曹燕燕,葛昌斌,廖平安,崔江寬,黃 杰,郭春強(qiáng),王 君,盧雯瑩

(1.漯河市農(nóng)業(yè)科學(xué)院,河南漯河 462300; 2.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院,河南鄭州 450002)

目前全球氣候逐漸變暖,促使小麥幼穗分化進(jìn)程加快,拔節(jié)期提前,進(jìn)而導(dǎo)致春季低溫(倒春寒)來(lái)臨時(shí)小麥更易受到凍害。同時(shí)隨著倒春寒天氣發(fā)生頻率和強(qiáng)度增加,也嚴(yán)重影響了小麥的產(chǎn)量和品質(zhì)。因此,倒春寒已成為限制小麥高產(chǎn)的主要?dú)庀鬄?zāi)害之一。

黃淮麥區(qū)作為中國(guó)小麥主產(chǎn)區(qū)之一,每年小麥播種面積和產(chǎn)量約占全國(guó)小麥播種總面積和產(chǎn)量的58%和67%[1]。目前倒春寒已成為該地區(qū)重要的農(nóng)業(yè)氣象災(zāi)害之一,主要發(fā)生在春季3月下旬至4月上中旬,此時(shí)小麥正處于拔節(jié)至開(kāi)花期,幼穗分化正處于雌雄蕊分化期至四分體時(shí)期,處于低溫敏感期[2],連續(xù)3 d以上的低溫就會(huì)對(duì)小麥造成巨大的傷害。2004-2005年黃淮麥區(qū)發(fā)生了大規(guī)模的倒春寒,其中僅河南省的受災(zāi)面積就超過(guò)1.33×106hm2,絕收面積高達(dá)2.67×105hm2左右[3];2009年再次遭遇倒春寒,使該地區(qū)小麥大面積減產(chǎn),損失嚴(yán)重[4];2012-2013年,黃淮麥區(qū)遭受60年一遇的特重倒春寒,僅3月下旬到4月下旬就發(fā)生了10次,受災(zāi)面積達(dá)總播種面積的41.8%[1]。倒春寒的頻繁發(fā)生、不規(guī)律性和不可控性,加上災(zāi)前預(yù)防不及時(shí),災(zāi)后補(bǔ)救措施難實(shí)施,都會(huì)對(duì)小麥產(chǎn)量造成巨大的損失[5],因此倒春寒已成為黃淮麥區(qū)小麥生產(chǎn)中急需解決的關(guān)鍵問(wèn)題。開(kāi)展倒春寒對(duì)小麥品種生長(zhǎng)發(fā)育及其產(chǎn)量形成的影響研究,為提高小麥抗寒性提供理論和技術(shù)支撐,并對(duì)保障黃淮麥區(qū)小麥的高產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)具有重要的理論和實(shí)踐意義。

小麥抗寒性是由多個(gè)因素共同作用的的結(jié)果,是一個(gè)復(fù)雜的生物性狀[6]。研究表明,小麥的抗寒性與葉綠素含量、抗氧化酶活性、丙二醛含量、可溶性蛋白含量[1,7-11]等密切相關(guān)。小麥在受到低溫脅迫時(shí),體內(nèi)會(huì)發(fā)生一系列適應(yīng)低溫的生理生化變化,這也是植物抗寒能力最基本的反映,同時(shí)低溫會(huì)誘導(dǎo)小麥體內(nèi)抗寒相關(guān)基因的表達(dá)。小麥抗寒性是由多個(gè)微效基因控制,目前,在小麥苗期低溫馴化過(guò)程中已分離鑒定出超過(guò)450個(gè)抗寒基因,但春季低溫下的表達(dá)情況研究較少[12]。

