甄麗，王婕，朱彩彩，程嬌梅

（ 青島蔚藍(lán)生物集團(tuán)有限公司，山東 青島 266102 ）

活菌計(jì)數(shù)方法廣泛應(yīng)用于對(duì)比試驗(yàn)方案、優(yōu)化發(fā)酵指標(biāo)、測(cè)定發(fā)酵生長(zhǎng)曲線、評(píng)價(jià)產(chǎn)品性狀等方面[1]。常用的活菌計(jì)數(shù)方法有平板稀釋計(jì)數(shù)法、直接染色觀察法、比濁法、菌體干重法等[2]。平板稀釋計(jì)數(shù)法可準(zhǔn)確反映出活菌含量，但操作煩瑣、耗時(shí)長(zhǎng)；其他幾種活菌計(jì)數(shù)方法無(wú)法區(qū)別細(xì)菌細(xì)胞的死活，且易受到培養(yǎng)基、菌體代謝產(chǎn)物等因素的影響[3]。噻唑藍(lán)（MTT）是一種噻唑鹽，廣泛應(yīng)用于動(dòng)物細(xì)胞活性計(jì)數(shù)、生物因子活性檢測(cè)、細(xì)胞毒性試驗(yàn)、抗腫瘤藥物篩選等[4-5]。MTT法原理為活性細(xì)胞內(nèi)的琥珀酸脫氫酶將MTT還原成藍(lán)紫色的結(jié)晶物甲臜[6]，形成的甲臜量與活性細(xì)胞數(shù)量成正比，而死細(xì)胞無(wú)此反應(yīng)[7-8]。加入四氯化碳溶解反應(yīng)生成的甲臜[9]，在一定波長(zhǎng)下的吸光度可間接反映活細(xì)胞的數(shù)量[10-11]?；罹?xì)胞同樣可在酶的作用下產(chǎn)生甲臜[12]，因此，MTT法成為一種快速的活菌檢測(cè)方法[13]。地衣芽孢桿菌可調(diào)節(jié)動(dòng)物腸道環(huán)境，作為動(dòng)物飼料添加劑具有廣闊的應(yīng)用前景[14]。地衣芽孢桿菌活菌量是發(fā)酵水平和產(chǎn)品質(zhì)量的重要指標(biāo)，因此研究一種能夠快速、準(zhǔn)確檢測(cè)活菌數(shù)的方法具有重要意義。本試驗(yàn)在新鮮菌液中加入MTT后立即計(jì)時(shí)，一定時(shí)間后加入鹽酸溶液使地衣芽孢桿菌失活終止顯色反應(yīng)，將四氯化碳加入反應(yīng)溶液中萃取甲臜，檢測(cè)萃取液的吸光度[15]，最終通過(guò)計(jì)算測(cè)定地衣芽孢桿菌發(fā)酵液生長(zhǎng)情況，以此優(yōu)化菌液中地衣芽孢桿菌含量的檢測(cè)方法并為MTT-分光光度法應(yīng)用于活菌計(jì)數(shù)提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 試劑與培養(yǎng)基

PBS溶液配制：8 g氯化鈉、1.15 g磷酸氫二鉀、0.2 g磷酸二氫鉀、去離子水定容至1 000 mL，pH值7.2，121 ℃滅菌15 min[16]。

MTT（阿拉丁試劑（上海）有限公司）溶液配制：0.5 g MTT溶于100 mL滅菌的PBS中。

1.0 mol/L鹽酸配制：9 mL鹽酸緩慢注入去離子水中，定容至100 mL。

四氯化碳：由國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司提供。

地衣芽孢桿菌發(fā)酵培養(yǎng)基：玉米粉20 g、葡萄糖15 g、磷酸氫二鉀3 g、磷酸二氫鉀1.5 g、硫酸鎂0.5 g、硫酸錳0.2 g、硫酸亞鐵0.1 g、碳酸鈣0.1 g、去離子水1 000 mL，pH值7.2，121 ℃滅菌15 min。

