李丁艾,孫兆泉,尚軍,3*

(1.青海師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,西寧 810008; 2.青海師范大學(xué),青藏高原藥用動植物資源重點實驗室,西寧 810008; 3.青海師范大學(xué),高原科學(xué)與可持續(xù)發(fā)展研究院,西寧 810008)

在宏觀層面,數(shù)據(jù)挖掘是從龐大、復(fù)雜的隨機不完全數(shù)據(jù)中提取隱形、有用、可信信息的有力手段[1-3]。中國古代醫(yī)藥典籍蘊含著大量古人用藥隱形而又非常有效實用的用藥規(guī)律,揭示古籍中藥處方配伍規(guī)律,明確用藥辯證關(guān)系,有利于指導(dǎo)現(xiàn)代中藥臨床用藥和中藥新藥配方研究[4-6]。在微觀層面,利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探究藥物疾病之中的靶點信息蛋白、預(yù)測所具功能和作用通路,可以對藥物治療疾病的作用機制更加深入認(rèn)知,這也與中藥多通路多靶點發(fā)揮作用理念相符合[7-8]。例如,Ma等[9]利用數(shù)據(jù)挖掘確定了3個治療直腸癌氣血兩虛癥核心處方,進一步利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子接技術(shù)對核心處方的潛在機制進行探究,發(fā)現(xiàn)治療過程中涉及的最重要途徑是有絲分裂原-活化蛋白激酶(MAPK)級聯(lián)反應(yīng)、白細胞介素-17、腫瘤壞死因子(TNF)和血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)途徑。李澤宇等[10]通過數(shù)據(jù)挖掘技術(shù)發(fā)現(xiàn)茯苓、黃柏、牛膝等八種中藥常用于治療痛風(fēng),且這八種中藥在治療痛風(fēng)過程中涉及癌癥通路、糖尿病并發(fā)癥中的高級糖基化終末產(chǎn)物-受體(advanced glycation end products-receptor for AGE,AGE-RAGE)信號通路等,這些技術(shù)的結(jié)合使用有利于闡述中藥和疾病的關(guān)系,從而加深對中藥機制的理解。

中藥川貝母(FritillariaecirrhosaeBulbus)為百合科植物川貝母(FritillariacirrhosaD.Don)、暗紫貝母(FritillariaunibracteataHsiao et K.C.Hsia)、甘肅貝母(FritillariaprzewalskiiMaxim.)或梭砂貝母(FritillariadelavayiFranch.) 的干燥鱗莖,味苦、甘,性微寒;歸肺、心經(jīng);主治清熱潤肺,化痰止咳;用于肺熱燥咳,干咳少痰,陰虛勞嗽,咯痰帶血[11]?，F(xiàn)代藥理學(xué)實驗證明貝母生物堿具有鎮(zhèn)咳抗炎、降壓、增強心肌收縮力、抗腫瘤、抗菌作用[12-13]。采用數(shù)據(jù)挖掘的方法對貝母治療肺系病方劑進行分析,研究其配伍應(yīng)用規(guī)律,進一步利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析,分析核心藥對治療支氣管哮喘的作用機理,為貝母治療肺系疾病方劑中的應(yīng)用規(guī)律研究提供依據(jù),為其臨床應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 方劑篩選

以方劑組成含“貝母”,主治或功效含“咳嗽”“肺熱”“肺咳”“咳”“喘”“哮”“肺脹”“肺絡(luò)張”“肺痿”“肺癰”“肺癆”“肺癌”“肺水”“肺厥”“肺衰”“塵肺”“懸飲”“干肋痛”等為檢索條件[14],運用《中醫(yī)資源網(wǎng)》中醫(yī)藥數(shù)據(jù)庫方劑數(shù)據(jù)庫檢索模塊收集含貝母的處方。去重,篩選出含貝母處方420個,涉及中藥463味。