為深入研究小麥響應(yīng)倒春寒的生理生化及抗寒基因的表達(dá)情況,本研究選取在田間春季拔節(jié)期抗寒性表現(xiàn)較好的小麥品種漯麥163及其母本漯麥6010為研究對(duì)象,于拔節(jié)期在人工智能低溫室進(jìn)行低溫脅迫,分析低溫脅迫對(duì)小麥體內(nèi)葉綠素、脯氨酸含量、超氧化物歧化酶(SOD)活性以及抗寒相關(guān)基因(SOD、WCS120、LEA和P5CS)表達(dá)量的影響,以期為小麥品種抗寒性評(píng)價(jià)方法的建立以及抗寒性遺傳改良提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試小麥材料為國(guó)審品種漯麥163及其母本漯麥6010,均為弱春性品種,由漯河市農(nóng)業(yè)科學(xué)院提供。

1.2 試驗(yàn)方法

試驗(yàn)于2020-2021年在漯河市農(nóng)業(yè)科學(xué)院試驗(yàn)基地采用盆栽法進(jìn)行。用內(nèi)徑30 cm、高60 cm的無(wú)底花盆,花盆底部用網(wǎng)袋扎緊,表面與地表持平?；ㄅ鑳?nèi)根據(jù)大田0～20 cm、20～40 cm、40～60 cm土層分層填土壓實(shí),澆透水沉實(shí)土壤后于10月18日播種,每個(gè)品種種植12盆,其中9盆用于低溫脅迫處理,用于取樣;其余3盆進(jìn)行常溫處理,作為對(duì)照,共計(jì)24盆。于3葉期進(jìn)行定苗,每盆留苗10株。根據(jù)土壤墑情決定澆水量,每盆澆水量一致。

1.2.1 低溫脅迫處理

于拔節(jié)期,將18盆小麥(每個(gè)品種9盆)移入人工智能低溫室進(jìn)行低溫(-5 ℃)脅迫處理,分別于低溫處理1 d、2 d和3 d時(shí)取主莖最上部展開(kāi)葉,用于生理生化指標(biāo)測(cè)定和抗寒基因表達(dá)分析。每個(gè)品種取3盆,3次重復(fù),以常溫處理為對(duì)照。

1.2.2 生理生化指標(biāo)的測(cè)定

葉綠素、脯氨酸含量以及SOD活性的測(cè)定均利用酶聯(lián)免疫分析(ELISA)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.2.3 抗寒基因的表達(dá)模式分析

用RNA提取試劑盒提取小麥葉片總RNA,用Prime Script RT reagent Kit with gDNA Eraser(TaKaRa,大連)將總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA第一鏈。用Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)引物,由上海派森諾基因科技有限公司合成(表1)。以小麥Actin為內(nèi)參基因,以cDNA為模板,在CFX96 Real Time PCR Detection System(Bio-Rad,美國(guó)) 上進(jìn)行qRT-PCR,分析抗寒相關(guān)基因(SOD、WCS120、LEA和P5CS)的表達(dá)模式。PCR反應(yīng)體系為20 μL,包括2×SYBR real-time PCR premixture 10 μL,上、下游引物(10 μmol·L-1) 各0.4 μL,模板cDNA 1 μL,RNase free dd H2O補(bǔ)足至20 μL。PCR反應(yīng)程序:95 ℃預(yù)變性5 min,95 ℃變性15 s,60 ℃退火30 s,40個(gè)循環(huán);熔解曲線(xiàn):95 ℃變性5 s,60 ℃退火30 s,95 ℃變性15 s。每個(gè)樣品3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。采用2-ΔΔCT法計(jì)算目標(biāo)基因的相對(duì)表達(dá)量。

表1 qRT-PCR分析所用的引物Table 1 Primers used for qRT-PCR

1.3 數(shù)據(jù)處理

利用WPS Office進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和作圖,用DPS 15.10的Duncan’s新復(fù)極差法進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 低溫脅迫對(duì)小麥葉片葉綠素含量的影響

從表2可以看出,隨著低溫處理時(shí)間的延長(zhǎng),漯麥163和漯麥6010的葉綠素含量總體上均呈下降趨勢(shì)。低溫處理1～2 d后兩個(gè)品種的葉綠素含量與對(duì)照均無(wú)顯著差異,處理3 d后與對(duì)照均差異顯著。低溫處理0～3 d后漯麥163的葉綠素含量均明顯高于漯麥6010。說(shuō)明低溫脅迫嚴(yán)重阻礙了葉綠素的合成,但在兩個(gè)品種中的表現(xiàn)略有不同。

