郝洪丹，劉冠慧，張議心，尚佳靜，羅娟

（ 河北工程大學(xué)生命科學(xué)與食品工程學(xué)院，河北 邯鄲 056038 ）

腹瀉是常見(jiàn)的動(dòng)物消化系統(tǒng)疾病。腹瀉病屬于中醫(yī)“泄瀉”范疇，以排便次數(shù)增加為主要癥狀，大便呈溏薄狀或水狀[1]。泄瀉證型不同治療方法也不同，但臨床中通常不辨證，普遍只給予抗生素治療。目前，隨著抗生素的廣泛應(yīng)用，其引起的耐藥情況在全球范圍內(nèi)已十分普遍，且獸用抗生素濫用問(wèn)題也日漸凸顯[2]。抗生素過(guò)度使用會(huì)造成腸道菌群失調(diào)，使免疫系統(tǒng)和代謝紊亂，引起慢性腹瀉、抗生素耐藥及其他臨床并發(fā)癥[3-4]。中藥具有耐藥性低、多靶點(diǎn)、天然低毒等治療特點(diǎn)，可用于代替抗生素治療人類(lèi)和動(dòng)物各種疾病。已有研究表明，中藥對(duì)于腸激惹綜合征、潰瘍性結(jié)腸炎、慢性腹瀉等多種病因引起的腹瀉[5-9]均具有很好的療效。

張景岳主張泄瀉病位在脾胃，呈現(xiàn)脾虛邪實(shí)[10]，脾虛和濕邪是主因。畜禽臨床中，由于飼養(yǎng)不當(dāng)、營(yíng)養(yǎng)過(guò)剩導(dǎo)致脾胃虧虛，且多食寒涼，脾虛寒濕泄瀉證常見(jiàn)?！秱摗分械睦碇袦侵委熎⑽柑摵拇矸絼楦玫刂委熜篂a造成的津傷氣虛及腹痛，本研究針對(duì)脾虛寒濕泄瀉，在理中湯中加入茯苓、山藥，加強(qiáng)祛濕作用兼而保護(hù)津液；加木香、桂枝、砂仁增加行氣止痛和助陽(yáng)止瀉的功效。番瀉葉為苦寒之品，是建立脾虛泄瀉模型常用的苦寒瀉下法藥物[11-12]。本試驗(yàn)通過(guò)建立脾虛泄瀉小鼠，研究理中湯加減對(duì)其血常規(guī)、血糖及臟器指數(shù)等指標(biāo)的影響，為后續(xù)理中湯加減應(yīng)用于獸醫(yī)臨床治療腹瀉提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

無(wú)特定病原體級(jí)ICR小鼠72只，體重（20±2） g，購(gòu)自北京斯貝福生物技術(shù)有限公司，許可證號(hào)為SCXK（京）2019-0010。動(dòng)物飼養(yǎng)于河北工程大學(xué)動(dòng)物房，雌、雄分籠飼養(yǎng)，在適宜的飼養(yǎng)環(huán)境下（室溫約22 ℃，相對(duì)濕度為50%～70%，室內(nèi)清潔且安靜），光照12 h、黑暗12 h交替進(jìn)行，自由采食標(biāo)準(zhǔn)飼糧及飲用純凈水，每日清理鼠籠1次。

1.2 試劑與儀器

本研究所用中藥均購(gòu)自北京同仁堂邯鄲藥店，包括干姜（批號(hào)：22051101）、黨參（批號(hào)：391210701）、白術(shù)（批號(hào)：117220601）、茯苓（批號(hào)：325220701）、山藥（批號(hào)：220622002）、木香（批號(hào)：211017005）、桂枝（批號(hào)：261220701）、砂仁（批號(hào)：348200701）、甘草（批號(hào)：27220802）。恩諾沙星片（KVP Kiel有限責(zé)任公司，生產(chǎn)批號(hào)：KV03CRF）。