LB培養(yǎng)基：蛋白胨10 g、酵母粉5 g、氯化鈉10 g、去離子水1 000 mL，pH值7.0，121 ℃滅菌15 min。

1.1.2 試驗(yàn)菌液

試驗(yàn)所使用的菌液為青島蔚藍(lán)生物集團(tuán)有限公司地衣芽孢桿菌新下罐發(fā)酵液。

1.1.3 儀器設(shè)備

TU-1810型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）；5.0、1.0、0.2 mL eppendorf移液器（艾本德中國(guó)有限公司）；THERMO SCIENTIFIC 2864型循環(huán)水浴鍋（賽默飛世爾科技公司）；7 mL離心管等。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 MTT-分光光度法測(cè)定步驟

在無(wú)菌7 mL離心管中加入滅菌PBS適當(dāng)稀釋后的新鮮發(fā)酵菌液1 mL，37 ℃水浴保溫5 min，依次加入1 mol/L鹽酸1 mL和一定量MTT溶液。放置室溫后，加入2 mL四氯化碳，充分混勻后，顯色10 min，吸取下清液作為比色的空白對(duì)照[17]。

在無(wú)菌的7 mL離心管中加入滅菌PBS適當(dāng)稀釋的新鮮發(fā)酵菌液1 mL，37 ℃水浴保溫5 min，加入一定量MTT溶液，準(zhǔn)確計(jì)時(shí)相應(yīng)時(shí)間后加入1 mol/L鹽酸終止反應(yīng)。放置室溫后，加入2 mL四氯化碳，顯色10 min，吸取下清液，以空白對(duì)照調(diào)零，測(cè)定吸光度。

1.2.2 稀釋平板法測(cè)定

每份發(fā)酵樣品10倍系列稀釋，取相應(yīng)稀釋樣品0.1 mL涂布于NA培養(yǎng)皿，36 ℃培養(yǎng)18 h，采用稀釋平板法計(jì)數(shù)發(fā)酵菌液中的活菌量。之后分析MTT-分光光度法與平板法的對(duì)應(yīng)關(guān)系[18]。

1.3 MTT-分光光度法優(yōu)化

1.3.1 顯色反應(yīng)終止液最適濃度

試驗(yàn)選擇2.0、1.0、0.5 mol/L的鹽酸溶液作為顯色反應(yīng)的終止液。取1 mL地衣芽孢桿菌發(fā)酵液，分別加入上述濃度的鹽酸溶液1 mL，充分混勻后測(cè)定pH值和地衣芽孢桿菌的活菌數(shù)，確定顯色反應(yīng)終止液最適濃度。

1.3.2 最適吸收波長(zhǎng)

不同類型的菌株產(chǎn)生的二甲基亞砜甲臜溶液的最大吸收峰不同[17]。因此，本試驗(yàn)以450～650 nm為掃描范圍，測(cè)定吸光度（OD值）[19]，確定最適吸收波長(zhǎng)。

1.3.3 最適MTT添加量

相同的發(fā)酵菌液反應(yīng)體系中分別加入0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL的MTT溶液，反應(yīng)1 h，測(cè)定OD值[19]以確定最適MTT添加量。

1.3.4 最適反應(yīng)時(shí)間

相同的發(fā)酵菌液加入0.2 mL的MTT溶液，反應(yīng)時(shí)間分別為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h，測(cè)定OD值[19]以確定最適反應(yīng)時(shí)間。

1.3.5 最適菌液濃度

將發(fā)酵菌液稀釋0、10、100、1 000倍，同時(shí)按照1.2.1和1.2.2中步驟進(jìn)行MTT-分光光度法、稀釋平板法試驗(yàn)。菌液中加入0.2 mL MTT溶液，反應(yīng)1 h，測(cè)定發(fā)酵菌液的OD值，并與稀釋平板法測(cè)定的活菌量進(jìn)行分析[20-21]。每個(gè)稀釋倍數(shù)設(shè)3個(gè)重復(fù)。

1.3.6 不同培養(yǎng)基、培養(yǎng)液保存后和其他干擾物對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響

分別測(cè)定地衣芽孢桿菌發(fā)酵培養(yǎng)基發(fā)酵液、LB培養(yǎng)基發(fā)酵液、100 ℃煮沸10 min滅菌后的LB培養(yǎng)基發(fā)酵液、4 ℃儲(chǔ)存24 h后的發(fā)酵液、MTT溶液、PBS溶液、空白LB培養(yǎng)基對(duì)本方法檢測(cè)結(jié)果的影響[17]。