表2 低溫脅迫下兩個(gè)品種葉片的葉綠素含量、SOD活性和脯氨酸含量的變化Table 2 Changes of chlorophyll content, SOD activity and proline content in leaves ofthe two varieties under low temperature stress

2.2 低溫脅迫對(duì)小麥葉片SOD活性的影響

從表2可以看出,隨著低溫處理時(shí)間的延長(zhǎng),漯麥163和漯麥6010的SOD活性均呈先升后降的變化趨勢(shì)。處理2 d后兩個(gè)品種的SOD活性達(dá)到最高,均顯著高于對(duì)照,但與處理1 d后的SOD活性無(wú)顯著差異;處理3 d后兩品種的SOD活性最低,與對(duì)照均無(wú)顯著差異。對(duì)照和低溫處理3 d后漯麥163的SOD活性均明顯高于漯麥6010;而低溫處理1～2 d后漯麥163的SOD活性均明顯低于漯麥6010。說(shuō)明在低溫處理初期,漯麥6010和漯麥163通過(guò)提高葉片中的SOD活性,清除活性氧自由基,維持細(xì)胞膜系統(tǒng)的穩(wěn)定性;隨著低溫處理時(shí)間的延長(zhǎng),SOD活性下降,植株表現(xiàn)出對(duì)低溫逆境的適應(yīng)性,但在兩個(gè)品種中的表現(xiàn)略有不同。

2.3 低溫脅迫對(duì)小麥葉片脯氨酸含量的影響

從表2可以看出,隨著低溫處理時(shí)間的延長(zhǎng),漯麥163和漯麥6010的脯氨酸含量均呈先升后降的變化趨勢(shì)。低溫處理后兩個(gè)品種的脯氨酸含量均顯著高于對(duì)照,說(shuō)明兩個(gè)品種均可通過(guò)提高脯氨酸含量來(lái)適應(yīng)低溫逆境。處理1 d后兩個(gè)品種的脯氨酸含量達(dá)到最高,且均顯著高于對(duì)照及其他低溫處理;低溫處理2 d后與低溫處理3 d后漯麥163的脯氨酸含量差異顯著,而漯麥6010的脯氨酸含量在兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)無(wú)顯著差異。兩個(gè)品種間的脯氨酸含量在低溫處理1 d后無(wú)明顯差異,而在對(duì)照中漯麥163的脯氨酸含量明顯高于漯麥6010,在低溫處理2～3 d后漯麥163的脯氨酸含量明顯低于漯麥6010。

2.4 低溫脅迫對(duì)小麥葉片抗寒相關(guān)基因表達(dá)量的影響

從表3可以看出,隨著低溫脅迫處理時(shí)間的延長(zhǎng),漯麥163和漯麥6010葉片中SOD基因的表達(dá)量均表現(xiàn)為“降-升-降”的變化趨勢(shì)。低溫處理1～3 d后,兩個(gè)品種葉片中SOD基因的表達(dá)量均顯著低于對(duì)照。除對(duì)照外,低溫處理下漯麥163葉片中SOD基因的表達(dá)量均低于漯麥6010。

表3 低溫脅迫下小麥葉片抗逆相關(guān)基因的相對(duì)表達(dá)量Table 2 Relative expression levels of cold tolerance related genes in wheat leaves under low temperature treatments

隨著低溫處理時(shí)間的延長(zhǎng),漯麥163和漯麥6010葉片中WCS120基因的表達(dá)量均表現(xiàn)為先降后升的變化趨勢(shì)。低溫處理1～3 d后,兩個(gè)品種葉片中WCS120基因的表達(dá)量均顯著低于對(duì)照。除低溫處理1 d后外的其他時(shí)間點(diǎn),漯麥163葉片中WCS120基因的表達(dá)量均低于漯麥6010。