1.2 中藥名稱規(guī)范與錄入

參考2020版《中國藥典》(一部)及《中華本草》對處方涉及中藥名稱進行規(guī)范,藥材相同但產(chǎn)地不同的藥物名稱統(tǒng)一,如“貝母”統(tǒng)一為“川貝母”;“土貝母”“象貝母”統(tǒng)一為“浙貝母”;“牛黃”“西牛黃”統(tǒng)一為“牛黃”。炮制后藥材性味歸經(jīng)及主治功效有較大變化的保留炮制名稱,如“生地黃” 甘,寒,歸心、肝、腎經(jīng),清熱涼血,養(yǎng)陰,生津;“熟地黃” 甘,微溫,歸肝、腎經(jīng),滋陰補血,益精填髓。

1.3 用藥頻次與關(guān)聯(lián)規(guī)則

1.3.1 數(shù)據(jù)篩選

建立“處方-組分”Excel 2010數(shù)據(jù)庫,運用數(shù)據(jù)透視表構(gòu)建藥物頻次矩陣,篩選使用頻次≥30的藥物為高頻藥物。

1.3.2 高頻藥物藥性分析

以2020版《中國藥典》和《中華本草》記載藥物性味歸經(jīng),構(gòu)建高頻藥物性、味、歸經(jīng)Excel數(shù)據(jù)庫。錄入原則,如單味藥具有多個藥味,則全部統(tǒng)計錄入,如“川貝母”味甘、苦,則“甘”和“苦”均作統(tǒng)計;單味藥具有多個歸經(jīng),全部統(tǒng)計錄入,如“川貝母”歸肺、心經(jīng),則“肺經(jīng)”和“心經(jīng)”均作統(tǒng)計;藥物四氣歸類將“微寒”歸屬為“涼”,“微熱” 歸屬為“溫”。并構(gòu)建頻次矩陣。

1.3.3 高頻藥物功效分類分析

以2020版《中國藥典》《中華本草》及《中藥學(xué)》記載中藥主治功效,構(gòu)建高頻藥物功效Excel數(shù)據(jù)庫,檢索錄入藥物二級功效,如“羌活”為“解表藥”類項下“辛溫解表藥”。

1.3.4 高頻藥物關(guān)聯(lián)規(guī)則

對使用頻次≥30的高頻次藥物,經(jīng)SPSS Modeler 14.1進行關(guān)聯(lián)規(guī)則分析,構(gòu)建藥物之間關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò),并利用Apriori 建模進一步挖掘出藥物之間的配伍關(guān)系,設(shè)置最低條件支持度為10%,最小規(guī)則置信度為80%,最大前項數(shù)為5,增益及提升度不小于1為關(guān)聯(lián)條件篩選核心藥物組合。

提升度=置信度(前項/后項)/后項總概率

1.4 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)

支氣管哮喘(bronchial asthma,BA)為一個典型肺系病,以核心藥對治療BA作為例子進行研究。

1.4.1 核心藥對活性成分篩選及靶點預(yù)測

利用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫及分析平臺TCMSP[15](https://tcmspw.com/)檢索核心藥對的所有化學(xué)成分,基于藥代動力學(xué)(absorption,distribution,metabolism,excretion,ADME)參數(shù)選取有效活性成分 (篩選條件為口服生物利用度≥30%,類藥性≥0.18)及相應(yīng)靶點,采用 UniProt(https://sparql.uniprot.org/)數(shù)據(jù)庫矯正靶點的基因名。

1.4.2 支氣管哮喘的靶點篩選

基于GeneCards數(shù)據(jù)庫 (https:/www.genecards.org/) 數(shù)據(jù)庫,將“bronchial asthma”作為檢索詞以預(yù)測目前已知的與BA相關(guān)的潛在靶點。

1.4.3 PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

利用Venny2.1.0 (https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)繪制藥物及疾病靶點韋恩圖,獲取“藥物-疾病”的交集靶點,將交集靶點導(dǎo)入 STRING 數(shù)據(jù)庫[16](http://string-db.org/cgi/input.pl),選擇“Multiple Proteins”,設(shè)定基因來源為“homo sapiens”,構(gòu)建蛋白互作網(wǎng)絡(luò)(protein-protein interaction network,PPI),下載以string_interations命名的.tsv文檔,再將文檔數(shù)據(jù)導(dǎo)入數(shù)據(jù)可視化處理軟件Cytoscape 3.9.1,借助CytoNCA 插件計算出介數(shù)中心度(degree centrality),根據(jù)度值篩選關(guān)鍵靶點。