2 結(jié)果與分析

2.1 MTT-分光光度法最適條件

2.1.1 不同濃度鹽酸溶液對(duì)地衣芽孢桿菌活性的影響（見(jiàn)表1）

表1 不同濃度鹽酸溶液對(duì)地衣芽孢桿菌活性的影響Tab.1 Effects of different concentrations of hydrochloric acid on the activity of Bacillus licheniformis

由表1可知，1.0 mol/L的鹽酸可降低地衣芽孢桿菌的活菌數(shù)，可使甲臜的顯色反應(yīng)迅速終止，從而得到精確的控制反應(yīng)時(shí)間。

2.1.2 不同波長(zhǎng)對(duì)吸光度的影響（見(jiàn)圖1）

圖1 不同波長(zhǎng)對(duì)吸光度的影響Fig.1 Effect of different wavelengths on absorbance

由圖1可知，波長(zhǎng)在550 nm時(shí)，地衣芽孢桿菌吸光度最大。因此，地衣芽孢桿菌的最適吸光度為550 nm。

2.1.3 不同MTT添加量對(duì)發(fā)酵菌液吸光度的影響（見(jiàn)圖2）

圖2 不同MTT添加量對(duì)發(fā)酵菌液吸光度的影響Fig.2 Effect of different MTT supplemental levels on absorbance of fermented bacterial solution

由圖2可知，在一定范圍內(nèi)增加MTT添加量可使吸光度增大，當(dāng)MTT含量為0.2 mL時(shí)，吸光度最大。MTT添加量超過(guò)0.2 mL后，隨著添加量增大，吸光度呈降低趨勢(shì)。

2.1.4 不同反應(yīng)時(shí)間對(duì)發(fā)酵菌液吸光度的影響（見(jiàn)圖3）

圖3 不同反應(yīng)時(shí)間對(duì)發(fā)酵菌液吸光度的影響Fig.3 Effect of different reaction time on absorbance of fermentation liquid

由圖3可知，反應(yīng)時(shí)間在30～60 min范圍內(nèi)，延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間可顯著增加吸光度；超過(guò)60 min后，隨著反應(yīng)時(shí)間增加，吸光度會(huì)有一定程度的增加。但考慮到時(shí)間成本，選擇反應(yīng)時(shí)間為60 min。

2.1.5 不同菌液濃度對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響（見(jiàn)表2）

表2 不同菌液濃度對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響Tab.2 Effect of different concentration of bacterial solution on determination results

由表2可知，菌液濃度為108～109CFU/mL時(shí)，OD550nm值與稀釋平板法得到的活菌數(shù)具有很好的線性對(duì)應(yīng)關(guān)系，當(dāng)菌液濃度＜108CFU/mL時(shí)對(duì)應(yīng)關(guān)系不再成立。

由此可知，MTT分光光度法測(cè)定地衣芽孢桿菌發(fā)酵液，菌液濃度最低應(yīng)≥108CFU/mL。

2.1.6 干擾物和菌液儲(chǔ)存后對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響（見(jiàn)表3）

表3 各種干擾物和菌液儲(chǔ)存后對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響Tab.3 Effect of various interferences and bacterial solutions on assay results after storage

由表3可知，MTT-分光光度法測(cè)定地衣芽孢桿菌的菌量不受空白培養(yǎng)基、滅活培養(yǎng)液和其他干擾物的影響，均可快速地測(cè)定發(fā)酵液的OD值，通過(guò)OD值即可準(zhǔn)確地計(jì)算出發(fā)酵液的活菌數(shù)。但該方法檢測(cè)的發(fā)酵液必須是新鮮培養(yǎng)的菌液，4 ℃儲(chǔ)存后地衣芽孢菌代謝活性下降，無(wú)法采用本方法進(jìn)行檢測(cè)。

