·7H2O， potassium dihydrogen phosphate， glutamine， methionine， vitamin B12， vitamin H and pyridoxal phosphate on L-tyrosine fermentation are investigated by single factor experiment， orthogonal experiment and fed-batch fermentation optimization experiment with bacterial cell density， L-tyrosine yield， glucose-acid conversion rate and metabolic by-products as the indexes. Finally， the medium suitable for L-tyrosine fermentation is determined to be MgSO4·7H2O 2.0 g/L， KH2PO4 2.5 g/L， vitamin B12 2.0×10-3 g/L， PLP 1.0×10-3 g/L， vitamin H 0.8×10-3 g/L. Fed-batch fermentation production is carried out with a 5 L fermenter. On the basis of the initial fermentation process， the optimal fermentation strategy of continuous fed-batch fermentation from10 h is adopted. The experimental results show that the maximum cell density reaches 65.0 g/L， the L-tyrosine yield is 56.2 g/L， the glucose-acid conversion rate is 23.1%， and the accumulation amount of acetic acid as by-product is reduced to 1.0 g/L， which has verified the feasibility of L-tyrosine high-density fed-batch fermentation strategy， and provided a basis for low-cost and high-efficiency industrial production of L-tyrosine and other aromatic amino acids.

Key words： L-tyrosine; high-density fermentation; Escherichia coli; fermentation optimization; continuous fed-batch fermentation

L-酪氨酸（L-tyrosine，L-Tyr）是一種芳香族氨基酸[1]，是人體必需氨基酸之一，對(duì)人體和動(dòng)物的生長(zhǎng)代謝都具有重要作用，有著廣泛的市場(chǎng)需求[2]，在食品行業(yè)中，因其具有極高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，被用作氨基酸類營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充劑添加到食品中[3]，L-酪氨酸及其衍生物還是許多保健品的重要成分[4]；在醫(yī)藥方面，L-酪氨酸的衍生物廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥載體，比如多巴胺是抗氧化藥物合成的前體物質(zhì)，用于多種類型休克藥物的合成研究[5]，L-酪氨酸亞硫酸鹽合成的藥物能治療無力綜合征、精神分裂癥等疾病；在化工方面，能夠降低黑色素的合成[6]，是天然美白化妝品的合成原料。

當(dāng)前L-酪氨酸生產(chǎn)主要以微生物發(fā)酵法為主，該方法具有成本低、無污染等生產(chǎn)優(yōu)勢(shì)，但其大量生產(chǎn)仍面臨著巨大挑戰(zhàn)[7]。在微生物大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)過程中，菌體密度在一定程度上決定了目標(biāo)產(chǎn)物的生成量[8]，因此高密度培養(yǎng)無疑是提高產(chǎn)量的重要途徑之一，其中培養(yǎng)基成分、發(fā)酵條件的控制等是至關(guān)重要的影響因素[9]。在大腸桿菌代謝途徑中L-酪氨酸合成的前體是磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）和4-磷酸赤蘚糖[8]，磷酸烯醇式丙酮酸還是芳香族氨基酸合成的前體物質(zhì)[10-11]，Mg2+是糖酵解途徑中的能量傳遞者NADH合成過程的輔因子，是其合成的激活劑[12]。維生素H可以促進(jìn)菌體生長(zhǎng)，但過量會(huì)造成菌體生長(zhǎng)過快進(jìn)入衰亡期，過少又會(huì)導(dǎo)致生長(zhǎng)過慢的問題[13]；磷酸二氫大腸桿菌合成細(xì)胞膜磷脂提供了主要成分磷，還參與了大腸桿菌的生長(zhǎng)代謝，控制其生長(zhǎng)速率[14-15]，直接影響了大腸桿菌的生長(zhǎng)密度和重組蛋白的表達(dá)量[12]，磷酸吡哆醛（PLP）廣泛存在于細(xì)胞中，參與了脫羧反應(yīng)、氨基轉(zhuǎn)移、消除反應(yīng)[16]；在代謝過程中，維生素B12是許多酶的輔酶，參與了甲基化和化合物異構(gòu)作用，對(duì)DNA和蛋白質(zhì)的合成及細(xì)胞的生長(zhǎng)也有著重要作用[17]；甲硫氨酸能增大蛋白的可溶性表達(dá)量，減少包涵體蛋白的形成，使后續(xù)純化工藝更簡(jiǎn)便[18]；谷氨酰胺在細(xì)胞中充當(dāng)?shù)妮d體，還作為蛋白質(zhì)合成的調(diào)節(jié)物，對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)具有重要作用[19]。