1.4.4 “核心藥物-成分-靶點-疾病通路”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

利用數(shù)據(jù)可視化處理軟件 Cytoscape3.9.1構(gòu)建“藥物-成分-靶點-疾病通路”網(wǎng)絡(luò)圖。節(jié)點(node)代表藥物成分、靶點、藥物及疾病名稱,邊(edge)代表各中藥與活性成分、活性成分與靶點、疾病與靶點的相互作用關(guān)系,并應(yīng)用 Cytoscape3.9.1 軟件中的 CytoNCA插件獲取位居前 5 的關(guān)鍵成分,用于后續(xù)驗證。

1.4.5 GO與KEGG通路富集分析

將關(guān)鍵靶點導(dǎo)入 DAVID 數(shù)據(jù)庫(https://david.ncifcrf.gov/)中,閾值設(shè)為P<0.05,進行GO功能富集和 KEGG 通路富集分析,探究BA核心靶點在生物過程(biological process,BP)、分子功能(molecular function,MF)和細胞組分(cellular component,CC)方面涉及的功能及通路并借助微生信網(wǎng)站(http://www.bioinformatics.com.cn/)對結(jié)果進行可視化繪圖。

1.5 分子對接驗證

從PDB(https://www.rcsb.org/)數(shù)據(jù)庫下載靶點的 PDB 文件,利用 PYMOL 對受體蛋白進行去水、去配體等操作,從 PubChem(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)數(shù)據(jù)庫下載活性成分 SDF 文件,運用openbabel 軟件轉(zhuǎn)換為 Mol2 格式文件,利用 AutoDock-Tools-1.5.6 對受體蛋白及配體進行加氫、平衡電荷等操作,保存為pdbqt 格式文件,并運用AutoDock-Tools-1.5.6 對處理好的活性化合物與靶蛋白進行對接及能量計算,利用Autodock Vina 1.1.2 軟件對處理后的化合物與靶標(biāo)進行對接,PyMOL 軟件用于可視化關(guān)鍵化合物和蛋白質(zhì)靶標(biāo)對接結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 數(shù)據(jù)挖掘結(jié)果

2.1.1 用藥頻次分析

將篩選出的貝母處方中的全部藥物進行頻次分析,結(jié)果顯示總計463味中藥,累計頻次為5 033次,其中頻次≥30的藥物有35味,累計頻次2 944次,見表1。其中含“川貝母”藥方411個占97.9%,說明川貝母較浙貝母在治療肺系疾病方面更具有顯著療效,對其用藥規(guī)律的深度挖掘,更具有開發(fā)前景和意義。

表1 含貝母肺系病處方中高頻次單味中藥(頻次≥30)

2.1.2 含貝母肺系疾病中藥組方核心藥物組合分析

基于關(guān)聯(lián)規(guī)則分析,構(gòu)建高頻藥物網(wǎng)絡(luò)關(guān)聯(lián)圖及Apriori模型,設(shè)置支持度為10%,最小置信度80%,最大前項數(shù)5為條件挖掘出含川貝母治療肺系相關(guān)疾病中藥方劑中潛在的藥物組合,共得到核心藥物組合70組,其關(guān)聯(lián)規(guī)則網(wǎng)絡(luò)可視化展示如圖1所示。其中增益及提升度均大于1,具有藥物組合統(tǒng)計學(xué)意義的藥物組合43對,如表2～表4所示。

圖1 含川貝母治療肺系疾病高頻藥物(頻次≥30)關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)化展示