主要儀器：FA1104電子天平（上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司）、XFH-75CA高壓滅菌鍋（浙江新豐醫(yī)療器械有限公司）、DHG-9070A電熱鼓風(fēng)干燥箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）、BC-2800自動(dòng)血液細(xì)胞分析儀（深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司）、BCD-182LTMPA冰箱（青島海爾生物醫(yī)療股份有限公司）、582血糖儀（江蘇魚(yú)躍醫(yī)療設(shè)備股份有限公司）。

1.3 試驗(yàn)用藥物制備

1.3.1 恩諾沙星溶液的制備

取恩諾沙星片50 mg加入滅菌蒸餾水41.41 mL中，配制成濃度為1.21 g/L的溶液，4 ℃冰箱保存。

1.3.2 中藥復(fù)方提取物的制備

取中藥干姜15 g、黨參15 g、白術(shù)15 g、茯苓15 g、山藥20 g、木香5 g、桂枝5 g、砂仁5 g、甘草5 g（生藥量為100 g）。中藥加蒸餾水1 L，浸泡1 h后煎煮30 min，使用12層紗布過(guò)濾；藥渣加蒸餾水0.5 L再煎煮20 min，再次使用12層紗布過(guò)濾。兩次濾液合并后加熱蒸發(fā)濃縮至50 mL（按生藥計(jì)2 g/mL），冷卻至室溫后分裝5份，每份10 mL，高壓滅菌后4 ℃冰箱保存。

1.4 加味理中湯方對(duì)脾虛泄瀉小鼠血常規(guī)、血糖及臟器指數(shù)的影響

1.4.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

無(wú)特定病原體級(jí)ICR小鼠72只，適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d，試驗(yàn)前一晚禁食不禁水12 h后稱(chēng)空腹體重，根據(jù)體重將小鼠隨機(jī)分為6組，即空白對(duì)照組（C組）、泄瀉模型組（M組）、恩諾沙星治療組（A組）、中藥低劑量組（ZL組）、中藥中劑量組（ZM組）、中藥高劑量組（ZH組），每組12只小鼠，雌、雄各半。除C組外，其余各組小鼠按照30 g/kg灌胃番瀉葉提取物，C組小鼠灌胃同體積的生理鹽水，均每日1次，連續(xù)9 d，建立脾虛泄瀉模型[13-16]。試驗(yàn)第10 d停用番瀉葉，前一晚禁食不禁水12 h，A組小鼠按24.15 mg/kg灌胃恩諾沙星水溶液治療，各中藥組分別給予低劑量（6.5 g/kg）、中劑量（13.0 g/kg）、高劑量（26.0 g/kg）灌胃治療（分別對(duì)應(yīng)正常治療劑量的0.5倍、1.0倍、2.0倍），C組和M組采用同體積的生理鹽水灌胃，均每日1次，連續(xù)治療3 d。

各組末次給藥后禁食不禁水12 h，禁水1 h，眼球取血后斷頸處死。試驗(yàn)流程見(jiàn)圖1。

圖1 試驗(yàn)流程Fig.1 Experimental process diagram

1.4.2 測(cè)定指標(biāo)及方法

1.4.2.1 血常規(guī)檢測(cè)

試驗(yàn)結(jié)束后，每組隨機(jī)選取5只小鼠眼球取血1 mL，注入EDTA抗凝管中，混勻后使用全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀進(jìn)行血常規(guī)檢測(cè)[15]。檢測(cè)指標(biāo)包括：白細(xì)胞數(shù)目、淋巴細(xì)胞百分比、單核細(xì)胞百分比、中性粒細(xì)胞百分比、紅細(xì)胞數(shù)目、血紅蛋白以及血小板數(shù)目。

1.4.2.2 血糖含量

試驗(yàn)第10 d灌胃前和試驗(yàn)最后1 d眼球取血前，每只小鼠尾根靜脈采血1滴，使用血糖儀試紙條檢測(cè)小鼠空腹血糖含量并記錄結(jié)果。

1.4.2.3 肝臟、腎臟臟器指數(shù)