為促進(jìn)高密度發(fā)酵過程中微生物細(xì)胞更好地生長(zhǎng)，避免營(yíng)養(yǎng)不足或浪費(fèi)等問題，本研究對(duì)L-酪氨酸發(fā)酵過程中的生長(zhǎng)因子進(jìn)行優(yōu)化，并且設(shè)計(jì)了3種不同的底物添加方式進(jìn)行上罐生產(chǎn)，大幅度提高了菌體最高密度及L-酪氨酸產(chǎn)量。

1 材料與方法

1.1 菌種

本實(shí)驗(yàn)的供試菌株為大腸桿菌 TYR-05，保藏于天津科技大學(xué)代謝工程研究室。

1.2 培養(yǎng)基

1.2.1 活化培養(yǎng)基

葡萄糖25 g/L，酵母粉6 g/L，檸檬酸1 g/L，（NH4）2SO4·7H2O 2.4 mg/L，MgSO4·7H2O 0.4 g/L，谷氨酸 0.6 g/L，蛋氨酸0.5 g/L。

1.2.2 發(fā)酵培養(yǎng)基

葡萄糖25 g/L，酵母粉4.5 g/L，檸檬酸1.5 g/L，（NH4）2SO4·7H2O 2.8 mg/L，維生素H 0～2 mg/L；MgSO4·7H2O 0～3 g/L，KH2PO4 0～3 g/L；PLP 0～3 mg/L；維生素B12 0～3 mg/L。

1.3 儀器與設(shè)備

Biotech-15JS-3發(fā)酵罐 上海保興生物工程設(shè)備有限公司；Aglient 1290高效液相色譜儀 美國(guó)安捷倫科技公司；SBA-40D生物傳感分析儀 山東佰森泰克儀器有限公司；752PC紫外可見分光光度計(jì) 上海洪紀(jì)儀器設(shè)備有限公司。

1.4 培養(yǎng)方案

1.4.1 菌種活化

于－80 ℃冰箱中取出甘油管，使用接種環(huán)蘸取4環(huán)菌液涂抹于一代斜面上，37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)12 h，第2天再?gòu)囊淮泵娼臃N到二代斜面，繼續(xù)37 ℃培養(yǎng)10～12 h。

1.4.2 搖瓶培養(yǎng)

以培養(yǎng)基總體積的10%為接種量置于搖瓶中，調(diào)節(jié)pH為7.0～7.2，溫度37 ℃，220 r/min培養(yǎng)45 h（2%苯酚紅作為指示劑，補(bǔ)加氨水調(diào)節(jié)pH）。

1.4.3 5 L發(fā)酵罐培養(yǎng)

1.4.3.1 發(fā)酵菌種活化

于－80 ℃冰箱中取出甘油管，使用接種環(huán)蘸取4環(huán)菌液涂抹于一代斜面上，于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h，第2天再?gòu)囊淮泵娼臃N到二代斜面，繼續(xù)于37 ℃培養(yǎng)10～12 h。

1.4.3.2 發(fā)酵罐種子培養(yǎng)

使用200 mL無菌水在超凈臺(tái)火焰旁洗脫茄形瓶中的菌體，在火焰旁從發(fā)酵罐進(jìn)料口倒入種子培養(yǎng)基中。發(fā)酵過程中通過發(fā)酵罐參數(shù)將溫度控制在37 ℃，pH控制在7.0～7.2，溶氧控制在45%～55%，生物量>18時(shí)接入發(fā)酵培養(yǎng)基，進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)。

1.5 方法

1.5.1 生長(zhǎng)因子添加量?jī)?yōu)化單因素實(shí)驗(yàn)

在保證培養(yǎng)基等其他條件不變的前提下，按照表1中7種不同種類的生長(zhǎng)因子，設(shè)計(jì)5組不同濃度梯度進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果取平均值。