表2 含貝母肺系疾病中藥處方高頻核心二聯(lián)藥物組合

表3 含貝母肺系疾病中藥處方高頻核心三聯(lián)藥物組合

表4 含貝母肺系疾病中藥處方高頻核心四聯(lián)藥物組合

2.1.3 含貝母肺系疾病中藥組方核心藥物組合聚類分析

經(jīng)SPSS Statistics 25統(tǒng)計軟件對高頻藥物(頻次≥30)進行系統(tǒng)聚類分析,數(shù)據(jù)錄入格式采用如下方法,即用“1”和“0”表示某味藥在某一藥方中的存在與否,編制Excel表格。結(jié)果當(dāng)截距為19.0時,共得到8類,如圖2所示,具體分類見表5。

圖2 含貝母肺系疾病核心藥對聚類分析樹狀圖

表5 含川貝母治療肺系疾病高頻藥物系統(tǒng)聚類分析

表6 活性成分與對應(yīng)靶點分子對接結(jié)果

2.2 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)果

2.2.1 核心藥物及BA相關(guān)靶點的篩選

將經(jīng)2.1.2節(jié)分析可得的核心藥對“川貝母-人參”導(dǎo)入到TCMSP數(shù)據(jù)庫進行活性成分和成分靶點篩選,去重,獲得34個活性成分,101個成分靶點。將“bronchial asthma”作為檢索詞在GeneCards數(shù)據(jù)庫獲得2 487個疾病靶點。

2.2.2 Hub靶點篩選及PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將藥物的成分靶點和疾病靶點導(dǎo)入到Venny2.1.0在線平臺,獲得藥物與疾病交集靶點共70個,并制作韋恩圖如圖3所示。再將交集靶點導(dǎo)入到String 平臺,下載蛋白質(zhì)互作分析(protein protein interaction,PPI)的TSV數(shù)據(jù)文件,導(dǎo)入到 Cytoscape3.9.1 軟件中獲得蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖,如圖4所示。可知共有70個節(jié)點,527條邊。借助CytoNCA 插件計算出度值,根據(jù)度值篩選Hub靶點。通過構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò),可知排名前5的Hub靶點包括“AKT1”“PTGS2”“IL1B”“JUN”“PPARG”。其中PTGS2和JUN為兩味藥材所共有的靶點。AKT1基因編碼的是絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶,可通過磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)依賴的機制被胞外信號激活,為PI3K信號通路中下游最重要因子,對于肺部疾病具有調(diào)節(jié)纖維化的作用。Lu等[17]證明了 PI3K/Akt 通過上調(diào)細胞生長和膠原蛋白表達在博萊霉素誘導(dǎo)的人肺成纖維細胞的纖維化中起重要作用。經(jīng)研究PI3K/Akt/mTOR 通路被認(rèn)為與氣道炎癥密切相關(guān),并受各種上游蛋白的調(diào)節(jié)[18],當(dāng)哮喘小鼠中支氣管上皮細胞特異性Brg1敲除后,哮喘嚴(yán)重程度得到改善,PI3K/Akt/mTOR通路被激活。