記錄試驗(yàn)最后1d眼球取血前的空腹體重，此為治療末體重。解剖1.4.1中處死的小鼠，摘取肝臟和腎臟，在精密天平中稱(chēng)重，分別計(jì)算肝臟指數(shù)、腎臟指數(shù)。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用IBM SPSS Statistics 25軟件進(jìn)行分析，單因素方差分析（ANOVA）進(jìn)行組間比較，LSD法（假定等方差）及塔姆黑尼法（不假定等方差）進(jìn)行兩兩比較，卡方檢驗(yàn)進(jìn)行不同性別間驗(yàn)證。結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示，P＜0.05表示差異顯著，P＜0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 加味理中湯方對(duì)脾虛泄瀉小鼠血常規(guī)指標(biāo)的影響（見(jiàn)表1）

表1 加味理中湯方對(duì)脾虛泄瀉小鼠血常規(guī)指標(biāo)的影響Tab.1 Effect of Jiawei Lizhong Decoction on blood routine indexes of mice with diarrhea due to spleen deficiency

由表1可知，與C組相比，M組小鼠白細(xì)胞數(shù)目、中性粒細(xì)胞百分比分別升高了171.18%、384.25%（P＜0.01），淋巴細(xì)胞百分比、單核細(xì)胞百分比、紅細(xì)胞數(shù)目、血小板數(shù)目分別降低了88.25%（P＜0.01）、51.04%（P＞0.05）、8.17%（P＞0.05）、37.58%（P＜0.05）。與M組相比，各組小鼠白細(xì)胞數(shù)目差異均不顯著（P＞0.05）；A組、ZL組、ZM組、ZH組淋巴細(xì)胞百分比分別升高了818.81%、662.26%、722.17%、803.47%（P＜0.01），中性粒細(xì)胞百分比分別降低84.50%、68.57%、73.99%、83.05%（P＜0.01）；ZH組血小板數(shù)目升高85.90%（P＜0.01）。與A組相比，ZL組小鼠淋巴細(xì)胞百分比顯著降低（P＜0.05），中性粒細(xì)胞百分比極顯著升高（P＜0.01）；ZH組血小板數(shù)目顯著升高（P＜0.05）。各組小鼠單核細(xì)胞百分比、紅細(xì)胞數(shù)目、血紅蛋白等指標(biāo)差異均不顯著（P＞0.05）。結(jié)果表明，加味理中湯方可恢復(fù)部分脾虛泄瀉小鼠血常規(guī)異常指標(biāo)，且ZH組小鼠血小板數(shù)目恢復(fù)的情況優(yōu)于A(yíng)組。

2.2 加味理中湯方對(duì)脾虛泄瀉小鼠血糖含量的影響（見(jiàn)圖2、圖3）

圖2 各組小鼠治療前后空腹血糖含量Fig.2 Fasting blood glucose content of mice in each group before and after treatment

圖3 各組小鼠治療前后血糖含量變化量Fig.3 Changes of blood glucose content before and after treatment in each group of mice

由圖2可知，治療前，與C組相比，其余各組小鼠血糖含量顯著下降（P＜0.05），但各組間差異不顯著（P＞0.05）。治療后，與C組相比，M組小鼠血糖含量顯著下降48.14%（P＜0.05）；與M組相比，A組、ZL組、ZM組和ZH組小鼠血糖含量分別升高了45.14%、55.38%、79.48%、102.55%（P＜0.05）；與A組相比，ZL組、ZM組和ZH組小鼠血糖含量分別升高了7.06%（P＞0.05）、23.66%（P＜0.05）、39.56%（P＜0.05）。治療后各組小鼠血糖含量由低到高排序?yàn)镸組＜A組＜ZL組＜ZM組＜C組＜ZH組。