隨著低溫處理時(shí)間的延長(zhǎng),漯麥163葉片中LEA基因的表達(dá)量表現(xiàn)為“升-降-升”的變化趨勢(shì),于處理1 d 后達(dá)到最大值,顯著高于其他低溫處理和對(duì)照;而漯麥6010表現(xiàn)為“降-升-降”的變化趨勢(shì),對(duì)照為最大值,顯著高于其他低溫處理。對(duì)照和低溫處理2 d后漯麥163葉片中LEA基因的表達(dá)量均低于漯麥6010,低溫處理1 d和3 d后則相反。

隨著低溫處理時(shí)間的延長(zhǎng),漯麥163和漯麥6010葉片中P5CS基因的表達(dá)量均表現(xiàn)為先降后升的變化趨勢(shì)。對(duì)于漯麥163,低溫處理1～2 d后P5CS基因的表達(dá)量顯著低于對(duì)照,低溫處理3 d后則顯著高于對(duì)照;對(duì)于漯麥6010,低溫處理1 d后P5CS基因的表達(dá)量顯著低于對(duì)照,低溫處理2～3 d后則顯著高于對(duì)照,并于低溫處理3 d后達(dá)到最大值。對(duì)照和低溫處理3 d后漯麥163葉片中P5CS基因的表達(dá)量均高于漯麥6010,低溫處理2 d后則相反,低溫處理1 d后兩個(gè)品種葉片中P5CS基因的表達(dá)量一致。

3 討論與結(jié)論

葉綠素在光合作用中具有重要作用。王瑞霞等[9]研究發(fā)現(xiàn),在拔節(jié)期對(duì)小麥進(jìn)行低溫處理,小麥葉片的葉綠素含量顯著下降,但下降的幅度因品種而異。細(xì)胞膜的流動(dòng)性和穩(wěn)定性是細(xì)胞乃至整個(gè)植物賴(lài)以生存的基礎(chǔ),滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)在低溫脅迫下可有效維持細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能,對(duì)光合作用等生理過(guò)程具有積極的作用。張 磊等[13]研究發(fā)現(xiàn),拔節(jié)期低溫脅迫下,抗寒性較好的小麥會(huì)產(chǎn)生更多的脯氨酸;余海波[7]研究發(fā)現(xiàn),一定程度的低溫脅迫能夠誘導(dǎo)小麥葉片中游離脯氨酸含量的增加,使小麥在短時(shí)間內(nèi)表現(xiàn)出對(duì)低溫環(huán)境的適應(yīng)性,但當(dāng)溫度繼續(xù)降低時(shí),脯氨酸含量會(huì)下降。低溫脅迫下,植物體內(nèi)的SOD會(huì)清除過(guò)多的活性氧自由基,維持細(xì)胞膜系統(tǒng)的穩(wěn)定性,提高植株的抗寒性。張 軍等[14]研究發(fā)現(xiàn),拔節(jié)期持續(xù)低溫脅迫下,小麥葉片中的SOD活性均有不同程度的增高;薛亞光等[15]則研究發(fā)現(xiàn),稻秸全量還田方式下小麥葉片中的SOD活性隨著低溫脅迫的加重呈下降趨勢(shì),植株表現(xiàn)出對(duì)低溫逆境的適應(yīng)性。

本研究發(fā)現(xiàn),拔節(jié)期低溫脅迫阻礙了漯麥163和漯麥6010的葉綠素合成,進(jìn)一步降低了小麥葉片的光合能力,低溫脅迫時(shí)間越長(zhǎng),對(duì)小麥葉片的光合作用影響越顯著;低溫脅迫下,兩個(gè)品種的SOD活性和脯氨酸含量均顯著上升,有利于減輕小麥膜脂過(guò)氧化傷害,維持細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能,增強(qiáng)兩個(gè)品種的抗寒性,隨著低溫脅迫時(shí)間的延長(zhǎng),兩個(gè)品種的SOD活性和脯氨酸含量呈下降趨勢(shì),表現(xiàn)出對(duì)低溫逆境的適應(yīng)性。結(jié)合兩個(gè)品種在田間的抗寒性表現(xiàn),與生理指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果相符,說(shuō)明低溫脅迫下漯麥163和漯麥6010均具有較強(qiáng)的自我保護(hù)機(jī)制,抗寒性較好。