通過比較哮喘模型組大鼠、治療組大鼠和陽性組大鼠中PI3K/Akt信號通路相關(guān)蛋白表達[19],發(fā)現(xiàn)模型組PI3K、Akt蛋白表達顯著增加,而治療組和陽性組中PI3K、Akt蛋白表達明顯下降,故PI3K/Akt通路可以看作治療支氣管哮喘的重要通路,AKT1也為其重要靶點之一。PTGS2是編碼前列腺素內(nèi)過氧化物合酶(PTGS)同工酶之一,也叫做環(huán)氧合酶2(COX-2)[20],表達部位包括大部分組織間的滑膜細胞,正在排卵的濾泡,在絕大多數(shù)被生長因子、細胞因子、佛波酯或激素刺激的組織,抑制糖皮質(zhì)激素,作為“炎癥反應(yīng)基因”,有炎癥時會產(chǎn)生前列腺素,調(diào)控有絲分裂,參與細胞生長,在調(diào)節(jié)排卵時起信號作用。經(jīng)研究可知過敏性哮喘可使氣管壁內(nèi)平滑肌肥大,致敏肥大細胞β-己糖氨酸酶的釋放和環(huán)氧合酶2(COX-2)介導(dǎo)的前列腺素D-2(PGD-2)和前列腺素F-2α(PgF-2α)的產(chǎn)生[21]。IL1B(白介素1β)為促炎性因子,也是公認(rèn)的中性粒細胞增多的誘因,可能導(dǎo)致明顯的中性粒細胞肺部炎癥。Kim等[22]發(fā)現(xiàn)哮喘患者中性粒細胞增多、激素抵抗和疾病嚴(yán)重程度與NLRP3和IL-1β表達增加相關(guān)。病毒誘導(dǎo)的哮喘加重會引起Th1型中性粒細胞增多和Th2型炎癥,這也與白介素1β的分泌有關(guān)[23]。JUN編碼轉(zhuǎn)錄因子激活蛋白1(activator protein 1,AP-1),其家族成員包括c-Jun、JunB、JunD、Fra-1、Fra-2和c-Fos,是TGF-β信號通路的下游分子[24]。Patil等[25]發(fā)現(xiàn)AP-1可能是激素在哮喘等慢性炎癥性肺部疾病中作用的重要分子機制,并對肺部炎癥性疾病的治療有一定的幫助。已知嗜酸性粒細胞在哮喘中起著核心作用,Kankaanranta等[26]發(fā)現(xiàn)TNF-α可抑制嗜酸性粒細胞的凋亡,AP-1可增強腫瘤壞死因子-α的抗凋亡作用。PPARG編碼過氧化物酶體增殖物激活受體 γ(PPAR-γ),是一種參與多種細胞過程的配體激活轉(zhuǎn)錄因子,參與多種細胞過程,和氧化應(yīng)激基因的單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism,SNP)與哮喘風(fēng)險相關(guān)[27]。呼吸道上皮細胞(airway epithelial cells,AECs)對進入呼吸系統(tǒng)的空氣中的刺激物進行炎癥反應(yīng),Lakshmi等[28]發(fā)現(xiàn),PPARG直接與在黏蛋白5AC中發(fā)現(xiàn)的PPAR反應(yīng)元件結(jié)合并抑制基因表達。同樣,PPARG調(diào)節(jié)原代人支氣管上皮細胞中的黏蛋白和炎癥因子,因此AEC-PPARg有作為治療哮喘藥物靶點的潛力。由上可知,這些關(guān)鍵靶點可作為“川貝母-人參”治療支氣管哮喘的重要指標(biāo)。