由圖3可知，與C組相比，M組小鼠治療前后血糖含量變化量降低34.72%（P＜0.05）；與M組相比，A組、ZL組、ZM組和ZH組小鼠治療前后血糖含量變化量分別升高23.42%、27.35%、44.89%、62.65%（P＜0.05）；與A組相比，ZL組、ZM組、ZH組小鼠治療前后血糖含量變化量分別升高3.93%（P＞0.05）、21.47%（P＜0.05）、39.23%（P＜0.05）。治療前后各組小鼠血糖含量變化量由低到高排序?yàn)镸組＜A組＜ZL組＜C組＜ZM組＜ZH組。

結(jié)果表明，加味理中湯方可改善脾虛泄瀉造成的血糖下降，且ZM組和ZH組效果優(yōu)于A(yíng)組。

2.3 加味理中湯方對(duì)脾虛泄瀉小鼠肝臟指數(shù)、腎臟指數(shù)的影響（見(jiàn)表2）

表2 加味理中湯方對(duì)脾虛泄瀉小鼠肝臟指數(shù)、腎臟指數(shù)的影響Tab.2 Effect of Jiawei Lizhong Decoction on liver index and kidney index of splenic deficiency diarrhea mice 單位：%

由表2可知，與C組相比，M組小鼠肝臟指數(shù)降低19.34%（P＜0.01）。與M組相比，A組、ZL組、ZM組、ZH組小鼠肝臟指數(shù)分別升高了0.21%（P＞0.05）、15.42%（P＞0.05）、21.20%（P＜0.05）、23.77%（P＜0.01）。與A組相比，ZL組、ZM組、ZH組小鼠肝臟指數(shù)分別升高15.17%（P＞0.05）、20.94%（P＜0.05）、23.50%（P＜0.01）。各組小鼠腎臟指數(shù)差異均不顯著（P＞0.05）。各組小鼠肝臟指數(shù)由低到高排序?yàn)镸組＜A組＜ZL組＜ZM組＜ZH組＜C組，腎臟指數(shù)由低到高排序?yàn)锳組＜M組＜C組＜ZL組=ZM組＜ZH組。

結(jié)果表明，加味理中湯方可改善脾虛泄瀉造成的肝臟及腎臟指數(shù)降低，且ZH組效果最佳。

3 討論

腹瀉的病因復(fù)雜，主要包括傳染性因素如病毒、細(xì)菌、寄生蟲(chóng)，非傳染性因素如營(yíng)養(yǎng)因素、飼養(yǎng)管理因素等[17]。畜禽臨床中，飼養(yǎng)不當(dāng)、營(yíng)養(yǎng)過(guò)剩導(dǎo)致動(dòng)物脾胃虧虛，脾虛則運(yùn)化無(wú)力而濕邪內(nèi)生，又因多食寒涼食物，脾陽(yáng)受損又濕邪困脾，脾胃升降失常，清濁不分水谷順腸而下，造成脾胃虛寒泄瀉?！镀⑽刚摗分醒悦?，“大忌苦寒之藥，損其脾胃”。番瀉葉性味甘苦寒，歸屬大腸經(jīng)，是建立脾虛動(dòng)物模型的常用藥物[18-19]，主要瀉下成分為蒽醌類(lèi)化合物及其衍生物[20]。研究表明，番瀉葉還具抑菌、止血、降血糖、增強(qiáng)平滑肌收縮、肌肉松弛與解痙等作用，大劑量或長(zhǎng)期使用會(huì)導(dǎo)致低鉀血癥、腸部炎癥、腸黏膜損傷，甚至致死等[21-22]。

有研究表明，理中湯可治療抗生素相關(guān)性腹瀉，且只對(duì)寒濕泄瀉有效，對(duì)實(shí)熱泄瀉則無(wú)效[23-24]。本試驗(yàn)在理中湯基礎(chǔ)上添加了茯苓、山藥、木香、桂枝、砂仁，其中茯苓、山藥增強(qiáng)了補(bǔ)脾祛濕功效，木香可健脾和胃、行氣止痛，桂枝、砂仁溫通可增強(qiáng)助陽(yáng)止瀉效果。干姜、黨參、白術(shù)、茯苓、山藥、木香、砂仁均具有調(diào)節(jié)免疫、調(diào)節(jié)胃腸功能、調(diào)節(jié)腸道菌群、抗炎等作用，木香、桂枝、砂仁還具有止痛、抗菌等藥理作用[25-32]，為加味理中湯方治療脾虛泄瀉提供良好的理論基礎(chǔ)。