植物抗寒性是由多基因控制的數(shù)量性狀,抗寒相關(guān)基因只有在特定條件下才能表達(dá)。根據(jù)抗寒基因產(chǎn)物的功能可分為功能基因和調(diào)控基因兩大類(lèi)[16]。功能基因直接參與抵抗脅迫反應(yīng),主要有滲透調(diào)節(jié)分子基因P5CS、胚胎發(fā)育晚期豐富蛋白基因LEA、抗氧化酶基因SOD以及抗性蛋白基因WCS120等;調(diào)控基因主要是通過(guò)調(diào)控抗寒基因的表達(dá)來(lái)提高抗寒性,主要包含各種蛋白激酶基因、轉(zhuǎn)錄因子基因等。WCS120為冷誘導(dǎo)基因,只受低溫脅迫的特異誘導(dǎo),過(guò)表達(dá)WCS120可減輕凍害帶來(lái)的機(jī)械損傷,維持代謝物質(zhì)的運(yùn)轉(zhuǎn),從而提高植物的抗寒性[17]。SOD作為功能基因,在消除活性氧的過(guò)程中具有重要作用,SOD活性的增加有利于減輕小麥在低溫脅迫下造成的膜脂過(guò)氧化傷害。P5CS是脯氨酸合成途徑中一個(gè)關(guān)鍵基因,催化脯氨酸生物合成的最初前兩步,其表達(dá)與脯氨酸含量密切相關(guān)[18];LEA受逆境脅迫誘導(dǎo),是一種逆境脅迫響應(yīng)基因,在植物抵抗逆境中發(fā)揮著重要作用[19]。

本研究發(fā)現(xiàn),低溫脅迫下,與對(duì)照相比,漯麥163和漯麥6010兩個(gè)品種葉片中SOD基因的表達(dá)量均顯著下調(diào),與SOD活性表現(xiàn)不一致,原因可能與SOD同工酶有關(guān);在低溫處理2 d和3 d后,漯麥163和漯麥6010兩個(gè)品種葉片中SOD基因的表達(dá)量與SOD活性測(cè)定結(jié)果一致。在低溫處理3 d后,兩個(gè)品種葉片中P5CS基因的表達(dá)量顯著高于對(duì)照,與其脯氨酸含量表現(xiàn)相一致。持續(xù)低溫處理下,兩個(gè)品種葉片中WCS120基因的表達(dá)量表現(xiàn)出先降后升的變化趨勢(shì),且顯著高于對(duì)照。漯麥163葉片中LEA基因的表達(dá)量在低溫處理1 d后顯著上調(diào)表達(dá),而低溫處理后漯麥6010葉片中LEA基因的表達(dá)量呈顯著下調(diào)表達(dá),推測(cè)不同品種對(duì)低溫的響應(yīng)機(jī)制不同。綜上所述,兩個(gè)品種的抗寒性差異主要集中在相關(guān)基因的表達(dá),漯麥163主要通過(guò)調(diào)控LEA和P5CS基因的表達(dá)來(lái)提高對(duì)低溫脅迫的抵抗能力;而漯麥6010則是通過(guò)調(diào)控P5CS和WCS120基因的表達(dá)抵御低溫逆境。

小麥的抗寒性機(jī)理復(fù)雜,不同基因型小麥品種因發(fā)育特點(diǎn)不同,在遭受倒春寒時(shí)其受害程度也不同,選育耐寒品種是提高小麥抗倒春寒能力的根本途徑。本研究從生理生化和抗寒基因表達(dá)兩方面對(duì)漯麥163和漯麥6010的抗寒性進(jìn)行了分析,并結(jié)合大田觀察,發(fā)現(xiàn)漯麥163和漯麥6010均具有較強(qiáng)的耐倒春寒能力,可作為抗寒性親本種質(zhì)資源,加快耐倒春寒小麥品種的選育。