圖3 藥物活性成分靶點與疾病靶點韋恩圖

圓代表靶點,顏色越深,圓越大表示與其他靶點互作關(guān)系越強

2.2.3 “核心藥物-成分-靶點-疾病”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建結(jié)果

將核心中藥各活性成分及獲取的核心靶點,導(dǎo)入 WPS Excel 表格中建立相互對應(yīng)關(guān)系,運用 Cytoscape 3.9.1 軟件構(gòu)建“核心藥物-成分-靶點-疾病”網(wǎng)絡(luò)圖,如圖5所示。圖5中共有226 個節(jié)點及807 條邊,其中包括28個藥物活性成分,167個靶點和30條P排名前列的信號通路。并用CytoNCA 插件計算出DC值,對該網(wǎng)絡(luò)進行拓撲分析。通過構(gòu)建“核心藥物-成分-靶點-疾病”網(wǎng)絡(luò),根據(jù)度值排列,結(jié)果顯示排名前5的成分為“beta-sitosterol”“kaempferol”“Stigmasterol”“suchilactone”“Fumarine”。

2.2.4 GO、KEGG富集分析

將70個核心靶點導(dǎo)入到DAVID數(shù)據(jù)庫進行GO和KEGG富集分析,選擇選擇“Homo sapiens”,以P<0.05 為篩選條件,得到GO條目共385條,將P由小到大進行排列,分別對BP、CC、MF的前10進行可視化分析,如圖6所示。由GO功能分析可知,其中BP有277條,主要參與對脂多糖、藥物、有機環(huán)狀化合物、異種刺激的反應(yīng),并與一氧化氮生物合成正調(diào)節(jié)、凋亡過程正調(diào)節(jié)等生物學(xué)過程;CC有42條,主要細胞溶膠、突觸前膜、大分子組分復(fù)合膜、膜筏、核質(zhì)等細胞組分;MF有66條,主要與酶結(jié)合蛋白、同源二聚化活性、RNA聚合酶II-轉(zhuǎn)錄因子活性、配體激活的序列特異性DNA結(jié)合等分子功能。KEGG通路富集分析可知條目共89條,對排名前10 的通路進行可視化分析,如圖7所示。發(fā)現(xiàn)主要參與的通路包括脂質(zhì)和動脈粥樣硬化、流體剪切應(yīng)力和動脈粥樣硬化、弓形蟲病、糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號通路、癌癥通路、腫瘤壞死因子信號通路、乙型肝炎、化學(xué)致癌-受體激活、IL-17信號通路等,說明篩選出的70個靶點蛋白可能通過這些通路發(fā)揮藥理活性,改善疾病病理變化。這也符合中藥通過多途徑、多靶點發(fā)揮治療作用的機制[29]。

選用每個模塊P值最小的前10個條目,其值越大,顏色越偏向紅色,反之則偏向藍色;條帶的長短表示富集數(shù)

此氣泡圖中其值越大,顏色越偏向紅色,反之則偏向綠色;點的大小表示富集數(shù)

2.3 活性成分與關(guān)鍵靶點的分子對接

利用Autodock Vina 1.1.2對2.2.2節(jié)獲取的Hub前五靶點和與2.2.3節(jié)獲取的排名前5的活性成分進行對接,結(jié)果見表 6。利用 PyMOL 軟件對靶點蛋白與成分對接的最佳構(gòu)象進行可視化分析,直觀展示其構(gòu)象關(guān)系,結(jié)果見圖8。分子對接結(jié)合能小于-5.0 kcal/mol則表明結(jié)合活性較強,且結(jié)合能越小,可知高頻活性藥物中Fumarine與BA疾病靶點的PTGS2最為緊密。

3 結(jié)論

肺系疾病是一種常見和多發(fā)疾病,包括肺臟主氣、司呼吸、宣肺肅降等功能異常引發(fā)的肺臟疾病,如咳嗽、喘證、哮病、肺癰、肺痿及相關(guān)疾病、如感受外邪類引發(fā)的感冒、風(fēng)溫、秋燥、肺風(fēng)、勞風(fēng)等和鼻咽類疾病鼻鼽、鼻淵、喉喑、喉痹等[30]。川貝母在止咳祛痰、平喘、抗菌和抗腫瘤等方面具有較好的療效,其鎮(zhèn)靜、缺氧狀態(tài)下增強人體耐力的作用,對于痰多咳嗽的哮喘病人有益,其消炎抗菌作用能夠有效的改善呼吸道感染[31]。

通過數(shù)據(jù)挖掘技術(shù)分析可知,川貝母常與苦、甘、辛和微寒的中藥材配伍,在符合肺脾同治[32]的中醫(yī)理念基礎(chǔ)上,用于治療不同病癥的肺系疾病,如《退思集類方歌注》一書中記載的紫菀湯,其藥物組成為甘草、桔梗、紫菀、川貝母、杏仁;紫菀降氣、貝母潤肺、杏仁消痰、合甘、桔散風(fēng)泄熱。經(jīng)關(guān)聯(lián)規(guī)則和聚類分析得到含川貝母的核心藥對、藥組組合,為臨床肺系疾病的診療與新藥研究提供了理論支撐,開拓新處方思路,同時為后續(xù)劑量關(guān)系的研究奠定基礎(chǔ)。

利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測核心藥對治療支氣管哮喘的核心靶點和信號通路可知,“AKT1”“PTGS2”“IL1B”“JUN”“PPARG”均可作為治療支氣管哮喘的關(guān)鍵靶點,尤其Fumarine 對PTGS2結(jié)合緊密,為未來研究支氣管哮喘發(fā)作所涉及的信號通路及因子變化提供理論基礎(chǔ),也為進一步開展臨床及基礎(chǔ)研究,即與分子生物學(xué)、代謝組學(xué)等學(xué)科的融合起到指導(dǎo)作用。