1.5.2 正交實(shí)驗(yàn)確定生長(zhǎng)因子的最適添加量

在實(shí)驗(yàn)2.1和2.2的基礎(chǔ)上，綜合菌體密度和產(chǎn)量考慮，各生長(zhǎng)因子的影響順序?yàn)镵H2PO4添加量>維生素H添加量>MgSO4·7H2O添加量>維生素B12添加量>PLP添加量，其中甲硫氨酸和谷氨酰胺的影響非常小。因此本實(shí)驗(yàn)在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以KH2PO4添加量（A）、PLP添加量（B）、維生素B12添加量（C）、維生素H添加量（D）和MgSO4·7H2O添加量（E）為研究對(duì)象，以菌體密度、L-酪氨酸產(chǎn)量為指標(biāo)，進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步分析，正交實(shí)驗(yàn)因素水平表見表2。

1.5.3 生長(zhǎng)因子添加方式的測(cè)定

由2.4可知，在優(yōu)化添加量的基礎(chǔ)上，為了進(jìn)一步達(dá)到實(shí)驗(yàn)預(yù)期，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)了3種生長(zhǎng)因子添加方式，即一次性添加（a）、分時(shí)間段（10，15，20，25 h）添加（b）和10 h后持續(xù)流加（c）。3種添加方式添加總量一致 。

2 結(jié)果分析

2.1 生長(zhǎng)因子添加種類及添加量對(duì)菌體密度的影響

由圖1可知，不同生長(zhǎng)因子對(duì)菌體生長(zhǎng)有較大影響，其中KH2PO4和維生素H對(duì)菌體密度的影響較大，當(dāng)KH2PO4添加量為2.5 g/L時(shí)，菌體密度值達(dá)到34.1 g/L，當(dāng)維生素H添加量為1.0 mg/L時(shí)，菌體密度最高，為30.2 g/L；二者差距較小，并且均高于其他5種生長(zhǎng)因子對(duì)應(yīng)的菌體密度。菌體的生長(zhǎng)及基因的表達(dá)很大程度上取決于磷酸鹽的含量[20]，細(xì)胞中磷酸鹽的含量對(duì)大腸桿菌中質(zhì)粒表達(dá)及復(fù)制的速率有一定影響，因而決定了菌體的蛋白表達(dá)量[9]；磷酸鹽是大腸桿菌合成細(xì)胞膜磷脂的主要成分，對(duì)菌體的生長(zhǎng)有很大影響；它對(duì)代謝流分布有主要影響，控制著EMP途徑中L-酪氨酸合成的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)，PEP（磷酸烯醇式丙酮酸）和E4P（4-磷酸赤蘚糖）以及PRPP（磷酸核糖焦磷酸）是L-酪氨酸的合成原料[21]，決定了EMP途徑的碳流量，因此磷元素是大腸桿菌生產(chǎn)L-酪氨酸不可或缺的成分之一，當(dāng)過量添加時(shí)，會(huì)使代謝流中前體物的供給達(dá)到一種失衡的狀態(tài)，無法達(dá)到平衡點(diǎn)，進(jìn)而使菌體密度降低[21]；生物素參與了脂肪酸生物合成、氨基酸代謝和糖異生三大代謝過程[12]，參與了脫羧、羧化、脫氫化等反應(yīng)[12]，是乙酰CoA羧化酶等的輔酶，還參與了CO2的固定作用，因此隨著添加量的增加，菌體密度逐漸變大，但當(dāng)菌體密度達(dá)到最高值30.2 g/L后呈下降趨勢(shì)，分析得到添加量過高會(huì)導(dǎo)致菌體代謝過快而過早衰老，進(jìn)而導(dǎo)致菌體密度下降。