本研究中采用小鼠連續(xù)灌胃番瀉葉的方法造成脾虛泄瀉，脾虛而氣血虛，導(dǎo)致M組小鼠紅細(xì)胞數(shù)目和血紅蛋白略有下降，血糖含量顯著下降；脾虛而衛(wèi)氣不固，外邪易侵入，機(jī)體免疫力下降，M組小鼠血小板數(shù)目、淋巴細(xì)胞百分比均下降，白細(xì)胞數(shù)目、中性粒細(xì)胞百分比均升高；脾虛影響肝腎，因而肝臟指數(shù)顯著降低、腎臟指數(shù)略有降低。治療后，與M組相比，ZH組小鼠紅細(xì)胞數(shù)目、血紅蛋白均升高，血小板數(shù)目、肝臟指數(shù)、淋巴細(xì)胞百分比均顯著升高，中性粒細(xì)胞百分比顯著下降。與A組相比，ZH組小鼠血糖含量、肝臟指數(shù)均顯著升高，血小板數(shù)目、腎臟指數(shù)均有所升高。

有研究表明，番瀉葉造成的脾虛泄瀉可導(dǎo)致血小板數(shù)目顯著下降，紅細(xì)胞數(shù)目、血紅蛋白有下降趨勢(shì)，其余項(xiàng)目無(wú)顯著差異[15]。李錦靈等[33]研究表明，番瀉葉可顯著降低小鼠白細(xì)胞數(shù)目、淋巴細(xì)胞數(shù)目、脾臟指數(shù)、胸腺指數(shù)。番瀉葉提取物會(huì)造成大鼠肝臟指數(shù)下降、腎臟指數(shù)升高[34]，大量給予抗生素后會(huì)造成小鼠血小板數(shù)目下降[35]。上述研究均與中醫(yī)泄瀉病位在脾胃腸，與肝腎相關(guān)的理論一致。本研究中，M組小鼠的肝臟指數(shù)、紅細(xì)胞數(shù)目、血紅蛋白以及血小板數(shù)目下降等變化趨勢(shì)與文獻(xiàn)一致，但白細(xì)胞數(shù)目、中性粒細(xì)胞百分比、淋巴細(xì)胞百分比的變化趨勢(shì)與上述文獻(xiàn)存在差別，可能與造成腹瀉的微生物不同有關(guān)。根據(jù)本試驗(yàn)結(jié)果分析，腹瀉小鼠可能伴有細(xì)菌感染和炎癥反應(yīng)，而恩諾沙星并未造成血小板進(jìn)一步降低，可能與本試驗(yàn)中恩諾沙星劑量為正常治療量有關(guān)。治療后，恩諾沙星組小鼠血常規(guī)指標(biāo)和血糖含量也得到一定改善，可能與恩諾沙星的抗菌作用有關(guān)；各劑量組的中藥組方均很好地回調(diào)了小鼠的血常規(guī)指標(biāo)、血糖含量及肝腎臟器指數(shù)等指標(biāo)，可能是由于干姜、黨參、白術(shù)、茯苓、山藥、木香、砂仁提高了泄瀉小鼠的免疫力，以及干姜、木香、桂枝、砂仁抗菌的藥理作用有關(guān)。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，加味理中湯方對(duì)脾虛泄瀉小鼠的血常規(guī)、血糖及肝腎臟器指數(shù)的指標(biāo)異常均具有一定的改善作用，且高劑量組效果優(yōu)于恩諾沙星組。本研究結(jié)果可為加味理中湯方在臨床診療中代替抗生素治療脾虛泄瀉提供一定參考。