2.2 MTT-分光光度法與稀釋平板法的線性關(guān)系

取6支滅菌后的7 mL離心管，依次加入地衣芽孢桿菌新鮮菌液和滅菌PBS溶液。充分混勻后，在37 ℃水浴中保溫5 min，加入0.2 mL MTT溶液，反應(yīng)1 h后加1.0 mol/L鹽酸1 mL，電磁振蕩3 s終止反應(yīng)。取出放置室溫后加入2 mL四氯化碳，充分混勻后靜置10 min，吸取1號(hào)離心管中的下清液作為空白對(duì)照，在550 nm波長(zhǎng)下測(cè)定其他各離心管中下清液的OD值。同時(shí)使用稀釋平板法測(cè)定每支離心管內(nèi)的活菌量，結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 離心管中發(fā)酵液、滅菌PBS添加量及相應(yīng)的吸光度、活菌量Tab.4 Dosage of fermentation liquid and sterilized PBS solution in centrifuge tube and corresponding absorbance and viable bacteria value

以MTT-分光光度法測(cè)得的OD550nm值為縱坐標(biāo)，稀釋平板法得到的活菌量為橫坐標(biāo)繪制回歸曲線，得到方程y=0.066 0x-0.0150，R2=0.998 1（見(jiàn)圖4）。

圖4 MTT分光光度法與稀釋平板法的線性關(guān)系Fig.4 Linear relationship between MTT-spectrophotometry and dilution plate method

2.3 MTT-分光光度法、稀釋平板法測(cè)定發(fā)酵液中活菌量結(jié)果對(duì)比（見(jiàn)表5）

表5 MTT-分光光度法、稀釋平板法測(cè)定發(fā)酵液中活菌量結(jié)果對(duì)比Tab.5 Comparison of results of MTT-spectrophotometry and dilution plate method for determination of viable bacteria in fermentation broth

采用MTT-分光光度法和稀釋平板法分別測(cè)定青島蔚藍(lán)生物集團(tuán)有限公司研發(fā)中心5批不同的地衣芽孢桿菌發(fā)酵液，MTT-分光光度法測(cè)定得到的OD值換算為計(jì)算活菌量與稀釋平板法得到的活菌量進(jìn)行對(duì)比。

由表5可知，5次測(cè)定吸光度OD550nm的RSD值最高為1.86%，小于5.0%，符合定量檢測(cè)方法要求。

3 討論

地衣芽孢桿菌是一種具有抗逆性強(qiáng)、酶系豐富、產(chǎn)酶量高、安全穩(wěn)定等多種優(yōu)良特性的菌株。地衣芽孢桿菌在醫(yī)藥、畜牧業(yè)、工農(nóng)業(yè)、環(huán)境保護(hù)等各個(gè)領(lǐng)域中應(yīng)用前景廣泛[22]，是最早實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化且迄今為止用途最廣、產(chǎn)量最大的菌株類型[23]。隨著生產(chǎn)規(guī)模增加，快速高效地測(cè)定地衣芽孢桿菌含量的方法亟待開(kāi)發(fā)。

MTT-分光光度法作為一種間接測(cè)定方法，測(cè)得的吸光度反映的是地衣芽孢桿菌新鮮發(fā)酵液活菌量的相對(duì)值。MTT-分光光度法應(yīng)用的前提在于先建立待測(cè)菌株的稀釋平板法活菌數(shù)與MTT分光光度法吸光度之間的回歸關(guān)系曲線，不同菌株的回歸曲線不同。此外，使用MTT-分光光度法測(cè)定活菌量時(shí)，待測(cè)菌液濃度必須調(diào)整到適用范圍內(nèi)。本研究結(jié)果顯示，當(dāng)發(fā)酵液活菌量＜108CFU/mL時(shí)，由于系統(tǒng)誤差造成的數(shù)據(jù)偏差相對(duì)于測(cè)定結(jié)果已經(jīng)非常顯著，因而線性關(guān)系弱化，此方法不適用。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果顯示，新鮮發(fā)酵液中地衣芽孢桿菌活菌量＞108CFU/mL時(shí)，使用MTT-分光光度法測(cè)定發(fā)酵液中活菌總數(shù)具有線性穩(wěn)定、可重復(fù)性好、試驗(yàn)周期短的特點(diǎn)，而且不受不同培養(yǎng)基、菌體代謝產(chǎn)物、死菌體以及其他物質(zhì)的干擾。結(jié)果表明，MTT-分光光度法可作為科研、生產(chǎn)中快速測(cè)得活菌量的方法。