2.2 生長(zhǎng)因子添加種類及添加量對(duì)L-酪氨酸產(chǎn)量的影響

由圖2可知，7種生長(zhǎng)因子對(duì)L-酪氨酸產(chǎn)量有顯著的影響。其中維生素B12、MgSO4·7H2O和PLP的影響較大，Mg2+是EMP途徑中關(guān)鍵酶的輔酶，還參與了甘油酸-3-磷酸和甘油酸-2-磷酸之間磷酸基團(tuán)的轉(zhuǎn)移過程[22]，為原料磷酸烯醇式丙酮酸的生成打下了基礎(chǔ)；磷酸吡哆醛促進(jìn)了谷氨酸向谷氨酰胺的轉(zhuǎn)化[22]，而L-酪氨酸是由前體物質(zhì)HPP（對(duì)羥基苯丙酮酸）與谷氨酸的轉(zhuǎn)氨作用生成的，PLP為其生產(chǎn)提供了動(dòng)力[23]；維生素B12存在兩種活化形式，不僅參與了核苷酸與脫氧核苷酸的相互轉(zhuǎn)化，還參與了甲基的轉(zhuǎn)移[22]；當(dāng)谷氨酰胺的添加量≤2 g/L時(shí)，L-酪氨酸的產(chǎn)量與谷氨酰胺的添加量呈正相關(guān)，當(dāng)谷氨酰胺添加量為2 g/L時(shí)，L-酪氨酸產(chǎn)量達(dá)到11.20 g/L，當(dāng)谷氨酰胺添加量＞2 g/L時(shí)，L-酪氨酸產(chǎn)量呈下降趨勢(shì)，維生素H的效果類似；隨著KH2PO4 添加量的增加，L-酪氨酸產(chǎn)量一直增大，并未像菌體密度呈先增后減的趨勢(shì)，分析出KH2PO4對(duì)產(chǎn)量只呈促進(jìn)作用，甲硫氨酸的效果類似，分析原因?yàn)榧琢虬彼崮軠p少包涵體的生成，提升質(zhì)粒的表達(dá)效果[18]。

2.3 正交分析探究關(guān)鍵元素的最適用量

實(shí)驗(yàn)得出KH2PO4、維生素H、MgSO4·7H2O、維生素B12、PLP對(duì) L-酪氨酸發(fā)酵過程產(chǎn)生了較大影響，因此繼續(xù)優(yōu)化5種物質(zhì)的用量。

由表3中極差值的大小可以得出影響L-酪氨酸生物量的5個(gè)因素依次為A＞D=E＞C＞B；通過比較5個(gè)因素的4個(gè)均值，即最大均值對(duì)應(yīng)最適添加量，得到KH2PO4的最適添加量為2.5 g/L；維生素H的最適添加量為1.0 mg/L；MgSO4·7H2O的最適添加量為2.0 g/L；PLP的最適添加量為1.0 mg/L；維生素B12的最適添加量為2.0 mg/L。

由表4中極差值的大小可以得出影響L-酪氨酸產(chǎn)量的5個(gè)因素依次為B＞C＞A＞D=E；通過比較5個(gè)因素的4個(gè)均值，即最大均值對(duì)應(yīng)最適添加量，得到KH2PO4的最適添加量為2.4 g/L；維生素H的最適添加量為0.8 mg/L；MgSO4·7H2O的最適添加量為1.5 g/L；PLP的最適添加量為1.8 mg/L；維生素B12的最適添加量為2.0 mg/L。

綜合來看，維生素H和MgSO4·7H2O的添加量對(duì)產(chǎn)量的影響較大，其他3個(gè)因素對(duì)生物量的影響較大，因此確定維生素H的最適添加量為0.8 mg/L；MgSO4·7H2O的最適添加量為2.0 g/L；KH2PO4的最適添加量為2.5 g/L；PLP的最適添加量為1.0 mg/L；維生素B12的最適添加量為2.0 mg/L。

2.4 5 L發(fā)酵罐驗(yàn)證

前期實(shí)驗(yàn)以L-酪氨酸的菌體密度和產(chǎn)量為指標(biāo)，探究了7個(gè)生長(zhǎng)因子對(duì)L-酪氨酸發(fā)酵的影響，最后確定了效果較好的5個(gè)生長(zhǎng)因子的添加量，并通過正交實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步對(duì)添加量進(jìn)行了篩選優(yōu)化。但搖瓶實(shí)驗(yàn)具有一定的局限性，導(dǎo)致菌體的生長(zhǎng)潛力大大受限，因此在其他培養(yǎng)基成分及培養(yǎng)條件一致的條件下，進(jìn)行5 L發(fā)酵罐對(duì)比驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，以不添加生長(zhǎng)因子的培養(yǎng)基作為對(duì)照組，以KH2PO4、維生素H、MgSO4·7H2O、維生素B12、PLP分別添加2.5 g/L、0.8 mg/L、2.0 g/L、2.0 mg/L、1.0 mg/L為實(shí)驗(yàn)組，進(jìn)一步探究生長(zhǎng)因子及添加量的優(yōu)化效果。

由圖3可知，優(yōu)化后實(shí)驗(yàn)組的菌體密度和L-酪氨酸產(chǎn)量在發(fā)酵期間始終高于對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組最大菌體密度為63.2 g/L，高于對(duì)照組的菌體密度56.7 g/L，發(fā)酵過程中菌體密度一直處于上升趨勢(shì)，但發(fā)酵后期菌體生長(zhǎng)達(dá)到穩(wěn)定期，所以增長(zhǎng)較慢，趨于穩(wěn)定。當(dāng)不添加生長(zhǎng)因子時(shí)，L-酪氨酸產(chǎn)量明顯偏低，增長(zhǎng)趨勢(shì)較平穩(wěn)，且最終產(chǎn)量為49.8 g/L。發(fā)酵中期（20～36 h）是L-酪氨酸積累速率最大的時(shí)期，且與菌體密度增長(zhǎng)趨勢(shì)相近，當(dāng)發(fā)酵時(shí)間達(dá)到36 h之后，L-酪氨酸積累較緩慢，最后44 h下罐時(shí)L-酪氨酸產(chǎn)量為53.1 g/L，較對(duì)照組提高了6.6%。

2.5 不同生長(zhǎng)因子添加方式對(duì)L-酪氨酸發(fā)酵的影響

在發(fā)酵過程前期，菌體密度可通過發(fā)酵條件進(jìn)行控制，進(jìn)而縮短發(fā)酵周期，若生長(zhǎng)因子添加時(shí)間過晚，會(huì)造成營(yíng)養(yǎng)不足，導(dǎo)致菌體生長(zhǎng)緩慢，發(fā)酵產(chǎn)酸水平較低，最后導(dǎo)致產(chǎn)量下降。因此，生長(zhǎng)因子的添加方式對(duì)L-酪氨酸生物量及產(chǎn)量也具有一定影響。適合的添加方式對(duì)L-酪氨酸發(fā)酵至關(guān)重要。

2.5.1 不同添加方式對(duì)產(chǎn)量和糖酸轉(zhuǎn)化率的影響

由圖4可知，發(fā)酵過程中具體時(shí)間監(jiān)測(cè)到的糖酸轉(zhuǎn)化率為實(shí)時(shí)糖酸轉(zhuǎn)化率，因此能夠通過數(shù)據(jù)呈現(xiàn)的轉(zhuǎn)化率的變化曲線得出發(fā)酵過程中轉(zhuǎn)化率最高的時(shí)期，如果設(shè)法延長(zhǎng)這一時(shí)期，那么L-酪氨酸產(chǎn)量將會(huì)大大提高。a添加方式為一次性添加全部生長(zhǎng)因子，因此發(fā)酵前期營(yíng)養(yǎng)豐富，菌體能充分利用營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)加速地進(jìn)行菌體生長(zhǎng)及L-酪氨酸的合成，糖酸轉(zhuǎn)化率也較高，菌體生長(zhǎng)前期8 h時(shí)糖酸轉(zhuǎn)化率最高，8～20 h時(shí)菌體產(chǎn)酸速率逐漸降低，20～30 h產(chǎn)酸速率呈上升趨勢(shì)，30 h之后產(chǎn)酸速率較低，分析可能是生長(zhǎng)因子前期利用充足但中后期供應(yīng)不夠，不足以維持菌體正常的生長(zhǎng)。添加方式b為分時(shí)間段（10，15，20，25 h）添加生長(zhǎng)因子，可明顯看出前期0～10 h未添加生長(zhǎng)因子時(shí)期L-酪氨酸產(chǎn)率較低，而添加生長(zhǎng)因子的10～30 h內(nèi)菌體大量生產(chǎn)L-酪氨酸，30 h后產(chǎn)酸率大大下降，最終L-酪氨酸產(chǎn)量為50.3 g/L，分析原因?yàn)榍捌诰w生長(zhǎng)時(shí)期營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)不足，導(dǎo)致菌體生長(zhǎng)受到抑制，進(jìn)而無法較好地進(jìn)行L-酪氨酸生產(chǎn)，中期添加生長(zhǎng)因子后這一問題有所緩解但最終產(chǎn)量低于a添加方式。添加方式c為發(fā)酵8 h后持續(xù)流加，能夠看出前期菌體生長(zhǎng)速率較快，8 h時(shí)出現(xiàn)第一次轉(zhuǎn)化率高峰，分析原因是前期營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)較充足，8～35 h生產(chǎn)較穩(wěn)定，36 h后糖酸轉(zhuǎn)化率再次達(dá)到高峰，糖酸轉(zhuǎn)化率達(dá)到一個(gè)較平穩(wěn)的水平，最終產(chǎn)量為56.1 g/L，糖酸轉(zhuǎn)化率達(dá)到23.2%，分析可得整個(gè)發(fā)酵過程中生長(zhǎng)因子都處于一個(gè)相對(duì)穩(wěn)定的水平，使菌體較好地吸收生長(zhǎng)所需的各種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，因此使L-酪氨酸發(fā)酵水平達(dá)到最高，較其他兩種添加方式有明顯優(yōu)勢(shì)。

2.5.2 不同添加方式對(duì)生物量和耗糖速率的影響

由圖5可知，菌體密度和耗糖速率由大到小的順序都為c＞b＞a，c組最大菌體密度為65.0 g/L，c組在24 h時(shí)耗糖速率最大，為12.3 g/（h·L），而a組和b組最大耗糖速率出現(xiàn)在16 h，分別為10.1，11.2 g/（h·L），較c組早出現(xiàn)了4 h，并且可明顯看出c組在36 h之后菌體密度開始緩慢增長(zhǎng)，而a組和b組在28 h之后菌體密度便開始出現(xiàn)緩慢增長(zhǎng)的趨勢(shì)，菌體活性明顯下降，最終a組和b組的菌體密度分別為53.1，56.0 g/L，遠(yuǎn)低于c組，因此添加方式c明顯優(yōu)于另外兩種添加方式。

2.5.3 不同添加方式對(duì)副產(chǎn)物的影響

重組大腸桿菌高密度發(fā)酵過程中，很容易出現(xiàn)代謝副產(chǎn)物，其中乙酸最常見，它對(duì)蛋白的表達(dá)影響較大，研究表明，當(dāng)菌體的生長(zhǎng)速率達(dá)到一定值時(shí)，菌體密度達(dá)到最大值后攝氧能力不再繼續(xù)增強(qiáng)，進(jìn)而導(dǎo)致乙酸的生成[24]，方式b乙酸最終含量為1.9 g/L，分別比方式a和方式c增加了18.7%和60%，分析方式b會(huì)造成菌體過快衰老，菌體攝氧不足導(dǎo)致副產(chǎn)物乙酸含量較高，還會(huì)造成原料的浪費(fèi)。限制比生長(zhǎng)速率是減少乙酸生成的方法之一。綜合來看，方式c中副產(chǎn)物組氨酸（His）等均少于另外兩種添加方式，因此方式c有較大優(yōu)勢(shì)。

3 結(jié)論

培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)成分和發(fā)酵條件控制是大腸桿菌高密度發(fā)酵的兩個(gè)關(guān)鍵因素，實(shí)驗(yàn)中選用5個(gè)生長(zhǎng)因子并對(duì)其添加量及添加方式進(jìn)行了探索，實(shí)驗(yàn)表明5個(gè)生長(zhǎng)因子的最優(yōu)添加量為維生素H 0.8 mg/L，MgSO4·7H2O 2.0 g/L，KH2PO4 2.5 g/L，PLP 1.0 mg/L，維生素 B12 2.0 mg/L，最優(yōu)添加策略為10 h開始持續(xù)流加。最終L-酪氨酸產(chǎn)量為56.2 g/L，最高菌體密度為65.0 g/L，糖酸轉(zhuǎn)化率為23.1%，副產(chǎn)物乙酸積累量減少到1.0 g/L，證明了生長(zhǎng)因子的添加使菌體活性大大增強(qiáng)，強(qiáng)化了L-酪氨酸生產(chǎn)的通路代謝，L-酪氨酸產(chǎn)量明顯提高，使大腸桿菌生產(chǎn)L-酪氨酸的高密度培養(yǎng)達(dá)到一個(gè)較高的水平，也為L(zhǎng)-酪氨酸發(fā)酵生產(chǎn)中各種生長(zhǎng)因子的調(diào)控提供了依據(jù)[25]。

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